酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010167898.7 (22)申请日 2020.03.11 (71)申请人 陕西科技大学 地址 710021 陕西省西安市未央区大学园 (72)发明人 李道明刘看看刘宁崔俊杰 (74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任 公司 61200 代理人 张海平 (51)Int.Cl. C12P 7/64(2006.01) (54)发明名称 一种酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法 (57)摘要 本发明公开了一种酶法制备甘油单酯型n-3 PUFA的方法， 属于酶的分离与应用技。

2、术领域。 首 先采用甘油三酯脂肪酶催化富含n-3PUFA的油 脂制备甘油单酯， 随后采用甘油单酯脂肪酶选择 性催化甘油单酯适度水解制备甘油单酯型n-3 PUFA， 反应结束后， 离心分离上层油相， 分子蒸馏 纯化后， 收集馏出物即为甘油单酯型n-3PUFA。 该方法操作简单、 反应时间短、 速率快， 产物的含 量和回收率均较高， 且反应过程中酶和有机溶剂 均可反复利用， 节能环保， 经济效益高。 权利要求书1页 说明书4页 CN 111172209 A 2020.05.19 CN 111172209 A 1.一种酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 步骤1： 。

3、在有机溶剂中， 采用固定化甘油三酯脂肪酶催化含n-3PUFA的油脂进行甘油解 反应， 反应结束后， 回收有机溶剂并离心收集上层油相； 步骤2： 向步骤1得到的上层油相中加入缓冲液和甘油单酯脂肪酶选择性催化甘油单酯 进行适度水解反应， 反应结束后， 离心收集上层油相； 步骤3： 将步骤2得到的上层油相进行分子蒸馏纯化， 收集馏出物， 得到甘油单酯型n- 3PUFA。 2.根据权利要求1所述的酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法， 其特征在于， 步骤1中， 固定化甘油三酯脂肪酶为Novozym 435或Lipozyme 435。 3.根据权利要求1所述的酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法， 。

4、其特征在于， 步骤1中， 有机溶剂为叔丁醇或叔戊醇。 4.根据权利要求1所述的酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法， 其特征在于， 步骤1中， 固定化甘油三酯脂肪酶的添加量为底物油总质量的510， 甘油与含n-3PUFA的油脂的摩 尔比为5:1， 有机溶剂的添加量为底物总质量的23倍量mL/g。 5.根据权利要求1所述的酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法， 其特征在于， 步骤1中的 反应， 是在4060的反应温度、 300500rpm的搅拌速度下反应26h。 6.根据权利要求1所述的酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法， 其特征在于， 步骤2中， 甘油单酯脂肪酶为MGLP II， 甘油。

5、单酯脂肪酶的用量为200300U/g底物质量。 7.根据权利要求1所述的酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法， 其特征在于， 步骤2中， 缓冲液为pH9.0的Tris-HCl缓冲液， 缓冲液加入量为步骤1得到的上层油相质量的30 100wt。 8.根据权利要求1所述的酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法， 其特征在于， 步骤2中， 反应温度为4060， 反应时间为0.52h。 9.根据权利要求1所述的酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法， 其特征在于， 步骤3中， 分子蒸馏纯化的反应条件为： 进料温度60， 进料速度12mL/min， 冷凝温度3540， 一 级蒸发面温度110， 二级蒸。

6、发面温度160， 刮膜电机转速250270rpm。 10.根据权利要求1所述的酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法， 其特征在于， 步骤3中， 一级分子蒸馏的操作压强20Pa， 二级分子蒸馏的操作压强5Pa。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111172209 A 2 一种酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法 技术领域 0001 本发明属于酶的分离与应用技术领域， 具体涉及一种酶法制备甘油单酯型n- 3PUFA的方法。 背景技术 0002 流行病学和临床研究表明， n-3PUFA(n-3Polyunsaturated fatty acids)如EPA、 DPA和DHA等在人体健康中起着重。

7、要作用。 研究表明， EPA和DHA可降低患冠心病的风险并有 助于大脑、 神经和视网膜的发育。 通常， n-3PUFA主要以游离脂肪酸、 脂肪酸乙酯、 甘油三酯 和磷脂等形式存在。 研究表明， 相比于游离脂肪酸型、 甘油三酯型和脂肪酸乙酯型， n-3PUFA 以甘油单酯型存在时具有更高的生物利用度。 作为n-3PUFA的良好载体， 长期以来， 甘油单 酯型n-3PUFA的制备一直是研究的热点。 0003 由于n-3PUFA高温易发生氧化和异构化， 因此， 通常采用反应条件温和、 催化特异 性高和环保的生物酶法制备甘油单酯型n-3PUFA。 目前， 酶法甘油解和酶法醇解常被用来制 备甘油单酯型n。

8、-3PUFA。 Solaesa等(Food Chem.,2016,190:960-967)采用酶法甘油解制备 甘油单酯型n-3PUFA， 产物中甘油单酯含量和回收率均高于90， 但产物单甘酯中n-3PUFA 含量低于30； He等(Bioresource Technol.,2016,219:466-478； Bioresource Technol., 2017,224:445-456； Food Chem.,2017,219:230-239)采用酶法醇解制备甘油单酯型n- 3PUFA， 反应48h后， 产物单甘酯中n-3PUFA含量高于90， 但n-3PUFA回收率仅为40。 总体 而言， 现。

9、有酶法制备甘油单酯型n-3PUFA时难以同时制备得到高n-3PUFA含量和高n-3PUFA 回收率的甘油单酯型n-3PUFA。 发明内容 0004 为了解决上述现有技术中存在的缺陷， 本发明的目的在于提供一种酶法制备甘油 单酯型n-3PUFA的方法， 操作简单、 反应时间短、 速率快， 产物的含量和回收率均较高。 0005 本发明是通过以下技术方案来实现： 0006 一种酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法， 包括以下步骤： 0007 步骤1： 在有机溶剂中， 采用固定化甘油三酯脂肪酶催化含n-3PUFA的油脂进行甘 油解反应， 反应结束后， 回收有机溶剂并离心收集上层油相； 0008 步骤。

10、2： 向步骤1得到的上层油相中加入缓冲液和甘油单酯脂肪酶选择性催化甘油 单酯进行适度水解反应， 反应结束后， 离心收集上层油相； 0009 步骤3： 将步骤2得到的上层油相进行分子蒸馏纯化， 收集馏出物， 得到甘油单酯型 n-3PUFA。 0010 优选地， 步骤1中， 固定化甘油三酯脂肪酶为Novozym 435或Lipozyme435。 0011 优选地， 步骤1中， 有机溶剂为叔丁醇或叔戊醇。 0012 优选地， 步骤1中， 固定化甘油三酯脂肪酶的添加量为底物油总质量的510， 甘 油与含n-3PUFA的油脂的摩尔比为5:1， 有机溶剂的添加量为底物总质量的23倍量mL/g。 说明书 1。

11、/4 页 3 CN 111172209 A 3 0013 优选地， 步骤1中的反应， 是在4060的反应温度、 300500rpm的搅拌速度下反 应26h。 0014 优选地， 步骤2中， 甘油单酯脂肪酶为MGLP II， 甘油单酯脂肪酶的用量为200 300U/g底物质量。 0015 优选地， 步骤2中， 缓冲液为pH9.0的Tris-HCl缓冲液， 缓冲液加入量为步骤1得 到的上层油相质量的30100wt。 0016 优选地， 步骤2中， 反应温度为4060， 反应时间为0.52h。 0017 优选地， 步骤3中， 分子蒸馏纯化的反应条件为： 进料温度60， 进料速度12mL/ min， 。

12、冷凝温度3540， 一级蒸发面温度110， 二级蒸发面温度160， 刮膜电机转速250 270rpm。 0018 优选地， 步骤3中， 一级分子蒸馏的操作压强20Pa， 二级分子蒸馏的操作压强 5Pa。 0019 与现有技术相比， 本发明具有以下有益的技术效果： 0020 本发明公开的酶法制备甘油单酯型n-3PUFA的方法， 首先采用甘油三酯脂肪酶催 化富含n-3PUFA的油脂制备甘油单酯， 随后采用甘油单酯脂肪酶选择性催化甘油单酯适度 水解制备甘油单酯型n-3PUFA， 反应结束后， 离心分离上层油相， 分子蒸馏纯化后， 收集馏出 物即为甘油单酯型n-3PUFA。 甘油单酯脂肪酶MGLP I。

13、I催化不同碳链长甘油单酯发生水解反 应时， 对中碳链(C8-C12)甘油单酯和长碳链(C14-C18)甘油单酯具有较高的活性， 而对EPA、 DPA和DHA这类超长碳链的n-3PUFA的特异性却较差， 因而将其应用于水解富含n-3PUFA的甘 油单酯时， 通过控制适度水解可将n-3PUFA富集于甘油单酯中。 该方法操作简单、 反应时间 短、 速率快， 产物的含量和回收率均较高， 且反应过程中的酶和有机溶剂均可反复利用， 节 能环保， 经济效益高。 0021 进一步地， 固定化甘油三酯脂肪酶采用Novozym 435或Lipozyme 435， 可更高效地 催化含n-3PUFA的油脂转化生成甘油。

14、单酯。 0022 进一步地， 有机溶剂采用叔丁醇或叔戊醇， 可有效促进底物含n-3PUFA的油脂和甘 油充分混合， 且可保持固定化甘油三酯脂肪酶具有较高的操作稳定性。 0023 进一步地， 固定化甘油三酯脂肪酶的添加量为底物油总质量的510wt， 甘油 与含n-3PUFA的油脂的摩尔比为5:1， 有机溶剂的添加量为底物总质量的23倍量mL/g， 可 有效确保底物充分混匀， 在保证较高反应速率的前提下尽可能降低制备成本。 0024 进一步地， 步骤1是在4060的反应温度、 300500rpm的搅拌速度下反应2 6h， 可高效促进含n-3PUFA的油脂转化生成甘油单酯， 且可有效避免n-3PUF。

15、A氧化。 0025 进一步地， 甘油单酯脂肪酶采用MGLP II， 甘油单酯脂肪酶的用量为200300U/g 底物质量， 可特异性催化中、 长链甘油单酯水解， 确保产物单甘酯中n-3PUFA含量和回收率 高， 且可在保证较高反应速率的前提下尽可能降低制备成本。 0026 进一步地， 缓冲液采用pH9.0的Tris-HCl缓冲液， 缓冲液加入量为步骤1得到的 上层油相质量的30100wt， 可更有效促进中、 长链甘油单酯特异性水解。 0027 进一步地， 步骤2的反应温度为4060， 反应时间为0.52h， 可高效促进中、 长 链甘油单酯特异性水解， 且可有效避免n-3PUFA氧化。 0028 。

16、进一步地， 步骤3的参数， 可确保甘油单酯型n-3PUFA的较高回收率。 说明书 2/4 页 4 CN 111172209 A 4 0029 进一步地， 一级分子蒸馏的操作压强20Pa， 二级分子蒸馏的操作压强5Pa， 可 有效避免n-3PUFA氧化。 具体实施方式 0030 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明， 所述是对本发明的解释而 不是限定。 0031 含有n-3PUFA的油脂一般为海洋鱼油、 藻油或其混合物。 0032 实施例1 0033 准确称取100g鳀鱼油和50g甘油置于1L具塞锥形瓶中， 加入250mL叔丁醇， 并震荡 混匀； 将上述锥形瓶置于50的恒温气浴摇床中，。

17、 转速设置为300rpm； 加入5g Novozym 435 后反应开始计时； 反应6h后， 过滤回收Novozym 435， 减压蒸馏回收叔丁醇， 随后离心收集上 层油相； 液相色谱分析结果显示上层油相中含76.31的甘油单酯。 回收固定化酶， 并用正 己烷冲洗2次， 在室温下挥干正己烷后可直接应用于下个批次的反应。 取50g上述油相置于 250mL的具塞锥形瓶中， 加入15mL pH 9.0的Tris-HCl缓冲液， 将上述锥形瓶置于40的恒 温气浴摇床中， 转速设置为400rpm， 加入200U/g(U/w， 相对于底物油的质量)MGLP II后反应 开始计时， 反应2h后， 离心分离上。

18、层油相和下层水相， 收集得到的下层水相可直接应用于下 一批次的反应。 分析油相产物甘油单酯中n-3PUFA含量并计算n-3PUFA回收率， 结果显示所 得甘油单酯中n-3PUFA含量为83.77， n-3PUFA回收率为87.44。 最后， 采用二级分子蒸馏 对油相产物进行纯化， 收集馏出物， 分析显示馏出物中甘油单酯含量为94.56， 甘油单酯 中n-3PUFA含量为84.34， n-3PUFA回收率为83.01。 收集的固定化酶和下层水相分别连 续使用10个批次后， 酶活力均没有显著降低。 0034 实施例2 0035 准确称取100g鳀鱼油和50g甘油置于1L具塞锥形瓶中， 加入200m。

19、L叔戊醇， 并震荡 混匀； 将上述锥形瓶置于60的恒温气浴摇床中， 转速设置为500rpm； 加入10g Novozym 435后反应开始计时； 反应2h后， 过滤回收Novozym 435， 减压蒸馏回收叔戊醇， 随后离心收 集上层油相； 液相色谱分析结果显示上层油相中含78.88的甘油单酯。 回收固定化酶， 并 用正己烷冲洗2次， 在室温下挥干正己烷后可直接应用于下个批次的反应。 取50g上述油相 置于250mL的具塞锥形瓶中， 加入25mL pH 9.0的Tris-HCl缓冲液， 将上述锥形瓶置于50 的恒温气浴摇床中， 转速设置为400rpm， 加入300U/g(U/w， 相对于底物油。

20、的质量)MGLP II后 反应开始计时， 反应0.5h后， 离心分离上层油相和下层水相， 收集得到的下层水相可直接应 用于下一批次的反应。 分析油相产物甘油单酯中n-3PUFA含量并计算n-3PUFA回收率， 结果 显示所得甘油单酯中n-3PUFA含量为82.68， n-3PUFA回收率为88.95。 最后， 采用二级分 子蒸馏对油相产物进行纯化， 收集馏出物， 分析显示馏出物中甘油单酯含量为95.21， 甘 油单酯中n-3PUFA含量为82.25， n-3PUFA回收率为83.87。 收集的固定化酶和下层水相 分别连续使用10个批次后， 酶活力均没有显著降低。 0036 实施例3 0037 。

21、准确称取100g鳀鱼油和50g甘油置于1L具塞锥形瓶中， 加入300mL叔丁醇， 并震荡 混匀； 将上述锥形瓶置于40的恒温气浴摇床中， 转速设置为400rpm； 加入7.5g Lipozyme 435后反应开始计时； 反应6h后， 过滤回收Lipozyme 435， 减压蒸馏回收叔丁醇， 随后离心收 说明书 3/4 页 5 CN 111172209 A 5 集上层油相； 液相色谱分析结果显示上层油相中含77.62的甘油单酯。 回收固定化酶， 并 用正己烷冲洗2次， 在室温下挥干正己烷后可直接应用于下个批次的反应。 取50g上述油相 置于250mL的具塞锥形瓶中， 加入50mL pH 9.0的。

22、Tris-HCl缓冲液， 将上述锥形瓶置于45 的恒温气浴摇床中， 转速设置为400rpm， 加入250U/g(U/w， 相对于底物油的质量)MGLP II后 反应开始计时， 反应1h后， 离心分离上层油相和下层水相， 收集得到的下层水相可直接应用 于下一批次的反应。 分析油相产物甘油单酯中n-3PUFA含量并计算n-3PUFA回收率， 结果显 示所得甘油单酯中n-3PUFA含量为82.16， n-3PUFA回收率为89.14。 最后， 采用二级分子 蒸馏对油相产物进行纯化， 收集馏出物， 分析显示馏出物中甘油单酯含量为94.56， 甘油 单酯中n-3PUFA含量为81.88， n-3PUFA。

23、回收率为83.65。 收集的固定化酶和下层水相分 别连续使用10个批次后， 酶活力均没有显著降低。 0038 实施例4 0039 准确称取100金枪鱼油和50g甘油置于1L具塞锥形瓶中， 加入250mL叔丁醇， 并震荡 混匀； 将上述锥形瓶置于50的恒温气浴摇床中， 转速设置为400rpm； 加入10g Lipozyme 435后反应开始计时； 反应2h后， 过滤回收Lipozyme 435， 减压蒸馏回收叔丁醇， 随后离心收 集上层油相； 液相色谱分析结果显示上层油相中含75.78的甘油单酯。 回收固定化酶， 并 用正己烷冲洗2次， 在室温下挥干正己烷后可直接应用于下个批次的反应。 取50g。

24、上述油相 置于250mL的具塞锥形瓶中， 加入20mL pH 9.0的Tris-HCl缓冲液， 将上述锥形瓶置于60 的恒温气浴摇床中， 转速设置为400rpm， 加入200U/g(U/w， 相对于底物油的质量)MGLP II后 反应开始计时， 反应50min后， 离心分离上层油相和下层水相， 收集得到的下层水相可直接 应用于下一批次的反应。 分析油相产物甘油单酯中n-3PUFA含量并计算n-3PUFA回收率， 结 果显示所得甘油单酯中n-3PUFA含量为85.15， n-3PUFA回收率为87.43。 最后， 采用二级 分子蒸馏对油相产物进行纯化， 收集馏出物， 分析显示馏出物中甘油单酯含量。

25、为94.10， 甘油单酯中n-3PUFA含量为84.87， n-3PUFA回收率为82.75。 收集的固定化酶和下层水 相分别连续使用10个批次后， 酶活力均没有显著降低。 0040 实施例5 0041 准确称取100金枪鱼油和50g甘油置于1L具塞锥形瓶中， 加入200mL叔戊醇， 并震荡 混匀； 将上述锥形瓶置于50的恒温气浴摇床中， 转速设置为400rpm； 加入7.5g Novozym 435后反应开始计时； 反应4h后， 过滤回收Novozym 435， 减压蒸馏回收叔戊醇， 随后离心收 集上层油相； 液相色谱分析结果显示上层油相中含77.01的甘油单酯。 回收固定化酶， 并 用正己。

26、烷冲洗2次， 在室温下挥干正己烷后可直接应用于下个批次的反应。 取50g上述油相 置于250mL的具塞锥形瓶中， 加入50mL pH 9.0的Tris-HCl缓冲液， 将上述锥形瓶置于50 的恒温气浴摇床中， 转速设置为400rpm， 加入200U/g(U/w， 相对于底物油的质量)MGLP II后 反应开始计时， 反应1h后， 离心分离上层油相和下层水相， 收集得到的下层水相可直接应用 于下一批次的反应。 分析油相产物甘油单酯中n-3PUFA含量并计算n-3PUFA回收率， 结果显 示所得甘油单酯中n-3PUFA含量为84.22， n-3PUFA回收率为88.54。 最后， 采用二级分子 蒸馏对油相产物进行纯化， 收集馏出物， 分析显示馏出物中甘油单酯含量为95.52， 甘油 单酯中n-3PUFA含量为83.96， n-3PUFA回收率为83.46。 收集的固定化酶和下层水相分 别连续使用10个批次后， 酶活力均没有显著降低。 说明书 4/4 页 6 CN 111172209 A 6 。