检测Botryosphaeria sinensia的LAMP引物及试剂盒.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010019764.0 (22)申请日 2020.01.08 (71)申请人 北京林业大学 地址 100083 北京市海淀区清华东路35号 (72)发明人 张英王宇 (74)专利代理机构 北京市京大律师事务所 11321 代理人 李洪群 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名。

2、称 检测Botryosphaeria sinensia的LAMP引物 及试剂盒 (57)摘要 本发明提供一套检测蓝莓茎溃疡病病菌 (Botryosphaeriasinensia)的LAMP引物及试剂 盒。 所述LAMP引物包括外侧正、 反向引物以及内 侧正、 反向引物， 它们的核苷酸序列如SEQID NO： 1-4所示。 本发明将LAMP引物恒温扩增技术用 于Botryosphaeriasinensia病菌的快速检测， 可从发病植物组织及苗木中复杂的病原菌环境 准确地检测出该致病菌。 该方法的特异性、 灵敏 度及可 重复 性 均较常 规 PCR 方法 更高 ， 对 Botryosphaeria。

3、sinensia早期预警、 疫区的病 原监测等方面具有重要意义； 同时可避免高昂的 仪器投入， 便于基层推广使用。 权利要求书2页 说明书7页 序列表1页 附图3页 CN 111041123 A 2020.04.21 CN 111041123 A 1.用于检测蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)的LAMP引物， 其特征在于， 所述LAMP引物为： 外侧正向引物F3： 5-AAGATCGACCGCCGTACC-3 ； 外侧反向引物B3： 5 -GCGACAGTTTGCCTTGGAA-3 ； 内侧正向引物FIP： 5 -CACATGGGCTTGGAGGGAATCATC。

4、CCCAAGTTCATCAAGTCCG-3 ； 内侧反向引物BIP： 5 -CTCTTGGCCGTTTCGCCGTAGCACGATGAAGTTCGGAG-3 。 2.含有权利要求1所述LAMP引物的检测试剂或试剂盒。 3.蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包含权利要求1所述LAMP引物， 还包含dNTPs、 BstDNA聚合酶、 反应缓冲液、 标准阳性模板 中的至少一种。 4.权利要求1所述LAMP引物、 权利要求2所述检测试剂或试剂盒， 或权利要求3所述检测 试剂盒在检测蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria s。

5、inensia)中的应用。 5.蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)检测方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： 1)提取待测样品中的DNA； 2)以步骤1)中提取的DNA为模板， 利用权利要求1所述LAMP引物进行LAMP扩增反应； 3)扩增结果判定。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 步骤2)所用反应体系为： ddH2O补足至25 l； 其中， 所述反应体系中引物FIP和BIP按等量加入， 引物F3和B3按等量加入， 且引物FIP、 BIP与引物F3、 B3的总质量比为8 1。 7.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 步骤2)所用反应条件为： 。

6、61655090 分钟。 8.根据权利要求5-7任一项所述的方法， 其特征在于， 步骤3)采用如下中的任一 种方法进行扩增结果判定： 荧光染色法： 向扩增产物中加入染料SYBR Green I， 进行显色反应， 若反应体系由橙 色变为绿色， 表明待测样品中含有蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)； 或者， 在扩增反应前向反应体系中加入钙黄绿素， 扩增反应结束后， 在紫外灯照射下反应体系显 示荧光绿色， 表明待测样品中含有蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)； 或者， 权利要求书 1/2 页 2 CN 111041123 A 2 在扩增。

7、反应前向反应体系中加入羟基萘酚蓝， 扩增反应结束后， 若反应体系由紫色变为天 蓝色， 表明待测样品中含有蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)； 琼脂糖凝胶电泳法： 若扩增产物在琼脂糖凝胶上呈现特征性梯状条带， 表明待测样 品中含有蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)； 焦磷酸镁浊度检测法： 通过肉眼观察反应后的浑浊情况来判断是否发生了LAMP扩增 反应， 或利用浊度仪检测其在400nm处的吸光度， 实现实时定量检测。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111041123 A 3 检测Botryosphaeria sinensia的LA。

8、MP引物及试剂盒 技术领域 0001 本发明属于微生物检测技术领域， 具体地说， 涉及一种检测Botryosphaeria sinensia的LAMP引物及试剂盒。 背景技术 0002 葡萄座腔菌科真菌(Botryosphaericeae)侵染引起的蓝莓茎溃疡病(Blueberry Stem Blight)， 目前在我国主要蓝莓产区已有发生报道， 对中国蓝莓产业健康发展带来严 重危害。 该菌从蓝莓植株的伤口或自然孔口进行侵染， 导致皮层和韧皮部的枯死在田间引 起蓝莓枝条枯萎、 木质部坏死及植株死亡等症状。 目前， 葡萄座腔菌科中已有多种能引发此 病害(Botryosphaeria cortic。

9、es， Botryosphaeria dothidea， Botryosphaeria sinensia， Fusicoccum aesculin， Lasiodiplodia chinesis， Lasiodiplodia theobromae， Lasiodiplodia vaccinii， Neofusicoccum arbuti， Neofusicoccum austral， Neofusicoccum parvum， Neofusicoccum ribis)， 其中Botryosphaeria sinensia是一种强 致病菌， 病部皮层组织变软变黑， 易剥离， 可在蓝莓枝条表面形成。

10、红棕色至黑色病斑， 组织 坏死， 可见椭圆状至不规则形状褐色溃疡病斑， 蔓延至整个枝条， 引起整枝枯萎死亡， 该菌 主要在枝条病斑内越冬， 在适宜条件下产生分生孢子， 借助通过自然孔口或机械伤口侵入 田间植株， 侵染后， 菌丝迅速扩展到维管组织， 通过细胞间隙横向发展， 最终， 在愈伤组织、 皮层、 木质部、 管胞或导管等各种类型的细胞中定殖。 该菌有潜伏侵染的特性， 通常作为腐 生菌在土壤中或植物内生菌在健康的植株中存在， 当遇到高温、 积水、 风害等逆境条件时便 开始侵染植株。 因此， 对该类病菌的初侵染源早期进行适时监控， 对于该病害的防控有重要 意义， 传统的病害防控策略主要依靠品种、。

11、 栽培、 化防和生态调控等防治措施， 这些防控措 施主要在病害爆发乃至产生明显危害时才实施， 忽视了对初侵染源早期适时采取综合防控 和高效治理措施， 因而事倍功半， 防效甚微， 最终很难控制病害的发生与流行。 0003 普通PCR技术需要精密变温设备和高级复杂的分析仪器， 或者对操作人员的熟练 度和专业水平要求比较高， 且反应时间长， 不利于基层推广。 自环介导等温扩增技术(loop- mediated isothermal amplification， LAMP)建立以来， 该技术已经广泛应用于对病毒、 细 菌、 寄生虫、 菌物等病原菌的检测研究。 LAMP技术作为一种恒温核酸扩增技术， 其。

12、最大的优 点在于反应速度快、 设备简单， 而且结果易于鉴定， 尤其适用于基层检验检疫机构和医疗机 构。 目前尚未见利用LAMP技术检测蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)的相关 报道。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种检测蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)的 LAMP引物及试剂盒。 0005 本发明的另一目的是提供基于LAMP技术的蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)检测方法。 说明书 1/7 页 4 CN 111041123 A 4 0006 为了实现本发明目的， 第一方面， 本发明提供一种。

13、用于检测蓝莓茎溃疡病病菌 (Botryosphaeria sinensia)的LAMP引物， 所述LAMP引物为(SEQ ID NO： 1-4)： 0007 外侧正向引物F3： 5 -AAGATCGACCGCCGTACC-3 ； 0008 外侧反向引物B3： 5 -GCGACAGTTTGCCTTGGAA-3 ； 0009 内侧正向引物FIP(F1C+F2)： 5 -CACATGGGCTTGGAGGGAATCATCCCCAAGTTCATCAAGTC CG-3 ； 0010 内侧反向引物BIP(B1C+B2)： 5 -CTCTTGGCCGTTTCGCCGTAGCACGATGAAGTTCGGAG-3。

14、 。 0011 第二方面， 本发明提供含有SEQ ID NO： 1-4所示的LAMP引物的检测试剂或试剂盒。 0012 第三方面， 本发明提供蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)检测试剂 盒， 所述试剂盒包含SEQ ID NO： 1-4所示的LAMP引物， 还包含dNTPs、 BstDNA聚合酶、 反应缓 冲液、 标准阳性模板等中的至少一种。 0013 第四方面， 本发明提供SEQ ID NO： 1-4所示的LAMP引物、 含有所述LAMP引物的检测 试剂或试剂盒在检测蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)中的应用。 0014 第五方面。

15、， 本发明提供蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)检测方法， 包括以下步骤： 0015 1)提取待测样品中的DNA； 0016 2)以步骤1)中提取的DNA为模板， 利用SEQ ID NO： 1-4所示的LAMP引物进行LAMP扩 增反应(LAMP-PCR)； 0017 3)扩增结果判定。 0018 其中， 步骤2)所用反应体系为： 0019 0020 0021 ddH2O补足至25 l。 0022 其中， 所述反应体系中引物FIP和BIP按等量加入， 引物F3和B3按等量加入， 且引物 FIP、 BIP与引物F3、 B3的总质量比为8 1。 0023 优选采用如。

16、下反应体系： 说明书 2/7 页 5 CN 111041123 A 5 0024 0025 步骤2)所用反应条件为： 61655090分钟。 优选采用如下反应条件： 6360分 钟， 802分钟。 0026 步骤3)可以采用如下中的任一种方法进行扩增结果判定： 0027 荧光染色法： 向扩增产物中加入染料SYBR Green I， 进行显色反应， 若反应体系 由橙色(橘黄色)变为绿色， 表明待测样品中含有蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)； 或者， 在扩增反应前向反应体系中加入钙黄绿素(Calcein)， 扩增反应结束后， 在紫外灯照射下反应体系显示荧光绿色， 。

17、表明待测样品中含有蓝莓茎溃疡病病菌 (Botryosphaeria sinensia)； 或者， 在扩增反应前向反应体系中加入羟基萘酚蓝(HNB)， 扩 增反应结束后， 若反应体系由紫色变为天蓝色， 表明待测样品中含有蓝莓茎溃疡病病菌 (Botryosphaeria sinensia)； 0028 琼脂糖凝胶电泳法： 若扩增产物在琼脂糖凝胶上呈现特征性梯状条带， 表明待 测样品中含有蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)； 0029 焦磷酸镁浊度检测法： 通过肉眼观察反应后的浑浊情况(或产生乳白色沉淀)来 判断是否发生了LAMP扩增反应， 或利用浊度仪检测其在400。

18、nm处的吸光度， 实现实时定量检 测。 0030 借由上述技术方案， 本发明至少具有下列优点及有益效果： 0031 本发明将LAMP引物恒温扩增技术用于Botryosphaeria sinensia病菌的快速检 测， 可从发病植物组织及苗木中复杂的病原菌环境准确地检测出该致病菌。 该方法的特异 性、 灵敏度及可重复性均较常规PCR方法更高， 检测灵敏度达7.52fg/mL， 对蓝莓茎溃疡病病 菌(Botryosphaeria sinensia)的早期预警、 疫区的病原监测等方面具有重要意义； 同时可 避免高昂的仪器投入， 便于基层推广使用。 附图说明 0032 图1为本发明实施例2中表1涉及真。

19、菌的EF-1 区域的基因序列比对结果。 0033 图2为本发明实施例2和3中LAMP引物的特异性及灵敏度分析结果。 0034 其中， A， B： 引物组1的特异性检测的目测显色检测和琼脂糖凝胶电泳。 18分别为 Botryosphaeria sinensia， Botryosphaeria fabicerciana， Botryosphaeria rosaceae， Neofusicoccum illicii， Neofusicoccum sinense， Lasiodiplodia chinensis， 说明书 3/7 页 6 CN 111041123 A 6 Alternaria alte。

20、rnata， NC(阴性对照)。 0035 C， D： 引物组1的灵敏度目测显色检测和琼脂糖凝胶电泳。 18分别为稀释倍数 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108倍的Botryosphaeria sinensia DNA样品。 0036 E， F： 引物组2的特异性检测的目测显色检测和琼脂糖凝胶电泳。 18分别为 Botryosphaeria sinensia， Botryosphaeria fabicerciana， Botryosphaeria rosaceae， Neofusicoccum illicii， Neofusicoccum sinense。

21、， Lasiodiplodia chinensis， Alternaria alternata， NC(阴性对照)。 0037 G， H： 引物组2的灵敏度目测显色检测和琼脂糖凝胶电泳。 18分别为稀释倍数 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108倍的Botryosphaeria sinensia DNA样品。 0038 I， J： 引物组3的特异性检测的目测显色检测和琼脂糖凝胶电泳。 18分别为 Botryosphaeria sinensia， Botryosphaeria fabicerciana， Botryosphaeria rosaceae， Ne。

22、ofusicoccum illicii， Neofusicoccum sinense， Lasiodiplodia chinensis， Alternaria alternata， NC(阴性对照)。 0039 K， L： 引物组3的灵敏度目测显色检测和琼脂糖凝胶电泳。 18分别为稀释倍数 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108倍的Botryosphaeria sinensia DNA样品。 0040 M， N： 引物组4的特异性检测的目测显色检测和琼脂糖凝胶电泳。 18分别为 Botryosphaeria sinensia， Botryosphaeria。

23、 fabicerciana， Botryosphaeria rosaceae， Neofusicoccum illicii， Neofusicoccum sinense， Lasiodiplodia chinensis， Alternaria alternata， NC(阴性对照)。 0041 其中， 琼脂糖凝胶电泳图中M为DL 2000 DNA Marker。 0042 图3为本发明实施例4中LAMP引物组1的田间患病病株检测实验。 其中， A： 患病病株 病斑； B： LAMP引物组1的检测结果(1为反应结果阳性， 2为反应结果阴性)。 具体实施方式 0043 以下实施例用于说明本发明， 。

24、但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明， 实施例 均按照常规实验条件， 如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW， MolecularCloning： aLaboratoryManual， 2001)， 或按照制造厂商说明书建议的条件。 0044 实施例1用于检测蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)的LAMP引物的 设计与合成 0045 对于Botryosphaeria而言， 翻译延长因子(elongation factors， EF)基因具有较 高的变异速率， 因此选择将EF基因用于种水平的鉴定和分子系统学研究。 0046 。

25、根据蓝莓茎溃疡病病菌(Botryosphaeria sinensia)EF-1 区域的基因序列(图 1)， 分别设计了三组用于检测Botryosphaeria sinensia的LAMP引物， 包括： 0047 引物组1： 0048 外侧正向引物F3： 5 -AAGATCGACCGCCGTACC-3 ； 0049 外侧反向引物B3： 5 -GCGACAGTTTGCCTTGGAA-3 ； 0050 内侧正向引物FIP： 5 -CACATGGGCTTGGAGGGAATCATCCCCAAGTTCATCAAGTCCG-3 ； 0051 内侧反向引物BIP： 5 -CTCTTGGCCGTTTCGCCGT。

26、AGCACGATGAAGTTCGGAG-3 。 0052 引物组2： 说明书 4/7 页 7 CN 111041123 A 7 0053 外侧正向引物F3： 5 -GTCCATTGAGAACAACCCCA-3 ； 0054 外侧反向引物B3： 5 -GGCGACAGTTTGCCTTGG-3 ； 0055 内侧正向引物FIP： 5 -GCACATGGGCTTGGAGGGAAGTTCATCAAGTCCGGTGAC-3 ； 0056 内侧反向引物BIP： 5 -TACCCCCCTCTTGGCCGTTTGCACGATGAAGTTCGGAGAA-3 。 0057 引物组3： 0058 外侧正向引物F3：。

27、 5 -AAGATCGACCGCCGTACC-3 ； 0059 外侧反向引物B3： 5 -GCGACAGTTTGCCTTGGAA-3 ； 0060 内侧正向引物FIP： 5 -CACATGGGCTTGGAGGGAATCACCCCAAGTTCATCAAGTCCG-3 ； 0061 内侧反向引物BIP： 5 -TACCCCCCTCTTGGCCGTTTAGCACGATGAAGTTCGGAG-3 。 0062 引物合成由深圳华大基因科技有限公司完成。 0063 实施例2 LAMP引物检测Botryosphaeria sinensia的特异性分析 0064 1.1试剂和设备 0065 LAMP-PCR试。

28、剂盒购自广州华峰公司。 0066 1.2样本来源 0067 本实施例中采用的Botryosphaeria sinensia， Botryosphaeria fabicerciana， Botryosphaeria rosaceae， Neofusicoccum illicii， Neofusicoccum sinense， Lasiodiplodia chinensis， Alternaria alternata等(表1)保存于中国科学院微生物研究 所真菌学国家重点实验室。 这些菌种是公众可以得到的， 无需进行保藏。 0068 表1中涉及真菌的EF-1 区域的基因序列比对结果见图1。 0069。

29、 表1用于LAMP-PCR检测的样本来源 0070 说明书 5/7 页 8 CN 111041123 A 8 0071 1.3 DNA提取 0072 使用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取植 物组织DNA， 提取健康蓝莓茎的DNA为对照。 0073 供试菌株在MEA培养基上于25培养3-5天， 用CTAB法提取菌丝DNA， DNA于-20保 存备用。 0074 1.4 LAMP-PCR反应 0075 反应体系(25 l)： 0076 0077 LAMP-PCR反应条件为： 6360分钟， 802分钟。 0078 1.5显色反应 0079 反应结束后， 向1。

30、.4所得反应体系中加入6 l的1000SYBR Green I进行显色反 应 ， 根 据反 应 体 系颜 色的 变 化 ， 判定 待 测样品 中 是 否 含 有 蓝 莓 茎 溃 疡 病 病菌 (Botryosphaeria sinensia)。 0080 1.6结果 0081 图2A为LAMP引物组1恒温扩增反应体系肉眼目测效果， 管1为Botryosphaeria sinensia病菌， 反应体系显示荧光绿色， 管2-7分别为Botryosphaeria fabicerciana， Botryosphaeria rosaceae， Neofusicoccum illicii， Neofusi。

31、coccum sinense， Lasiodiplodia chinensis， Alternaria alternata， 反应体系均显示橘黄色。 管NC为阴性 对照。 该结果表明本发明引物组的特异性强。 0082 对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳， 图2B为本发明LAMP引物组1恒温扩增结果； 其中， 泳道1为Botryosphaeria sinensia病菌， 扩增出梯状条带， 泳道2-7分别为 Botryosphaeria fabicerciana， Botryosphaeria rosaceae， Neofusicoccum illicii， Neofusicoccum sinens。

32、e， Lasiodiplodia chinensis， Alternaria alternata， 同属其他种 以及葡萄座腔菌科其它真菌不产生条带， NC为阴性对照。 0083 对比引物组2(图2E和图2F)、 引物组3(图2I和图2J)的特异性检测结果， 对比显示， 三组引物组的特异性均较高， 检测效果很好。 0084 实施例3 LAMP引物组检测Botryosphaeria sinensia的灵敏度分析 0085 1.1 DNA样品浓度： 0086 用NanoDrop(赛默飞世尔科技公司)检测实施例2中提取的Botryosphaeria 说明书 6/7 页 9 CN 111041123 A。

33、 9 sinensia样品的DNA浓度， 为9.4 g/ml。 0087 1.2 LAMP引物组灵敏度检测： 0088 将DNA样品进行10倍梯度稀释， 取101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108倍稀释的DNA样 品进行LAMP恒温扩增反应。 反应体系及反应条件同实施例2。 0089 1.3结果： 0090 图2C为LAMP引物组1恒温扩增反应体系肉眼目测效果， 反应管1-8分别为 Botryosphaeria sinensia病菌从101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108倍稀释的样品， 反应管 1-5反应体系显示荧光绿色。

34、， 反应管6-8反应体系显示橘黄色。 图2M为本发明LAMP引物组1恒 温扩增反应体系肉眼目测效果重复实验， 其中反应管1-5反应体系显示荧光绿色， 反应管6- 8反应体系显示橘黄色。 实验结果稳定。 该结果表明本发明引物组可直接检测到稀释至105 倍的DNA。 0091 对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳， 电泳检测结果如图2D所示， LAMP能够检测 出稀释105倍的DNA样品。 当DNA样品稀释至105倍以上时， 则无法确保检出。 因此， 本引物组的 灵敏度可达7.52fg/mL， 即可检出样品中约188fg的Botryosphaeria sinensia DNA。 图2N为 本发明LAM。

35、P引物组1恒温扩增反应所得扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳的重复实验结果。 0092 对比引物组2(图2G和图2H)、 引物组3(图2K和图2L)的灵敏度检测结果， 对比显示， 引物组1的灵敏度最高， 检测效果最好。 0093 实施例4利用LAMP引物组1检测感染Botryosphaeria sinensia的发病组织 0094 1.1蓝莓茎溃疡病患病组织DNA的提取 0095 将供试Botryosphaeria sinensia菌转至MEA培养基平板上， 25黑暗培养2-3天 后， 用打孔器从菌落边缘取菌落块(1cm1cm)， 针刺接种于蓝莓(四年生)茎部， 接种7天后， 发病效果如图3A所示。 。

36、然后切取发病组织， 使用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒(北京 艾德莱生物科技有限公司)提取患病组织DNA： 取一段适量的病茎， 经液氮冷冻充分研磨成 粉末后使用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒提取患病植物病斑及病健交界处组织DNA。 提取出的DNA用于LAMP-PCR扩增。 0096 按相同方法提取健康蓝莓茎的DNA为空白对照。 0097 1.2 LAMP引物组对Botryosphaeria sinensia病菌回接组织检测 0098 LAMP-PCR反应体系、 反应条件、 反应结果检测方法同实施例2。 0099 1.3结果 0100 LAMP引物组恒温扩增反应体系显色反应目测效。

37、果如图3B所示， 管1为感染了 Botryosphaeria sinensia病菌的病株样品， 反应体系呈现出荧光绿色， 显示反应为阳性； 管2为健康植株对照， 呈现橘黄色， 显示反应为阴性。 该结果表明本发明引物组的特异性强， 可直接用于田间病害的检测。 0101 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之做一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说明书 7/7 页 10 CN 111041123 A 10 序列表 北京林业大学 。

38、检测Botryosphaeria sinensia的LAMP引物及试剂盒 PI201960602 4 SIPOSequenceListing 1.0 1 18 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 1 aagatcgacc gccgtacc 18 2 19 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 2 gcgacagttt gccttggaa 19 3 43 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 3 cacatgggct tggagggaat catccccaag ttcatcaagt ccg 43 4 38 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 4 ctcttggccg tttcgccgta gcacgatgaa gttcggag 38 序列表 1/1 页 11 CN 111041123 A 11 图1 说明书附图 1/3 页 12 CN 111041123 A 12 图2 说明书附图 2/3 页 13 CN 111041123 A 13 图3 说明书附图 3/3 页 14 CN 111041123 A 14 。