基于血清的布鲁氏菌感染快速检测方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010156263.7 (22)申请日 2020.03.09 (71)申请人 中国疾病预防控制中心传染病预防 控制所 地址 102206 北京市昌平区昌百路155号 (72)发明人 肖迪姜海张慧芳张炳华 王磊杨文涛李天一赵飞 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 陈征 (51)Int.Cl. G01N 27/62(2006.01) G16B 5/00(2019.01) G16B 50/00(2019.01) (54)发明名称 基于血清的布。

2、鲁氏菌感染快速检测方法 (57)摘要 本发明提供了基于血清的布鲁氏菌感染快 速检测方法， 涉及蛋白质谱检测技术领域。 本发 明根据布鲁氏菌感染血清和健康人血清的质谱 数据， 通过ClinProTools软件的SVM模型算法构 建感染布鲁氏菌血清的标准检测模型， 并获得了 用于鉴别布鲁氏菌感染血清的特征蛋白组合， 所 构建模型的识别能力为99.15%， 交叉验证值为 96.04%。 利用标准检测模型对待测血清的MALDI- TOFMS质谱数据进行分类分析， 可准确判断待检 测血清是否为布鲁氏菌感染。 本发明方法适于布 鲁氏菌感染人群的血清检测， 准确度高、 重复性 好， 通量高， 检测成本低廉，。

3、 结果可靠， 具有良好 的应用前景。 权利要求书1页 说明书8页 附图3页 CN 111007139 A 2020.04.14 CN 111007139 A 1.一种检测感染布鲁氏菌 （Brucella） 血清的特征蛋白组合， 其特征在于， 所述特征蛋 白组合中每个特征蛋白的质荷比m/z分别为： 2069.35、 2081 .28、 2932.93、 3095.84、 4466.26、 6631.4、 7644.8、 8930.09、 9514.58、 9578.16。 2.权利要求1所述的特征蛋白组合在构建检测布鲁氏菌 （Brucella） 感染血清的试剂盒 或检测模型中的应用。 3.根据权。

4、利要求2所述的应用， 其特征在于， 利用ClinProTools软件的SVM模型算法进 行构建。 4.一种检测感染布鲁氏菌 （Brucella） 血清的标准检测模型， 其特征在于， 通过以下方 法构建得到： （1） 将具有统计学意义数量的布鲁氏菌抗体阴性的人血清样本、 布鲁氏菌感染抗体阳 性的人血清样本经富集蛋白处理后， 采集血清样本的MALDI-TOF MS质谱数据形成两组数 据； （2） 利用ClinProTools软件， 按软件使用要求编辑参数， 将步骤 （1） 中获得的两组质谱 数据调入， 进行峰统计分析； （3） 选择模型算法， 构建得到标准检测模型， 并确定10个特征蛋白， 每个特。

5、征蛋白的质 荷比m/z分别为： 2069.35、 2081.28、 2932.93、 3095.84、 4466.26、 6631.4、 7644.8、 8930.09、 9514.58、 9578.16。 5.根据权利要求4所述的标准检测模型， 其特征在于， 所述模型算法为SVM模型， 算法参 数选择： 模型中峰数目设为在1-25范围内自动选择， 最邻近分类数选择1-7进行优化。 6.权利要求4或5所述的标准检测模型在构建布鲁氏菌感染血清检测系统中的应用。 7.一种布鲁氏菌感染的血清检测系统， 其特征在于， 所述检测系统的工作程序包括以 下步骤： （1） 前处理待检测血清样本， 以富集血清中。

6、的蛋白； （2） 前处理后的血清样本点到质谱仪样本靶上， 自然干燥后在样本上覆盖基质饱和溶 液； （3） 采用质谱仪采集数据， 每个样本平行采集两张原始谱图数据； （4） 采用ClinProTools软件调用权利要求4或5所述标准检测模型， 对步骤 （3） 获得的全 部待测血清样本的原始数据进行检索分类， 确定检测的血清样本是来源于健康人还是布鲁 氏菌感染者。 8.根据权利要求7所述的血清检测系统， 其特征在于， 步骤 （3） 中， 采集的数据强度叠加 至少为1.0104。 9.根据权利要求7或8所述的血清检测系统， 其特征在于， 所述质谱仪为MALDI-TOF 质 谱仪， 氮激光器波长377。

7、nm, 质量采集范围1000至20000Da， 源1电压, 20 kV, 源2电压, 18.5 kV, 透镜电压, 8.45 kV； 延时提取, 320 ns； 激光频率20Hz， 调整总采集频次使谱 图总强度大于10000； 采用大肠杆菌ATCC8739质控校正仪器， 使质量偏差小于300ppm。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111007139 A 2 基于血清的布鲁氏菌感染快速检测方法 技术领域 0001 本发明涉及蛋白质谱检测技术领域， 具体地， 涉及用于检测血清特征蛋白的标准 检测模型以及基于该标准检测模型鉴别布鲁氏菌感染的血清检测方法。 背景技术 0002 布鲁氏菌病 （Bru。

8、cellosis， 简称布病） 是由布鲁氏菌属细菌侵入机体所引发的传 染-变态反应性传染病。 人感染主要是接触染疫的动物或食用被布鲁氏菌污染的食品。 人患 此病后， 可发生多器官受损， 很容易转为难以治愈的慢性病人， 严重者可致残， 严重影响生 存质量。 0003 目前布病诊断依赖血清免疫学检查结合病原学细菌分离实验， 该方法操作繁琐， 难以达到快速确诊的需求。 常用的血清学检查方法有虎红平板凝集试验、 试管凝集试验等。 随着国家对布鲁氏菌病感染的重视， 快速检测技术以已取得长足进步， 间接酶联免疫吸附 试验、 胶体金免疫层析法等检测方法逐步开始使用， 但现有技术仍存在一定缺陷， 对临床诊 断。

9、存在较大的漏诊和误诊率。 实时荧光PCR是国际公认的目前病原体检测应用最广泛和稳 定的分子诊断技术， 在新突发传染病病原体的实验室确证中具有不可替代的地位和作用。 但病原体分子检测领域仍存在突出的问题： 核心探针技术无自主知识产品， 需要发展具有 自主知识产权且性能更好的核心探针技术； 布鲁氏菌荧光PCR检测产品尚无标准化试剂， 且 无标准化操作规程。 针对国家高致病性传染病应急处置的重大需求， 创建新突发传染病诊 断方法、 诊断试剂应急研发和产业化技术平台， 形成快速响应体系迫在眉睫。 0004 全球范围内高端技术体系的发展为布鲁氏菌识别鉴定提供了有利的工具。 基质辅 助激光解吸电离飞行时间。

10、质谱 （MALDI-TOF MS） 技术已经发展近10余年， 在微生物识别鉴定 领域的应用已趋于成熟， 其快速、 准确、 易操作、 廉价、 高通量的特点已得到全世界范围的认 同。 采用MALDI-TOF MS对布鲁氏菌纯培养菌及血液中的布鲁氏菌进行快速鉴定已有报道。 诊断布鲁氏菌感染的临床标本最常见的是血液， 急性期病人的菌血浓度很低， 临床须在血 培养瓶中增菌至一定的浓度才能用于基于MALDI-TOF MS的方法检测病原； 疫苗株感染的病 人， 只有少数大剂量感染者有症状， 大多数感染者只是血清抗体阳性， 并无明显症状， 血液 中也无布鲁氏菌存在， 无法用已有的方法进行检测。 迄今国内外尚无。

11、采用MALDI-TOF MS技 术直接检测血清， 确定布鲁氏菌感染的报道。 因此， 开发成本低廉、 稳定性好、 通量高的我国 自主知识产权的质谱布鲁氏菌感染血清快速检测技术， 是我国公共卫生领域的急切需求， 具有重大的社会效益。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种快速、 灵敏、 准确、 高通量的基于血清的布鲁氏菌感染快 速检测方法。 0006 本发明依据健康人 （非布鲁氏菌感染者） 与布鲁氏菌感染后人体血清蛋白质谱数 据的差异， 通过ClinProTools软件的支持向量机 （SVM） 模型算法构建感染布鲁氏菌血清的 说明书 1/8 页 3 CN 111007139 A 3 标准检测模。

12、型， 并获得了用于鉴别布鲁氏菌感染血清的特征蛋白组合， 利用构建的血清检 测模型， 进行人血清的快速检测， 甄别待测血清是否为布鲁氏菌感染。 0007 本发明首先提供一种检测感染布鲁氏菌 （Brucella） 血清的特征蛋白组合， 所述特 征蛋白组合中每个特征蛋白的质荷比m/z分别为： 2069.35、 2081.28、 2932.93、 3095.84、 4466.26、 6631.4、 7644.8、 8930.09、 9514.58、 9578.16。 0008 本发明提供了上述特征蛋白组合在构建检测布鲁氏菌 （Brucella） 感染血清的试 剂盒或检测模型中的应用。 0009 优选地。

13、， 上述试剂盒或检测模型是利用ClinProTools软件的SVM模型算法进行构 建得到的。 0010 进一步， 本发明提供一种检测感染布鲁氏菌 （Brucella） 血清的标准检测模型， 通 过以下方法构建得到： （1） 将具有统计学意义数量的布鲁氏病抗体为阴性的人血清样本、 布鲁氏菌感染抗体 阳性的人血清样本经富集蛋白处理后， 采集血清样本的MALDI-TOF MS质谱数据形成两组数 据； （2） 利用ClinProTools软件， 按软件使用要求编辑参数， 将步骤 （1） 中获得的两组质谱 数据调入， 进行峰统计分析； （3） 选择模型算法， 构建得到标准检测模型， 并确定10个特征蛋白。

14、， 每个特征蛋白的质 荷比m/z分别为： 2069.35、 2081.28、 2932.93、 3095.84、 4466.26、 6631.4、 7644.8、 8930.09、 9514.58、 9578.16。 0011 所述模型算法为支持向量机算法SVM， 算法参数选择： 模型中峰数目设为在1-25范 围内自动选择， 最邻近分类数选择1-7进行优化。 0012 本发明在研究过程中， 对ClinProTools软件提供的诸多模型算法都进行了应用， 所述模型算法为遗传算法 （GA） 模型、 支持向量机 （SVM） 模型、 监督神经网络 （SNN） 模型、 快速 分类 （QC） 模型， 而后。

15、通过交叉验证确定最优检测模型， 本发明获得的用于分辨健康人和布 病感染的最优模型为SVM模型， 模型识别能力为99.15%， 交叉验证能力为96.04%。 0013 另一方面， 本发明提供了一种检测感染布鲁氏菌 （Brucella） 血清的标准检测模型 的构建方法， 包括以下步骤： （1） 将具有统计学意义数量的布鲁氏菌抗体为阴性的人血清样本、 布鲁氏菌感染抗体 阳性的人血清样本经富集蛋白处理后， 采集血清样本的MALDI-TOF MS质谱数据形成两组数 据； （2） 利用ClinProTools软件， 按软件使用要求编辑参数， 将步骤 （1） 中获得的两组质谱 数据调入， 进行峰统计分析； 。

16、（3） 选择支持向量机算法SVM为模型算法， 算法参数选择： 模型中峰数目设为在1-25范 围内自动选择， 最邻近分类数选择1-7进行优化， 构建得到标准检测模型， 并确定标准检测 模型中的10个特征蛋白， 每个特征蛋白的质荷比m/z分别为： 2069.35、 2081.28、 2932.93、 3095.84、 4466.26、 6631.4、 7644.8、 8930.09、 9514.58、 9578.16。 0014 本发明提供了所述的标准检测模型或调用该标准检测模型的ClinProTools软件 在构建布鲁氏菌感染血清检测系统中的应用。 0015 本发明提供了一种感染布鲁氏菌病血清的。

17、检测系统， 该检测系统的工作程序包括 说明书 2/8 页 4 CN 111007139 A 4 以下步骤： （1） 前处理待检测血清样本， 以富集血清中的蛋白； （2） 前处理后的血清样本点到质谱仪样本靶上， 自然干燥后在样本上覆盖基质饱和溶 液； （3） 采用质谱仪采集数据， 每个样本平行采集两张原始谱图数据； （4） 采用ClinProTools软件调用本发明所述标准检测模型， 对步骤 （3） 获得的全部待测 血清样本的原始数据进行检索分类， 确定检测的血清样本是来源于健康人还是布鲁氏菌感 染者。 0016 本发明实施例中， 在上述对应的步骤 （1） 中， 采用弱阳离子磁珠蛋白富集试剂盒对。

18、 待测血清样本进行前处理， 以富集血清中的蛋白。 0017 步骤 （2） 中， 所述基质饱和溶液为 -氢基-4-羟基肉桂酸在48.75%乙腈、 48.75%超 纯水、 2%-3% 三氟乙酸中的饱和液。 0018 步骤 （3） 中， 采集的数据强度叠加至少为1.0104。 0019 步骤 （3中） 所述质谱仪为MALDI-TOF质谱仪， 氮激光器波长377nm, 质量采集范围 1000至20000Da， 源1电压, 20 kV, 源2电压, 18.5 kV, 透镜电压, 8.45 kV； 延时提取, 320 ns； 激光频率20Hz， 调整总采集频次使谱图总强度大于10000； 采用大肠杆菌AT。

19、CC8739 质控校正仪器， 使质量偏差小于300ppm。 0020 本发明针对大量健康人血清与布鲁氏菌感染后的人体血清中的蛋白进行质谱分 析， 通过ClinProTools软件的SVM模型算法构建感染布鲁氏菌病血清的标准检测模型， 发现 了用于鉴别布鲁氏菌感染血清的10个特征蛋白组合。 所构建模型的识别能力为99.15%， 交 叉验证值为96.04%。 利用标准检测模型对待测血清的MALDI-TOF MS质谱数据进行分类分 析， 可准确判断待检测血清是否为布鲁氏菌感染。 0021 本发明方法适于布鲁氏菌感染人群的血清检测。 利用本发明构建的检测系统检测 了84例血清样本， 以目前布病血清抗体。

20、通用检测方法试管凝集实验为检测标准， 验证结果 显示， 84例血清样本中54例布鲁氏菌抗体阳性样本中51例被准确检出， 30例健康人29例被 准确检出， 检测准确率为95.24%。 与布鲁氏菌的其它检测方法比较， 本发明在4小时内可完 成96个样本的检测， 比传统方法至少提前3天完成检测， 符合高通量、 快速、 经济的理想病原 检测标准， 适用于临床确诊、 疾病监测、 流行病学调查、 公共卫生应急处理， 具有十分重要的 现实意义。 附图说明 0022 图1 为模型训练用样本的原始数据胶模式图， 上图为布鲁氏菌感染血清样本， 下 图为健康人血清样本。 0023 图2为模型训练用样本的分类二维图，。

21、 图中叉为健康人相关血清样本， 圈为布鲁氏 菌感染相关血清样本。 0024 图3为验证样本质谱图， 上部浅色为健康人血清谱图， 下部深色为布鲁氏菌病感染 血清谱图。 说明书 3/8 页 5 CN 111007139 A 5 具体实施方式 0025 以下实施例进一步说明本发明的内容， 但不应理解为对本发明的限制。 在不背离 本发明精神和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明 的范围。 0026 若未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 实施例中所用的试剂为市售。 0027 实施例1 特征蛋白的确定与标准检测模型的构建 1、 建模。

22、训练样本选择 本发明采用30例健康人 （布病抗体阴性） 的血清样本、 60例布鲁氏菌感染抗体阳性病人 的血清样本， 所有感染样本经流行病学调查、 试管凝集试验确定。 20%的样本量用于模型交 叉验证。 0028 2、 血清蛋白样本富集 从4冰箱取出磁珠试剂盒 （布鲁克公司MB-WCX kit） ， 取出弱阳离子磁珠悬浮液一管， 手动上下颠倒， 完全混匀磁珠悬浮液1分钟； 吸取60 L磁珠结合缓冲液加入200 L样品管中， 再加入10 L磁珠至样品管中， 用加样枪上下吸打混匀， 避免起泡； 将血清样本12000rpm离心 10分钟； 向样品管中加入5 L血清样品， 用加样枪上下吸打混匀至少5次，。

23、 避免起泡， 室温静 置5分钟； 将样品管放入磁珠分离器上， 使磁珠贴壁1分钟， 磁珠和悬浮的液体分离， 液体应 清澈； 用加样枪吸去悬浮的液体， 枪头应避免接触到磁珠， 避免吸走磁珠； 将样品管放置于 孔板上， 加入100 L磁珠清洗缓冲液； 在磁珠分离器前后相邻两孔间反复移动样品管10次， 注意磁珠在管中的运动， 每次静置7-8秒， 以使磁珠贴壁； 将样品管在磁珠分离器上静置2 秒， 磁珠贴壁， 磁珠与悬浮的液体分离， 液体应清澈； 用加样枪吸去悬浮的液体， 枪头应避免 接触到磁珠， 避免吸去磁珠； 重复上述洗脱步骤两次， 最后一次加样枪吸去悬浮的液体时， 要保证悬浮液完全被吸走； 将样品。

24、管放置于孔板上， 加入5 L磁珠洗脱缓冲液， 反复吸打10 次， 使磁珠和洗脱液混悬均匀， 吹打过程应避免起泡； 样品管放入磁珠分离器上， 磁珠贴壁2 分钟， 磁珠与悬浮的液体充分分离后， 将上清液移入干净的0.5mL样品管中， 再加入5 L磁珠 稳定缓冲液， 吸打混匀， 即得到10 L血清蛋白样本。 0029 3.质谱数据采集 将1 L制备的蛋白样本溶液点到质谱仪样本靶上， 自然干燥后在样本上覆盖1 L基质饱 和溶液， 所述基质为 -氢基-4-羟基肉桂酸在48.75%乙腈、 2.5% 三氟乙酸中的饱和液， 干燥 后采用MALDI-TOF质谱采集数据 （图1） ， 每个样本点采集2张原始谱图，。

25、 谱图数据强度至少达 到1.0104。 0030 质谱仪为MALDI-TOF 质谱仪， 氮激光器波长377nm , 质量采集范围1000至 20000Da， 源1电压, 20 kV, 源2电压, 18.5 kV, 透镜电压, 8.45 kV； 延时提取, 320 ns； 激光频率20Hz， 调整总采集频次使谱图总强度大于10000； 每次数据采集前， 采用大肠杆菌 ATCC8739质控校正仪器， 使分子量误差300ppm。 0031 4. 差异蛋白的获得 采用布鲁克公司的ClinProTools软件对血清样本的原始数据按健康人及布鲁氏菌感 染分成两组进行峰值统计计算分析， 确定组间差异峰， 即。

26、两组样本所有的差异蛋白系列， 共 计62个 （表1） 。 说明书 4/8 页 6 CN 111007139 A 6 0032 5. 检测模型的优化、 构建及特征蛋白的确定 将前述选择的90例训练样本分为两组： 健康人血清样本为组1、 布鲁氏菌感染血清样本 为组2。 用两组数据 （每个数据用两张谱图） 进行数学模型构建， 包括遗传算法 （GA） 、 支持向 量机 （SVM） 模型、 监督神经网络 （SNN） 模型、 快速分类 （QC） 模型， 采用训练数据中的20%进行 所有模型的内部交叉验证， 确定最优检测模型。 0033 支持向量机 （SVM） 算法参数选择： 模型中峰数目设为在1-25范围。

27、内自动选择， 最邻 近分类数选择1-7进行优化， 获得该最优模型使用的用于两组间区分的特征蛋白系列有10 个 （包含在62个组间差异蛋白中） （表2） ： 质荷比m/z： 2069.35、 2081.28、 2932.93、 3095.84、 4466.26、 6631.4、 7644.8、 8930.09、 9514.58、 9578.16。 两组数据的二维分布图显示较好的 区分能力 （图2） 。 说明书 5/8 页 7 CN 111007139 A 7 0034 本发明通过优化和分析， 获得的用于分辨健康人和布病感染的最优标准检测模型为 SVM模型， 模型识别能力为99.15%， 交叉验证。

28、值为96.04%。 GA模型识别能力为100%， 交叉验证 值为91.07%； SNN模型识别能力50.85%， 交叉验证值为81.94%； QC模型识别能力91.53%， 交叉 验证值84.79%。 0035 使用时通过ClinProtools软件把本发明构建的标准检测模型调出来， 用 ClinProtools软件中的分类功能调入待分析的血清原始数据 （调入的数据数量上不封顶） ， 软件结合本发明构建的模型直接快速计算分类， 给出报告告知待分析的血清样本是布鲁氏 菌感染还是健康人。 0036 实施例2 模型分类能力检测 应用实施例1所构建的健康人与布鲁氏菌感染标准检测模型， 对84例临床采集。

29、的血清 样本进行检测分析。 布病血清抗体检测通用方法试管凝集试验为对照。 0037 检测步骤为： 用弱阳离子磁珠蛋白富集试剂制备待检测血清蛋白样本， 将1 L制备 的蛋白样本溶液点到质谱仪样本靶上， 自然干燥后在样本上覆盖1 L基质饱和溶液， 所述基 质为 -氢基-4-羟基肉桂酸在48.75%乙腈、 2.5% 三氟乙酸中的饱和液， 干燥后采用MALDI- TOF质谱采集数据， 每个样本平行采集两张原始数据。 质谱仪为MALDI-TOF 质谱仪， 氮激光 器波长377nm, 质量采集范围1000至20000Da， 源1电压, 20 kV, 源2电压, 18.5 kV, 透镜 电压, 8.45 k。

30、V； 延时提取, 320 ns； 激光频率20Hz， 调整总采集频次使谱图总强度大于 10000； 采用大肠杆菌ATCC8739质控校正仪器， 使质量偏差小于300 ppm。 0038 在ClinProTools软件中调用本发明实施例1构建的布鲁氏菌感染与健康人血清标 准检测模型， 利用其分类功能对全部84例样本168个数据进行检索验证， 验证样本谱图见图 3。 结果显示布鲁氏菌感染抗体阳性血清51例， 阴性血清29例， 3例无法准确区分， 1例错误， 见表3； 试管凝集试验显示布鲁氏菌感染抗体阳性血清54例， 阴性血清30例。 质谱布鲁氏菌 感染血清检测与目前金标准的试管凝集试验检测方法的符。

31、合率为95.24%， 84例样本、 两人 操作的质谱模型检测总时长为3.5小时， 每个样本检测只需5ul血清。 试管凝集试验两人操 作检测总时长至少3天， 且试管凝集试验结果判读复杂， 试验中可能会出现前滞现象和封闭 现象， 可能会有假阴性结果。 0039 其他模型对84例样本的检测的准确度为： SNN模型为37.3%； QC模型为87.7%； GA模 说明书 6/8 页 8 CN 111007139 A 8 型为91.7%。 0040 可见， 在ClinProTools软件中调用本发明实施例1构建的检测模型能够准确鉴别布鲁 说明书 7/8 页 9 CN 111007139 A 9 氏菌感染血。

32、清与健康人血清。 本发明的方法是一种使用简单快速、 适用于布鲁氏菌感染人 群筛查的新型技术， 可准确判断待检测血清是否为布鲁氏菌感染。 0041 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说明书 8/8 页 10 CN 111007139 A 10 图1 说明书附图 1/3 页 11 CN 111007139 A 11 图2 说明书附图 2/3 页 12 CN 111007139 A 12 图3 说明书附图 3/3 页 13 CN 111007139 A 13 。