抗肌萎缩融合蛋白mDp116.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010002267.X (22)申请日 2020.01.02 (71)申请人 北京辉润合众生物科技有限公司 地址 101121 北京市通州区砖厂北里140号 楼3层1311 (72)发明人 宋亚锋 (74)专利代理机构 北京钲霖知识产权代理有限 公司 11722 代理人 李志新冯志云 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/861(2006.01) A61K 38/17(2006.01) A61。

2、P 21/00(2006.01) A61P 25/00(2006.01) (54)发明名称 一种抗肌萎缩融合蛋白mDp116 (57)摘要 本公开是关于一种抗肌萎缩融合蛋白 mDp116， 编码融合蛋白的核酸， 包含核酸的载体、 细胞， 上述融合蛋白、 核酸、 载体、 细胞在制备治 疗肌萎缩的药物的用途， 以及包含上述核酸、 载 体或细胞的药物组合物。 本发明采用生物信息学 和蛋白组学模型重建Dp116， 保持了螺旋之间的 相互作用和固有的稳定的蛋白结构； 改变抗肌肉 萎缩蛋白的内在的结构， 从而降低其与T细胞表 面第二类组织相容性复合物(MHCII)的结合力， 使T细胞无法激发相应的B细胞进。

3、一步分裂分化 产生对应于外源蛋白的抗体来达到抑制免疫反 应的目的,通过改造抗肌肉萎缩蛋白的免疫原性 将大大提高其稳定性； 设计的Dp116基因疗法不 仅可以提高肌肉的功能， 治疗杜氏型肌营养不良 症， 还可以改善DMD患者的认知功能。 权利要求书1页 说明书9页 序列表8页 附图3页 CN 111057157 A 2020.04.24 CN 111057157 A 1.一种融合蛋白， 其特征在于： 所述融合蛋白包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。 2.根据权利要求1所述的融合蛋白， 其中： 所述融合蛋白进一步包含如SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:。

4、4所示的氨基酸序列。 3.根据权利要求1所述的融合蛋白， 其中： 所述融合蛋白的氨基酸序列按照从N端到C端 的顺序， 依次包含SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。 4.根据权利要求1所述的融合蛋白， 其中： 所述融合蛋白包含SEQ ID NO:5所示的氨基 酸序列。 5.一种核酸分子， 其编码如权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白。 6.一种核酸载体， 其包含如权利要求5所述的核酸分子。 7.根据权利要求6所述的核酸载体， 其中： 所述核酸载体为腺病毒载体。 8.一种细胞， 其包含如权利要求5所述的核酸分子， 和/或表达有权利要求。

5、1-4中任一项 所述的融合蛋白。 9.如权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白、 权利要求5所述的核酸分子、 权利要求6所 述的核酸载体、 权利要求8所述的细胞用于制备治疗杜氏型肌营养不良症和/或改善患者认 知功能的药物的用途。 10.一种药物组合物， 其包含如权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白、 和/或权利要求 5所述的核酸分子、 和/或权利要求6所述的核酸载体、 和/或权利要求8所述的细胞， 以及药 学上可接受的载体或辅料。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111057157 A 2 一种抗肌萎缩融合蛋白mDp116 技术领域 0001 本公开涉及融合蛋白技术领域， 尤其涉及一种抗肌萎缩。

6、融合蛋白mDp116。 背景技术 0002 杜氏型肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是最常见的致命性儿 童基因疾病之一， DMD疾病源于人类最大的基因(2.3百万碱基， 79外显子)的变异1,2， 其 中大多数突变是散发性多个外显子移码缺失(frameshifting deletions)， 导致DMD抗肌肉 萎缩蛋白(抗肌肉萎缩相关蛋白)缺失； 或者外显子缺失发生在框内(in frame deletion) 导致短片的抗肌肉萎缩蛋白3,4。 抗肌萎缩蛋白在细胞骨架肌动蛋白和跨膜肌营养不良 蛋白糖蛋白复合物(DGC)之间形成重要的机械连接， 这些蛋白。

7、质共同保护肌纤维膜免受肌 肉收缩期间产生的应力5,6。 在缺乏抗肌肉萎缩蛋白的情况下， DGC不稳定， 肌纤维膜变得 非常脆弱， 导致肌纤维坏死， 炎性细胞浸润， 肌纤维再生以及最终肌纤维被结缔组织取代并 伴有进行性肌硬化和收缩性丧失， 肌肉随着年龄的增长会逐渐退化消失， 包括呼吸肌， 常因 呼吸肌的退化导致呼吸功能的减退， 产生肺部并发症或呼吸衰竭而导致死亡， 平均寿命大 约20-30岁7,8。 虽然使用糖皮质激素， ACE抑制剂和机械通气支持联合治疗可暂时减缓进 展速度， 但最终的临床过程是不可阻挡的， 疾病的最后阶段在护理等方面支付巨额的费用 9。 0003 近年来， 由于DMD的病理生。

8、理复杂性和广泛性， 促使针对DMD分子和细胞靶标的研 究日益深入。 其中包括干扰NFkappaB信号传导10,11， 外显子跳跃和终止密码子抑制 12， 以及基因编辑DMD基因13-15， 但这些方法只能有限缓解病理生理发展速度或针对 有限数量的具有特定突变的患者。 只有解决原发病因， 才有可能 “结束杜氏” 。 基因治疗是指 将外源正常基因导入靶细胞， 以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病， 以达到治疗目 的。 也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人适当的受体细胞中， 使外源基因制 造的产物能治疗某种疾病。 DMD的基因治疗提供持久的治愈性治疗的可能性， 早在20年前， Clemen。

9、s16等人利用腺病毒为载体和肌肉注射引入全长的抗肌肉萎缩蛋白基因(12kb)， 但由于复合载体衣壳产生强烈的免疫应答和有限的抗肌肉萎缩蛋白分布， 这种方法已被放 弃。 之后研发衍生重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated viral,rAAVs)的多种 载体， 由于其种类多样、 免疫原低、 宿主细胞范围广、 扩散能力强、 体内表达基因时间长等特 点， rAAVs被广泛应用于基因研究和基因治疗载体之一17-20， 科学家先后利用衍生的腺 病毒为载体生成 “迷你抗肌肉萎缩蛋白” 在小鼠21-24和狗25,26实验结果显示DMD的病 理、 生理学和肌肉功能方面不同程度。

10、的改善， 然而， 使用该技术的I期临床试验发现了在具 有DMD基因缺失的研究受试者的注射肌肉中靶向的细胞介导的免疫应答的证据， 其结果导 致迷你抗肌萎缩蛋白在短时间内消失27， 同样， 在使用相同人转基因进行全身性基因转 移的预临床前研究中， 抗肌营养不良蛋白缺陷型狗(GRMD)引起临床上严重的广泛性肌炎， 对迷你抗肌萎缩蛋白的免疫反应， 加剧了DMD病情的恶化25。 其它DMD狗模型和非人类灵 长类动物的研究揭示了诱导的外周对载体编码抗原的耐受性的局限性， 尤其是在DMD肌肉 说明书 1/9 页 3 CN 111057157 A 3 中， 迷你抗肌肉萎缩蛋白表达有助于改善DMD恶化进程， 但。

11、是自身的免疫系统视为 “异己” ， 因此， 解决迷你抗肌肉萎缩蛋白的免疫应答难题是基因治疗DMD未来试验的设计首要考虑 的问题28。 0004 尽管绝大部分的DMD体内不表达抗肌营养不良蛋白,它的同源蛋白， Utrophin29- 31抗肌肉萎缩相关蛋白结构与抗肌肉萎缩蛋白比约50相同， 正常仅在年幼的儿童的肌 肉中高度表达， 随着年龄增大抗肌肉萎缩相关蛋白表达逐渐减少， 在成人仅在一些部位有 少量的表达， 如肌肉神经接点等。 Tinsley等首先在mdx小鼠动物模型上证明， 抗肌肉萎缩相 关蛋白可代偿抗肌肉萎缩蛋白的功能， 明显延缓肌营养不良病程的进展。 上调的具体手段 多种多样： 直接导入。

12、完整或经剪裁的抗肌肉萎缩相关蛋白； 病毒载体导入经剪裁的抗肌肉 萎缩相关蛋白； 激活抗肌肉萎缩相关蛋白的转录； 在转录后稳定其mRNA， 增加蛋白翻译等。 其中筛选出的一些小分子已准备进入临床试验阶段。 英国VASTox公司用于上调抗肌肉萎缩 相关蛋白的小分子药物VOX C1100在2007年就取得欧洲药监局的孤药认证， 并准备在2008 年进入临床试验阶段， 但并未真正实施。 2010年美国BioMarin公司的BMN195开始健康志愿 者的I期临床试验， 但试验结果显示药物口服吸收不理想， 无法达到治疗所需药物浓度， 从 而终止了进一步试验。 虽然初期临床试验结果不理想， 但上调抗肌肉萎缩。

13、相关蛋白仍是治 疗DMD/BMD的一条重要途径， 筛选合适药物成为关键。 与与迷你抗肌肉萎缩蛋白基因治疗方 法比较， 这一治疗策略的优势在于利用体内已存在的蛋白， 避免了针对新蛋白的免疫反应， 但缺点是上调的迷你抗肌肉萎缩相关蛋白表达量太低， 不足于募集跨膜肌营养不良蛋白糖 蛋白复合物(DGC)， 从而大大降低的效果。 利用衍生的腺病毒为载体生成 “迷你抗肌肉萎缩 相关蛋白” 被科学家研究证实迷你抗肌肉萎缩相关蛋白能够替代抗肌萎缩蛋白的作用， 恢 复杜氏肌营养不良患者的肌肉功能32-34， 2019年10月Song等人利用AVV9携带短链的迷 你抗肌肉萎缩相关蛋白基因， 迷你抗肌肉萎缩相关蛋白。

14、的表达在DMD小鼠和狗模型上成功 提高了肌肉的功能和大大降低了CK,而迷你抗肌肉萎缩蛋白引起了强烈的免疫应答。 0005 综上所述， 现有文献中设计的迷你抗肌肉萎缩相关蛋白/抗肌萎缩蛋白的大多是 简单的螺旋拼接， 螺旋之间的相互作用丧失， 导致蛋白结构发生改变， 治疗效果不理想。 此 外， 目前使用基因治疗人工导入剪切后的短抗肌萎缩蛋白可以较好的起到对此肌肉病的治 疗效果， 然而遇到的一个很大的问题就是无法去除抗肌萎缩蛋白的免疫原性。 因此大大降 低了抗肌萎缩蛋白的未来应用潜力。 因此， 仍需要一种具有保留蛋白结构、 降低免疫原性的 抗肌萎缩蛋白。 0006 参考文献： 0007 1.Hoff。

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34、 0041 为解决现有技术中存在的上述问题， 本发明采用生物信息学和蛋白组学模型重建 Dp116， 提供了一种抗肌萎缩融合蛋白mDp116， 所述融合蛋白包含如SEQ ID NO:1所示的氨 基酸序列。 0042 优选地， 所述融合蛋白进一步包含如SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所 示的氨基酸序列。 0043 优选地， 所述融合蛋白的氨基酸序列按照从N端到C端的顺序， 依次包含SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。 0044 优选地， 所述融合蛋白包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。 。

35、0045 另一方面， 本发明还提供了一种核酸分子， 其编码所述的融合蛋白。 所述核酸分子 可以是DNA也可以是RNA。 所述核酸分子的核苷酸序列可以通过所述融合蛋白的氨基酸序列 经常规的生物信息学运算得到， 也可进一步根据宿主细胞的种类进行密码子优化。 0046 另一方面， 本发明还提供了一种核酸载体， 其包含所述的核酸分子。 0047 优选地， 所述核酸载体为腺病毒载体。 0048 另一方面， 本发明还提供了一种细胞， 其包含所述的核酸分子， 和/或表达有所述 的融合蛋白。 所述细胞可以是原核细胞， 例如大肠杆菌， 也可以是真核细胞， 例如酵母、 Hela、 HEK293T。 所述细胞可以是。

36、用于扩增所述核酸分子的细胞， 也可以是用于产生所述融 合蛋白的细胞。 0049 另一方面， 本发明还提供了所述的融合蛋白、 所述的核酸分子、 所述的载体、 所述 的细胞用于制备治疗杜氏型肌营养不良症和/或改善患者认知功能的药物的用途。 0050 另一方面， 本发明还提供了一种药物组合物， 其包含所述的融合蛋白、 和/或所述 的核酸分子、 和/或所述的核酸载体、 和/或所述的细胞， 以及药学上可接受的载体或辅料。 0051 本发明基于体内存在的mDp116抗肌萎缩的亚型， 结合抗肌萎缩的功能区的优化设 计的重组短链的抗肌萎缩蛋白， 完全不同于之前的设计， 在结构和功能上都大大提高了稳 定性， 同。

37、时很大程度上规避了体内的免疫应答， 是自身的蛋白， 能显著保护肌细胞的损伤， 提高肌肉的功能， 从而达到治疗DMD的效果， 是一个安全有效的治疗方案。 与现有技术相比， 本发明主要取得了如下的有益效果： 0052 1)采用生物信息学和蛋白组学模型重建Dp116， 保持了螺旋之间的相互作用， 和固 有稳定的蛋白结构； 0053 2)通过体内固有Dp116编码序列， 改变对抗肌肉萎缩蛋白的内在的结构， 从而降低 其与T细胞表面第二类组织相容性复合物(MHCII)的结合力， 使T细胞无法激发相应的B细胞 进一步分裂分化产生对应于外源蛋白的抗体来达到抑制免疫反应的目的,通过改造抗肌肉 说明书 5/9 。

38、页 7 CN 111057157 A 7 萎缩蛋白的免疫原性将大大提高其稳定性。 0054 3)设计的Dp116基因疗法不仅可以提高肌肉的功能， 还可以改善DMD患者的认知功 能。 应当理解的是， 以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的， 并不能限制 本公开。 附图说明 0055 此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分， 示出了符合本发明的实施 例， 并与说明书一起用于解释本发明的原理。 0056 图1为全长的抗肌萎缩蛋白结构及经重组的融合蛋白mDp116的结构图。 0057 图2为抗肌萎缩蛋白H1和H3的氨基酸序列30种连接方式组合示意图。 0058 图3为抗肌萎缩蛋白H。

39、1和H3不同组合的柔性排序。 0059 图4为免疫原性计算结果示意图。 0060 图5为抗肌萎缩蛋白H1和H3不同组合的免疫原性分析结果。 具体实施方式 0061 这里将详细地对示例性实施例进行说明， 其示例表示在附图中。 下面的描述涉及 附图时， 除非另有表示， 不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。 以下示例性实施例 中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。 相反， 它们仅是对所附权 利要求书中所详述的、 本发明的一些方面进行说明性， 不应当理解成限制本发明的范围。 0062 一、 mDp116迷你抗肌肉萎缩蛋白设计方案 0063 抗肌肉萎缩蛋白在结构上可分为四个区。 。

40、它的一端通过N端区与F-肌动蛋白结合， 另一端通过半胱氨酸富含区、 C端区和DGC相互作用与肌膜结合在一起， 在肌组织中起到机 械性的稳定细胞膜的作用。 抗肌萎缩蛋白目前已经发现至少存在有8种同源蛋白， 这些同源 蛋白广泛分布于神经系统和肌肉组织中， 并在其它组织中发现有Dp427、 Dp140、 Dp116等表 达。 虽然目前对这些同源蛋白的功能知之不多， 但这些抗肌萎缩蛋白亚型的存在为我们设 计有功能性， 稳定的迷你抗肌肉萎缩蛋白提供了理论依据。 本发明涉及的mDp140/116迷你 抗肌肉萎缩蛋白包含了Dp140、 Dp116的所有的蛋白序列， 它的另一端连接N端区和H1区(图 1， 其。

41、中ABD对应于SEQ ID NO:2， SP22/24片段对应于SEQ ID NO:3， H4及CH片段对应于SEQ ID NO:4)， 为进一步保持迷你抗肌肉萎缩蛋白了Dp140、 Dp116的蛋白的柔性， 同时保持结构 的稳定性， 对H1/H3片段进行柔性预测， H3远离细胞膜一侧每减少一个氨基酸， 连接H1靠近 肌丝端增加一个氨基酸， 设计以下30种连接方式(图2)， 利用pep-fold3在线预测其柔性， 其 中在30组不同组合中， 设计1尽管柔性最好， 但是N端联系出氨基酸数量太少， 设计10、 11和 15提供了较好的柔性(图3)， 为进一步保证重组蛋白的安全性， 利用IEDB进行。

42、免疫原性的分 析， 其中设计10(如SEQ ID NO:1所示)具有很低的免疫原性(图4和5)， 综上分析， 新的包含 设计10的重组蛋白(即： 本发明提供的的抗肌肉萎缩融合蛋白mDp116)在结构稳定性、 功能 和免疫应答等方面较其他都有着明显的优势， 其重组蛋白mDp116的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。 0064 二、 高滴度rAAV-CMV-mDp116制备的过程和方法 0065 1.人工合成mDp116的基因表达框 说明书 6/9 页 8 CN 111057157 A 8 0066 因为AAV通常能够包装的基因长度在5Kb以内， DMD修复基因采用了功能性截短体。 为了达到。

43、更好的基因表达活性， 我们利用人工合成的方法合成了密码子优化的(3492bp， 1164aa)mDp116的基因表达框， 启动子使用的是高效的CMV启动子， RNA稳定元件采用了具有 WPRE和SV40PA功能的缩小版的CW3L序列(Choi et al.Molecular Brain 2014,7:17)， 该基 因表达框置于pBluescript SK(+)载体的Not1酶切位点之间， 得到pBlue-CMV-mDp116-CW3L 质粒载体。 这样预期获得的rAAV-CMV-mDp116-CW3L实际包装的基因片段长度约为5028bp。 0067 2.构建穿梭载体质粒pFD-Rep-Ca。

44、p9-(ITR-CMV-mDp116-CW3L) 0068 接下来， 通过Not1酶切位点将携带有rAAV-CMV-OptimUTRO基因组的pBlue-CMV- OptimUTRO-CW3L质粒中的OptimUTRO基因表达框置换到穿梭载体质粒pFD-Rep-Cap9-(ITR- GOI)中， 得到pFD-Rep-Cap9-(ITR-CMV-mDp116-CW3L)， 该穿梭质粒携带的是9型AAV的衣壳 蛋白基因Cap9， 所以包装得到的将是9型rAAV。 0069 3.利用新型OneBac系统大规模制备rAAV-CMV-mDp116-CW3L 0070 为了制备大量、 高滴度、 高质量的r。

45、AAV， 我们采用了杆状病毒感染昆虫Sf9细胞制 备rAAV的新型高效OneBac系统(Wu et al.Mol Ther Methods Clin Dev.2018 Jul 4； 10: 38-47.)， 按照Bac-to-Bac系统的操作方法制备重组杆状病毒(BEV)， 首先将重组穿梭质粒 pFD-Rep-Cap9-(ITR-CMV-OptimUTRO-CW3L)转化含有重组杆状病毒基因组的大肠杆菌 DH10Bac进行Tn7转座酶介导的同源重组， 获得含有rAAV-CMV-OptimUTRO-CW3L基因组的重 组杆粒BacmidDNA。 然后， 将Bacmid DNA转染到昆虫Sf9细胞。

46、中， 继续培养直到产生明显的 BEV感染导致的细胞病变现象(CPE)， 收集细胞培养上清液， 其中含有大量BEV/Rep-Cap9- (ITR-CMV-mDp116-CW3L)。 然后用该BEV接毒感染悬浮培养的Sf9细胞， 感染72h后， 收集Sf9 细胞沉淀进行后续rAAV的纯化。 0071 4.rAAV-CMV-mDp116-CW3L的纯化和滴度测定 0072 感染后收集的Sf9细胞以2107cells/mL的密度重新悬浮于裂解液中(50mM Tris and 2mM MgCl2pH 7.5)。 细胞在液氮和37水浴中反复冻融3次， 裂解液中加入50U/mL的 核酸酶(benzonase。

47、， Sigma)和150mM的NaCl在37处理1小时。 然后2,500g离心15min， 上 清液继续用碘克沙醇(iodixanol)密度梯度离心纯化(Strobel et al .Hum .Gene Ther.Methods.2015； 26:147-157)。 主要步骤是： 先将60iodixanol(OptiPrep； Sigma)以 缓冲PBS-MK Buffer(1PBS,1mM MgCl2,2.5mM KCl)液配置15,25,40,and 58浓 度的iodixanol梯度液， 依次加入到39mL Quick-Seal tubes(Beckman Coulter)超速离心 管中。

48、， 然后再加入含有处理后的rAAV的裂解液上清， 用Backman超速离心机的70Ti转子以 63,000rpm在18离心2小时。 离心后， 吸取40梯度相的溶液， 用PBS缓存液透析处理， 再用 Amicon Ultra-15(MWCO,100kDa； Merck Millipore)超滤管离心超滤浓缩得到纯化的rAAV， 分装后再-80度冻存。 纯化后的rAAV病毒用荧光定量PCR进行滴度的测定， 使用iQ SYBR Green Supermix kit(Bio-Rad)， 以10倍稀释的含有CMV序列的质粒做标准曲线， 定量引物 选取CMV启动子特异性定量引物CMV-F和CMV-R， 病。

49、毒的滴度用vector genome(VG)/ml表示 (Grieger et al.Nat.Protoc.2006； 1:1412-1428)。 0073 三、 高滴度rAAV-CMV-mDp116功能评定 0074 1.载体处理和组织储存 0075 我们对新生MDX小鼠(第7天)和野生型(C57小鼠， Jackson实验室)随机盲选并使用 说明书 7/9 页 9 CN 111057157 A 9 Aramis Micro tattoo kit(Ketchum Manufacturing Inc,Canada)标记， 随后进行腹腔注 射(Hamilton,Model 1710SN syrin。

50、ge,Lot No.81008)， 注射剂量为2.5x1012 rAAV-CMV- mDp116。 以此为基础， ， C57BL/10SNJ和MDX幼崽使用32号胰岛素注射器或是注射50-250 L PBS作为阴性对照， 或是注射PBS稀释的rAAV-CMV-mDp116。 注射前， 对每只小鼠进行称重。 给 药后， 所有小鼠回到窝中， 断奶后分离。 在大约8周龄时， MDX和C57BL/10SNJ小鼠根据机构政 策进行CO2安乐死。 取下心脏、 胫骨前肌、 腓肠肌、 股四头肌、 三头肌、 腹部、 膈肌、 颞肌和肝 脏， 用于接下来的研究； 根据研究显示， AAV9在小鼠体内的非靶基因表达低于。