一株暗灰链霉菌及其在蛋白水解酶生产中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010095218.5 (22)申请日 2020.02.14 (83)生物保藏信息 CCTCC NO: M 2019936 2019.11.15 (71)申请人 江南大学 地址 214000 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大 道1800号 (72)发明人 吴敬颜正飞秦琴 (74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211 代理人 林娟 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 9/52(2006.01) C12P 21/06(20。

2、06.01) C12R 1/465(2006.01) (54)发明名称 一株暗灰链霉菌及其在蛋白水解酶生产中 的应用 (57)摘要 本发明公开了一株暗灰链霉菌及其在蛋白 水解酶生产中的应用， 属于微生物技术领域以及 发酵技术领域。 本发明筛选出了一种暗灰链霉菌 T20， 此暗灰链霉菌T20可高效降解蛋白， 将此暗 灰链霉菌T20涂布于含有1g/L大米蛋白的固体培 养基上培养48h， 即可使固体培养基的透明圈直 径高达25mm。 本发明筛选出了一种暗灰链霉菌 T20， 此暗灰链霉菌T20可高产氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的蛋白水解酶， 将此暗灰链霉菌T20 接种至发酵培养基中发酵48h，。

3、 即可使发酵上清 液中的蛋白水解酶酶活高达1500U/mL。 权利要求书1页 说明书7页 序列表4页 附图1页 CN 111088199 A 2020.05.01 CN 111088199 A 1.一种暗灰链霉菌(Streptomyces canus)， 其特征在于， 所述暗灰链霉菌已于2019年 11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCC NO:M 2019936。 2.权利要求1所述暗灰链霉菌在生产蛋白水解酶中的应用。 3.一种生产蛋白水解酶的方法， 其特征在于， 所述方法为先将权利要求1所述的暗灰链 霉菌接种于发酵培养基中进行发酵， 得到含有蛋白水解酶的发酵液， 然。

4、后将发酵液进行提 取， 得到蛋白水解酶。 4.如权利要求3所述的一种生产蛋白水解酶的方法， 其特征在于， 所述蛋白水解酶的氨 基酸序列如SEQ ID No.2所示。 5.如权利要求3或4所述的一种生产蛋白水解酶的方法， 其特征在于， 所述发酵的温度 为2045、 转速为100200rpm、 pH为6.08.0。 6.权利要求1所述暗灰链霉菌在生产蛋白肽中的应用。 7.一种生产蛋白肽的方法， 其特征在于， 所述方法为先将权利要求1所述的暗灰链霉菌 接种于发酵培养基中进行发酵， 得到含有蛋白水解酶的发酵液， 然后将发酵液进行提取， 得 到蛋白水解酶， 再将蛋白水解酶添加至含有蛋白的反应体系中进行酶。

5、解， 得到含有蛋白肽 的酶解液， 最后将酶解液进行提取， 得到蛋白肽； 或者， 所述方法为先将权利要求1所述的暗灰链霉菌接种于发酵培养基中进行发酵， 得 到含有蛋白水解酶的发酵液， 然后将发酵液添加至含有蛋白的反应体系中进行酶解， 得到 含有蛋白肽的酶解液， 最后将酶解液进行提取， 得到蛋白肽； 或者， 所述方法为先将权利要求1所述的暗灰链霉菌接种于发酵培养基中进行发酵， 得 到含有蛋白水解酶的发酵液， 然后将发酵液离心取上清， 得到发酵上清液， 再将发酵上清液 添加至含有蛋白的反应体系中进行酶解， 得到含有蛋白肽的酶解液， 最后将酶解液进行提 取， 得到蛋白肽。 8.如权利要求7所述的一种生。

6、产蛋白肽的方法， 其特征在于， 所述酶解的温度为3040 、 转速为150200rpm、 pH为78。 9.如权利要求7或8所述的一种生产蛋白肽的方法， 其特征在于， 所述蛋白为大米蛋白； 所述蛋白肽为大米肽。 10.如权利要求7-9任一所述的一种生产蛋白肽的方法， 其特征在于， 所述大米肽的分 子量小于1000Da。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111088199 A 2 一株暗灰链霉菌及其在蛋白水解酶生产中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一株暗灰链霉菌及其在蛋白水解酶生产中的应用， 属于微生物技术领 域以及发酵技术领域。 背景技术 0002 大米蛋白是公认的优质蛋白， 相对于大。

7、豆蛋白、 乳清蛋白等蛋白而言， 其营养抑制 因子含量少， 无过敏反应， 包含人体所需氨基酸， 氨基酸配比合理， 且生物价远超大豆蛋白， 可与虾及牛肉等的生物价相媲美， 符合世界卫生组织(WHO)推荐的理想模式。 大米蛋白水解 成短肽后， 还可以制成营养价值更高的短肽营养液， 作为高价值添加剂运用于保健品、 饮 料、 化妆品等行业。 0003 在大米肽中， 分子量小于1000Da的统称为 “小分子肽” ， 小分子肽可被人体小肠迅 速吸收， 不仅不会引起营养过剩等副作用， 而且， 一些特定的小分子肽还具有独特的生理功 能， 例如， 具有抗氧化能力(具体可见参考文献： Yan et al.,Food。

8、 Chemistry,2015,179: 290-295)、 改善仔猪肠道菌群(具体可见参考文献： 杨亚强.,南昌大学M,2018)、 具有血管 紧张素转化酶(ACE)抑制活性(具体可见参考文献： Wang et al .,LWT-Food Sci Technology,2017,75:93-99)以及具有抗癌活性(具体可见参考文献： Kannan et al.,The Open Bioactive Compounds Journal,2009,2:17-20)等， 故而小分子肽含量是大米肽品质 的关键指标， 提升小分子肽含量可大大提升大米肽产品的市场竞争力。 0004 目前， 小分子肽的制备。

9、方法主要有酶解法、 微生物发酵法、 酸碱解法、 化学合成法 等， 其中， 酶解法是工业上可行， 安全性高， 而且绿色环保的一种方法。 但是， 现有的酶解法 仍具有许多缺陷， 例如， 公开号为CN1102229643A的专利中所记载的制备方法可使所得大米 肽产品中的小分子肽含量高达50左右， 但其在制备过程中需采用多种酶制剂协同酶解， 并且， 其需要使用中空纤维膜， 这大大延长了大米肽产品的生产周期， 增加了大米肽产品的 工业生产成本； 公开号为CN103440949A的专利则先采用粉碎、 调浆、 洗涤、 调浆、 反应、 浓缩、 脱水等步骤对大米米渣进行预处理， 然后再采用多种蛋白水解酶协同处理。

10、经预处理的大米 米渣， 但是， 此方法主要以预处理方式提高大米肽产品中的小分子肽含量， 其酶解过程前 后， 大米肽产品中的小分子肽含量变化不显著， 并且， 此方法制备步骤繁琐、 能耗大、 加酶量 大， 不利于工业化进程。 0005 因此， 急需找到一种制备工艺简单、 制备周期短、 成本低且制备得到的大米肽中小 分子肽含量高的制备大米肽的方法以克服上述缺陷。 发明内容 0006 技术问题 0007 本发明要解决的技术问题是提供一种制备工艺简单、 制备周期短、 成本低且制备 得到的大米肽中小分子肽含量高的制备大米肽的方法。 0008 技术方案 说明书 1/7 页 3 CN 111088199 A 。

11、3 0009 为解决上述问题， 本发明提供了一种暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20， 所述 暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20已于2019年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中 心， 保藏编号为CCTCC NO:M2019936， 保藏地址为中国武汉， 武汉大学。 0010 所述暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20来源于江苏省无锡市滨湖区的面粉厂 厂区内土壤样本， 该菌株经测序分析， 其16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示， 将测序得到的序 列在Genbank中进行核酸序列比对， 发现其16SrDNA序列与暗灰链霉菌(。

12、Streptomyces canus)DSM 40017的16S rDNA序列相似度高达98.3， 将与其相似度高的菌株构建系统进 化树(具体可见图1)， 结果显示菌株与暗灰链霉菌(Streptomyces canus)cfcc 3169同属于 一个分支， 将其命名为暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20。 0011 所述暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20在LB固体培养基上的菌落较小， 白色， 边缘整齐， 圆型， 直径24mm。 0012 所述暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20的生长温度为2045， 最适生长温 度30。 0013 。

13、所述暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20的生长pH为6.08.0， 最适生长pH为 7.0。 0014 所述暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20可在含有5g/LNCl的培养基中生长， 具 有一定的耐盐能力。 0015 本发明还提供了上述暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20在生产蛋白水解酶中 的应用。 0016 本发明还提供了一种生产蛋白水解酶的方法， 所述方法为先将上述暗灰链霉菌 (Streptomyces canus)T20接种于发酵培养基中进行发酵， 得到含有蛋白水解酶的发酵液， 然后将发酵液进行提取， 得到蛋白水解酶。 0017。

14、 在本发明的一种实施方式中， 所述蛋白水解酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。 0018 在本发明的一种实施方式中， 编码所述蛋白水解酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。 0019 在本发明的一种实施方式中， 所述发酵培养基的成分包含大米蛋白粉、 磷酸二氢 钠、 磷酸氢二钠、 硫酸镁、 硫酸亚铁。 0020 在本发明的一种实施方式中， 所述发酵培养基的成分包含大米蛋白粉2.5g/L、 磷 酸二氢钠0.1g/L、 磷酸氢二钠0.1g/L、 硫酸镁0.05g/L、 硫酸亚铁0.001g/L。 0021 在本发明的一种实施方式中， 所述发酵的温度为2045、 转速为100200。

15、rpm、 pH为6.08.0。 0022 本发明还提供了上述暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20在生产蛋白肽中的应 用。 0023 本发明还提供了一种生产蛋白肽的方法， 所述方法为先将上述暗灰链霉菌 (Streptomyces canus)T20接种于发酵培养基中进行发酵， 得到含有蛋白水解酶的发酵液， 然后将发酵液进行提取， 得到蛋白水解酶， 再将蛋白水解酶添加至含有蛋白的反应体系中 进行酶解， 得到含有蛋白肽的酶解液， 最后将酶解液进行提取， 得到蛋白肽； 0024 或者， 所述方法为先将上述暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20接种于发酵培 养基中进。

16、行发酵， 得到含有蛋白水解酶的发酵液， 然后将发酵液添加至含有蛋白的反应体 说明书 2/7 页 4 CN 111088199 A 4 系中进行酶解， 得到含有蛋白肽的酶解液， 最后将酶解液进行提取， 得到蛋白肽； 0025 或者， 所述方法为先将上述暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20接种于发酵培 养基中进行发酵， 得到含有蛋白水解酶的发酵液， 然后将发酵液离心取上清， 得到发酵上清 液， 再将发酵上清液添加至含有蛋白的反应体系中进行酶解， 得到含有蛋白肽的酶解液， 最 后将酶解液进行提取， 得到蛋白肽。 0026 在本发明的一种实施方式中， 所述蛋白水解酶的氨基酸序列如S。

17、EQ ID No.2所示。 0027 在本发明的一种实施方式中， 编码所述蛋白水解酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。 0028 在本发明的一种实施方式中， 所述发酵培养基的成分包含大米蛋白粉、 磷酸二氢 钠、 磷酸氢二钠、 硫酸镁、 硫酸亚铁。 0029 在本发明的一种实施方式中， 所述发酵培养基的成分包含大米蛋白粉2.5g/L、 磷 酸二氢钠0.1g/L、 磷酸氢二钠0.1g/L、 硫酸镁0.05g/L、 硫酸亚铁0.001g/L。 0030 在本发明的一种实施方式中， 所述发酵的温度为2045、 转速为100200rpm、 pH为6.08.0。 0031 在本发明的一种实施。

18、方式中， 所述反应体系中， 蛋白的浓度为550g/L。 0032 在本发明的一种实施方式中， 所述蛋白水解酶、 发酵液或发酵上清液在反应体系 中的添加量为10003000U/g蛋 白。 0033 在本发明的一种实施方式中， 所述酶解的温度为3040、 转速为150200rpm、 pH为78。 0034 在本发明的一种实施方式中， 所述蛋白为大米蛋白； 所述蛋白肽为大米肽。 0035 在本发明的一种实施方式中， 所述大米肽为分子量小于1000Da的小分子大米肽。 0036 有益效果 0037 (1)本发明筛选出了一种暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20， 此暗灰链霉菌 (St。

19、reptomyces canus)T20可高效降解蛋白， 将此暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20涂 布于含有1g/L大米蛋白的固体培养基上培养48h， 即可使固体培养基的透明圈直径高达 25mm。 0038 (2)本发明筛选出了一种暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20， 此暗灰链霉菌 (Streptomyces canus)T20可高产氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白水解酶， 将此暗灰 链霉菌(Streptomyces canus)T20接种至发酵培养基中发酵48h， 即可使发酵上清液中的蛋 白水解酶酶活高达1500U/mL。 0039 (。

20、3)本发明提供了一种生产大米肽的方法 ， 此方法通过使用暗灰链霉菌 (Streptomyces canus)T20发酵获得的发酵上清液， 大大提高了大米肽中小分子肽的含量， 将暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20发酵获得的发酵上清液以终酶活2400U/g蛋 白的添 加量加入大米蛋白浓度为10g/L的大米蛋白分散液中进行酶解， 仅需酶解2h， 即可使酶解上 清液中小分子肽的含量高达70.3。 0040 (4) 本发明 提供了一 种生 产大米 肽的 方法 ， 此方法 仅需 将暗 灰 链霉菌 (Streptomyces canus)T20发酵获得的发酵上清液加入含有大米蛋白的大米。

21、蛋白分散液中 进行酶解， 即可获得富含小分子肽的大米肽， 制备工艺简单、 制备周期短且成本低。 0041 生物材料保藏 说明书 3/7 页 5 CN 111088199 A 5 0042 一种暗灰链霉菌(Streptomyces canus)， 分类学命名为Streptomyces canus T20， 已于2019年11月15日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCC NO: M2019936， 保藏地址为中国武汉， 武汉大学。 附图说明 0043 图1： 暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20的系统进化树。 0044 图2： 暗灰链霉菌(Streptomyce。

22、s canus)T20的菌落。 具体实施方式 0045 下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。 0046 下述实施例中涉及的大米蛋白粉购自购自无锡金农生物科技有限公司， 其他试剂 材料均购自于国药集团。 0047 下述实施例中涉及的培养基如下： 0048 富集培养基： 大米蛋白粉1g/L。 0049 分离培养基： 大米蛋白粉1g/L、 葡萄糖3g/L、 琼脂15g/L。 0050 发酵培养基： 大米蛋白粉2.5g/L、 磷酸二氢钠0.1g/L、 磷酸氢二钠0.1g/L、 硫酸镁 0.05g/L、 硫酸亚铁0.001g/L， pH7.0。 0051 LB液体培养基： 蛋白胨10g/L、 酵。

23、母膏5g/L、 NaCl 10g/L。 0052 LB固体培养基： 蛋白胨10g/L、 酵母膏5g/L、 NaCl 10g/L、 琼脂15g/L。 0053 NaCl耐受培养基： NaCl 010g/L、 蛋白胨10g/L、 酵母膏5g/L。 0054 下述实施例中涉及的检测方法如下： 0055 蛋白水解酶酶活的测定： 0056 标准曲线的绘制： 称取一定量的对硝基苯胺用少量无水乙醇溶解， 用pH为8.0的 Tris-HCl缓冲液稀释至终浓度为40 g/mL； 以稀释后的对硝基苯胺溶液为母液， 分别取 1000、 950、 900、 850、 800、 750、 700、 650、 600、 。

24、550、 500、 450、 400、 350、 300、 250、 200、 150、 100、 50、 0 L母液， 用浓度为50mM、 pH为9.0的Tris-HCl缓冲液补齐至1000mL， 配置成一系列浓度 梯度的标准溶液(0.0、 2.0、 4.0、 6.0、 8.0、 10.0、 12.0、 14.0、 16.0、 18.0、 20.0、 22.0、 24.0、 26.0、 28.0、 30.0、 32.0、 34.0、 36.0、 38.0、 40.0 g/mL)； 以pH为8.0的Tris-HCl缓冲液为空白 对照， 在405nm波长处测定标准溶液的吸光度； 以对硝基苯胺的浓。

25、度为横坐标， 吸光度为纵 坐标， 作出OD405与对硝基苯胺浓度关系的线性图， 即为酶活标准曲线； 0057 酶活的测定： 于1.5mL EP管中加入600 L浓度为50mM、 pH为8.0的Tris-HCl缓冲液 和50 L待测液； 将混合液置于60水浴中预热5min后， 在混合液中加入50 L浓度为100mM的 Leu-pNA溶液， 于60水浴中继续反应10min； 反应结束后， 将EP管完全置于冰中终止反应， 并用酶标仪测定反应液在405nm波长下的吸光值； 根据吸光值计算待测酶液中蛋白水解酶 的酶活； 0058 其中， 酶活的计算公式为： 0059 酶活(U/mL)OD4057D/(K。

26、100.5)； 0060 酶活的定义为： 在pH为8.0、 温度为60的条件下， 每分钟释放1 mol对硝基苯胺 (p-nitroanilide)的所需的酶量为一个酶活力单位(1U)。 说明书 4/7 页 6 CN 111088199 A 6 0061 大米肽分子量分布的测定： 0062 取大米肽作为样品， 加蒸馏水溶解成大米肽浓度为5mg/mL的溶液后， 于12000rpm 离心10min， 取上清液200 L进行凝胶色谱分析； 色谱条件如下： TSKgel G2000 SWXL(7.8mm 30cm， Tosoh)； 二极管阵列检测器， 检测波长220nm； 流动相： V(乙腈)： V(水。

27、)： V(三氯乙酸) 10:90:0.1； 柱温30； 进样量： 20 L； 流速0.8mL/min； 利用V2.0英谱凝胶色谱数据工作站进 行数据分析。 0063 实施例1： 暗灰链霉菌T20的初筛 0064 具体步骤如下： 0065 以来源于江苏省无锡市滨湖区的面粉厂厂区内土壤为样本， 称取10g样本加入 90mL灭菌的富集培养基中， 30、 200rpm震荡培养48h， 得到培养液； 吸取10mL培养液加入新 的90mL灭菌的富集培养基中， 30、 200rpm震荡培养48h， 重复2次， 得到富集液； 将富集液用 无菌水梯度稀释， 得到梯度稀释液； 分别取200 L稀释至10-3、 1。

28、0-4、 10-5、 10-6、 10-7、 10-8的梯 度稀释液涂布于分离培养基上， 30下培养48h， 挑选有透明圈的单菌落； 挑取有透明圈的 单菌落在LB固体培养基上划线， 30下培养48h， 重复多次， 直至可在显微镜下观察到形态 单一的菌体， 得到纯化后的单菌落； 将纯化后的单菌落点接种到分离培养基上， 30下培养 48h， 选择透明圈较大的菌株(直径20mm)， 分别命名为T16、 T20、 T37、 T39、 T40、 T53(菌株 T16、 T20、 T37、 T39、 T40、 T53的透明圈直径可见表1)。 0066 表1菌株T16、 T20、 T37、 T39、 T40。

29、、 T53的透明圈直径 0067 菌株透明圈直径(mm) T1620 T2025 T3720 T3922 T4020 T5321 0068 实施例2： 暗灰链霉菌T20的复筛 0069 具体步骤如下： 0070 挑取实施例1获得的菌株T16、 T20、 T37、 T39、 T40、 T53的纯化后的单菌落分别接种 至LB液体培养基中， 30、 200rpm震荡下培养24h， 获得种子液； 将种子液以5(v/v)的接种 量接种于发酵培养基中， 30、 200rpm震荡培养48h至发酵液的OD6001.2； 将发酵液于 12000rpm、 4的条件下离心20min， 获得发酵上清液； 将大米蛋白粉。

30、按料液比10:1(w/v， g/ L)溶解于蒸馏水， 得到分散液； 在分散液中加入发酵上清液使分散液中蛋白水解酶的终酶 活为2400U/g蛋 白， 40、 150rpm恒温水浴摇床中反应2h后煮沸15min灭酶， 得到酶解液； 将酶 解液于5000rpm的条件下离心20min， 获得酶解上清液。 0071 检测发酵上清液中蛋白水解酶的酶活(检测结果见表2)。 0072 以加入经沸水浴处理20min后的发酵上清液的分散液作为空白对照， 将酶解上清 液经0.45 M滤膜过滤后通过凝胶色谱分析检测滤液中大米肽的分子量分布(检测结果见表 3)。 0073 由表2可知， 菌株T20发酵获得的发酵上清液中。

31、蛋白水解酶的酶活最高， 为1500U/ 说明书 5/7 页 7 CN 111088199 A 7 mL。 对获得的蛋白水解酶进行测序， 发现其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示、 核苷酸序列如 SEQ ID No.3所示。 0074 由表3可知， 经菌株T20发酵获得的发酵上清液酶解的酶解上清液中小分子肽的含 量最高， 占总蛋白含量的70.3。 0075 表2菌株T16、 T20、 T37、 T39、 T40、 T53发酵获得的发酵上清液中蛋白水解酶的酶活 0076 菌株蛋白水解酶的酶活(U/mL) T16940 T201500 T37906 T391230 T40920 T531106 。

32、0077 表3经菌株T16、 T20、 T37、 T39、 T40、 T53发酵获得的发酵上清液酶解的酶解上清液 中小分子肽和多肽的含量占总蛋白含量的比值 0078 菌株编号小分子肽(1000Da， )多肽(1000Da， ) 空白对照24.575.6 T1641.256.2 T2070.329.19 T3730.667.3 T3949.249.2 T4051.647.1 T5360.338.4 0079 实施例3： 暗灰链霉菌T20的鉴定和保藏 0080 具体步骤如下： 0081 选取实施例2中获得的菌株T20， 提取菌株T20的总DNA进行16SrDNA的扩增和测序 (由无锡天霖生物科技有。

33、限公司完成， 菌株T20的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所 示)， 将测序得到的序列在Genbank中进行核酸序列比对， 发现其16S rDNA序列与暗灰链霉 菌(Streptomycescanus)DSM 40017的16S rDNA序列相似度高达98.3， 将与其相似度高的 菌株构建系统进化树(具体可见图1)， 结果显示菌株与暗灰链霉菌(Streptomyces canus) cfcc 3169同属于一个分支， 将其命名为暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20。 0082 将暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20送至中国典型培养物保。

34、藏中心保藏， 保 藏日期为： 2019年11月15日， 保藏编号为CCTCC NO:M2019936， 保藏地址为中国武汉， 武汉大 学。 0083 实施例4： 暗灰链霉菌T20的培养和观察 0084 具体步骤如下： 0085 刮取一环实施例1获得的暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20的纯化后的单菌 落在LB固体培养基划线培养， 30培养24h后， 观察其菌落， 发现其菌落较小， 白色， 边缘整 齐， 圆型， 直径24mm(具体可见图2)。 0086 刮取一环实施例1获得的暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20的纯化后的单菌 说明书 6/7 页 8 CN 。

35、111088199 A 8 落接入pH为7.0的LB液体培养基中， 分别于1050恒温培养48h， 发现其生长温度为20 45， 最适温度30。 0087 刮取一环实施例1获得的暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20的纯化后的单菌 落接入pH分别为3.010.0的LB液体培养基中于30恒温培养48h， 发现其生长pH为6.0 8.0， 最适pH为7.0。 0088 刮取一环实施例1获得的暗灰链霉菌(Streptomyces canus)T20的纯化后的单菌 落接入分别含010g/L NCl的NCl耐受培养中， 于pH为7.0、 温度为30的条件下恒温培养 48h， 发现其可在。

36、含有05g/L NCl的NCl耐受培养中生长， 且发现其在含有1g/L NCl的NCl 耐受培养中生长最为旺盛。 0089 虽然本发明已以较佳实施例公开如上， 但其并非用以限定本发明， 任何熟悉此技 术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内， 都可做各种的改动与修饰， 因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。 说明书 7/7 页 9 CN 111088199 A 9 序列表 江南大学 一株暗灰链霉菌及其在蛋白水解酶生产中的应用 3 PatentIn version 3.3 1 1402 DNA 暗灰链霉菌 1 attacacatg cagtcgaacg atgaaccact tcgg。

37、tgggga ttagtggcga acgggtgagt 60 aacacgtggg caatctgccc ttcactctgg gacaagccct ggaaacgggg tctaataccg 120 gataccacta ccgcaggcat ctgtggtggt tgaaagctcc ggcggtgaag gatgagcccg 180 cggcctatca gcttgttggt gaggtaacgg ctcaccaagg cgacgacggg tagccggcct 240 gagagggcga ccggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg gga。

38、ggcagca 300 gtggggaata ttgcacaatg ggcgcaagcc tgatgcagcg acgccgcgtg agggatgacg 360 gccttcgggt tgtaaacctc tttcagcagg gaagaagcgc aagtgacggt acctgcagaa 420 gaagcgccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggcgca agcgttgtcc 480 ggaattattg ggcgtaaaga gctcgtaggc ggcttgtcac gtcgggtgtg aaagcccggg 540 gcttaacc。

39、cc gggtctgcat tcgatacggg ctagctagag tgtggtaggg gagatcggaa 600 ttcctggtgt agcggtgaaa tgcgcagata tcaggaggaa caccggtggc gaaggcggat 660 ctctgggcca ttactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc 720 ctggtagtcc acgccgtaaa cggtgggaac taggtgttgg cgacattcca cgtcgtcggt 780 gccgcagcta acgcattaag ttcccc。

40、gcct ggggagtacg gccgcaaggc taaaactcaa 840 aggaattgac gggggcccgc acaagcagcg gagcatgtgg cttaattcga cgcaacgcga 900 agaaccttac caaggcttga catacaccgg aaacaattag agataggtgc ccccttgtgg 960 tcggtgtaca ggtggtgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1020 ccgcaacgag cgcaaccctt gtcctgtgtt gccagcaact ctt。

41、tcgggag gttggggact 1080 cacaggagac cgccggggtc aactcggagg aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatgcc 1140 ccttatgtct tgggctgcac acgtgctaca atggcaggta caatgagctg cgaaaccgtg 1200 aggtggagcg aatctcaaaa agcctgtctc agttcggatt ggggtctgca actcgacccc 1260 atgaagtcgg agttgctagt aatcgcagat cagcattgct gcggtgaata cgttcccg。

42、gg 1320 ccttgtacac accgcccgtc acgtcacgaa agtcggtaac acccgaagcc ggtggcccaa 1380 ccccttgtgg gagggagctt ag 1402 2 516 PRT 暗灰链霉菌 序列表 1/4 页 10 CN 111088199 A 10 2 Met His Ala Cys Arg Ser Thr Ile Val Pro Leu Arg Leu Gly Ala Phe 1 5 10 15 Val His Arg Arg Leu Ile Ala Pro Gly Ala Leu Ala Ala Ala Ser Val 20 2。

43、5 30 Leu Leu Ala Ile Pro Ala Ser Ala Ala Gly Tyr Ser Pro Gly Ala Pro 35 40 45 Gly Ile Gly Asp Pro Tyr Tyr Pro Ala Tyr Gly Asn Gly Gly Tyr Asp 50 55 60 Val Ser His Tyr Asp Leu Arg Leu Lys Tyr Gln Pro Ala Thr Asp Arg 65 70 75 80 Leu Glu Gly Thr Ala Thr Leu Leu Ala Arg Thr Thr Gln Asp Leu Ser 85 90 95 。

44、Arg Phe Asn Leu Asp Phe Leu Leu Asp Val Ser Glu Val Arg Val Asn 100 105 110 Gly Val Lys Ala Ala Phe Thr Ala Ser Gly Glu His Glu Leu Glu Ile 115 120 125 Thr Pro Lys Thr Pro Leu Ala Lys Gly Ala Ala Ala Thr Ile Val Val 130 135 140 Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Ser Lys Gln Ala Tyr Gly Phe Thr Ser 145 150 。

45、155 160 Trp His Arg Thr Pro Asp Gly Gly Val Gly Ala Asn Glu Pro Glu Ala 165 170 175 Ala Trp Trp Trp Phe Pro Ser Asn Asp His Pro Leu Asp Lys Ala Thr 180 185 190 Tyr Asp Val Ser Val Leu Val Pro Asp Gly Ser Gln Ala Ile Ser Asn 195 200 205 Gly Thr Leu Gln Ser Thr Ser Ser Arg Ala Gly Trp Thr Arg Phe Asn 。

46、210 215 220 Trp Arg Ser Asn Lys Pro Gln Ala Thr Tyr Leu Ala Thr Leu Ala Val 225 230 235 240 Gly Lys Phe Asp Ile Thr Thr Gly Arg Thr Glu Ser Gly Ile Pro Val 245 250 255 Val Asn Ala Tyr Ser Lys Asp Leu Gly Asp Asn Ala Gly Ala Ala Arg 260 265 270 Ala Ser Ile Glu Arg Thr Gly Glu Ile Ala Asp Trp Leu Ser 。

47、Glu Tyr 275 280 285 Tyr Gly Pro Tyr Pro Tyr Asn Ala Leu Gly Gly Tyr Val Pro Asn Thr 290 295 300 序列表 2/4 页 11 CN 111088199 A 11 Asn Thr Gly Tyr Ala Leu Glu Thr Gln Thr Arg Pro Phe Tyr Ser Pro 305 310 315 320 Arg Gln Phe Ala Gly Gly Ser Asn Val Ser Val Val Val His Glu Leu 325 330 335 Ala His Gln Trp T。

48、yr Gly Asp Leu Val Ser Val Ala Gly Trp Lys Asp 340 345 350 Ile Trp Ile Asn Glu Gly Phe Ala Arg Tyr Ala Gln Trp Leu Trp Ser 355 360 365 Glu His Glu Asn Glu Gly Thr Ala Gln Glu Ile Ala Asp Tyr Val Tyr 370 375 380 Ala Ser His Pro Ala Asp Asp Pro Phe Trp Thr Val Lys Pro Gly Asp 385 390 395 400 Pro Gly P。

49、ro Glu Asn Gln Phe His Leu Ala Val Tyr Asp Arg Gly Gly 405 410 415 Leu Ala Leu Gln Ala Leu Arg Asn Glu Ile Gly Asp Asp Asp Phe Phe 420 425 430 Ala Ile Leu Lys Gly Trp Pro Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Asn Ala Thr 435 440 445 Val Ala Asp Phe Glu Lys Tyr Ala Glu Glu Val Ser Gly Gln Ser Leu 450 455 460 Ser A。

50、la Leu Phe Asp Thr Trp Leu Phe Gln Pro Ser Lys Pro Ala Ala 465 470 475 480 Pro Ala Ala Ala Asp Ala Ser Ile Ala Arg Ala Ala Ala Ala Gly Glu 485 490 495 Thr Pro Val Arg Pro Lys Ser Trp Lys Lys Ile Ala Ala Thr Asn Asp 500 505 510 Val His Glu Arg 515 3 1551 DNA 暗灰链霉菌 3 ttgcacgcct gccgttcgac gattgtgccc c。