任清芽孢杆菌新菌种及其应用.pdf

《任清芽孢杆菌新菌种及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《任清芽孢杆菌新菌种及其应用.pdf（12页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010099947.8 (22)申请日 2020.02.18 (83)生物保藏信息 CGMCC NO. 1.17385 2019.12.30 (71)申请人 北京工商大学 地址 100037 北京市海淀区阜成路33号 (72)发明人 任清徐嘉良孙占斌闫怡 孙乐平邢旋 (74)专利代理机构 北京知呱呱知识产权代理有 限公司 11577 代理人 杜立军 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/02(2006.01) C12G 3/02(201。

2、9.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 任清芽孢杆菌新菌种及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)， 于2019年12月30日， 保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保 藏地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国 科学院微生物研究所， 其保藏编号为CGMCC NO.1.17385。 本发明提供一株新菌种任清芽孢杆 菌(Bacillusrenqingensis)， 该菌株分离自酿 酒窖泥， 其能够产生酱香风味物质， 可用于发酵 酿酒。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图2页 C。

3、N 111172079 A 2020.05.19 CN 111172079 A 1.任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)， 其保藏编号为CGMCC NO.1.17385。 2.权利要求1所述的任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)或其发酵产物或其培养 产物在酿酒过程中生产风味物质的应用。 3.含权利要求1或2所述的任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)的微生物菌剂。 4.权利要求1所述的任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)筛选培养方法， 其特征在 于包括将窖泥稀释后涂布于高糖筛选培养基上， 筛选培养得到所述任清。

4、芽孢杆菌 (Bacillus renqingensis)。 5.如权利要求4所述的筛选培养方法， 其特征在于， 所述高糖筛选培养基包括以下质量份数的原料： 葡萄糖0.5-2份、 麦芽糖1-2.5份、 阿拉 伯糖0.5-1份、 果糖0.5-1.5份、 木糖0.5-1.5份、 核糖0.5-1.5份、 半乳糖0.5-1.5份、 甘露糖 0.5-1.5份、 蔗糖1.5-2份、 果胶0.1-1份、 淀粉0.1-1份、 甘油0.1-1份、 胰蛋白胨1-10份、 酵母 浸粉1-10份、 琼脂15-25份、 去离子水800-1200份。 6.如权利要求4所述的筛选培养方法， 其特征在于， 所述任清芽孢杆菌(B。

5、acillus renqinensis)培养的最适培养基包括以下质量份数的 原料： 蛋白胨10份、 牛肉粉3份、 氯化钠5份、 琼脂15份、 去离子水1000份。 7.如权利要求4所述的筛选培养方法， 其特征在于， 所述筛选培养的时间为45-55h。 8.如权利要求4所述的筛选培养方法， 其特征在于， 所述筛选培养的温度为35-40。 9.如权利要求4所述的筛选培养方法， 其特征在于， 所述筛选培养过程中， 划线筛选培养3次。 10.权利要求1所述的任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)在如下a)或b)中的应 用： a)产生酱香风味物质； b)制备产生酱香风味白酒的微生物菌。

6、剂。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111172079 A 2 任清芽孢杆菌新菌种及其应用 技术领域 0001 本发明涉及微生物技术领域， 具体涉及一种任清芽孢杆菌新菌种及其应用。 背景技术 0002 发酵酿酒技术领域， 首先， 以大麦、 小麦和豌豆等原料， 经过天然发酵制备酒曲； 其 次， 高粱等谷物经过蒸煮后， 加酒曲发酵， 最后蒸馏而得白酒。 传统白酒是以富含淀粉质的 粮谷类为原料， 以中国酒曲为糖化发酵剂， 采用固态、 半固态或液态发酵， 经蒸馏、 贮存和勾 调而成的含酒精的饮料。 发酵酿造过程就是粮食被酒曲和窖泥中的微生物发酵转化而合成 乙醇和风味物质的过程， 其中， 各种各样微。

7、生物是发酵酿酒的关键， 酱香型和浓香型白酒的 品质与窖泥微生物密切相关， 酱香型和浓香型白酒经由窖池中发酵酿造， 窖泥中含有丰富 的微生物， 不同的酒厂， 窖泥中微生物千差万别， 因而形成了风味品质各异的各种品牌的白 酒。 0003 其中， 窖泥是我国传统酿酒工艺特有的材料， 含有丰富的微生物菌群， 但是大部分 很难培养， 甚至处于不可培养的状态。 目前， 通常采用常规的培养基进行靶向分离筛选， 比 如， 通常采用LB培养基分离筛选芽孢杆菌类细菌， 这样会导致常见的细菌迅速繁殖生长， 抑 制一些难培养新的微生物的繁殖生长， 以至很难分离筛选出新的微生物。 微生物在不同环 境中的可培养性虽有不同。

8、， 但都很低， 如海水中为0.1以下， 在土壤中约为0.3。 使用传 统的细菌培养方法仅能培养自然生境中的一小部分细菌。 发明内容 0004 为此， 本发明的目的是提供一株任清芽孢杆菌新菌种及其应用。 0005 为了实现上述目的， 本发明提供如下技术方案： 0006 任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)， 其保藏编号为CGMCC NO.1.17385。 0007 任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)或其发酵产物或其培养产物在酿酒过程 中生产风味物质的应用。 0008 含上述所述的任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)的微生物菌剂，。

9、 也是本发 明的保护范围。 0009 本发明还提供所述的任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)筛选培养方法， 其 包括将窖泥稀释后涂布于高糖筛选培养基上， 筛选培养得到所述任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)。 0010 优选的， 所述高糖筛选培养基包括以下质量份数的原料： 葡萄糖0.5-2份、 麦芽糖 1-2.5份、 阿拉伯糖0.5-1份、 果糖0.5-1.5份、 木糖0.5-1.5份、 核糖0.5-1.5份、 半乳糖0.5- 1.5份、 甘露糖0.5-1.5份、 蔗糖1.5-2份、 果胶0.1-1份、 淀粉0.1-1份、 甘油0.1-1份、 胰蛋白。

10、 胨1-10份、 酵母浸粉1-10份、 琼脂15-25份、 去离子水800-1200份。 0011 优选的， 所述任清芽孢杆菌(Bacillus renqinensis)培养的最适培养基包括以下 质量份数的原料： 蛋白胨10份、 牛肉粉3份、 氯化钠5份、 琼脂15份、 去离子水1000份。 说明书 1/7 页 3 CN 111172079 A 3 0012 优选的， 所述筛选培养的时间为45-55h。 0013 优选的， 所述筛选培养的温度为35-40。 0014 优选的， 所述筛选培养过程中， 划线筛选培养3次。 0015 本发明另一方面还要求保护任清芽孢杆菌(Bacillus renqi。

11、ngensis)在如下a)或 b)中的应用： 0016 a)产生酱香风味物质； 0017 b)制备产生酱香风味白酒的微生物菌剂。 0018 本发明具有如下优点： 0019 试验证明， 本发明提供一株新菌种任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)， 该菌 株分离字酿酒窖泥， 其能够产生酱香风味物质， 可用于发酵酿酒。 0020 菌种保藏说明： 本发明的任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)， 于2019年12月 30日， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏地址： 北京市朝阳区北 辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所， 其保藏编号为。

12、CGMCC NO.1.17385。 附图说明 0021 为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案， 下面将对实施方 式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。 显而易见地， 下面描述中的附图仅 仅是示例性的， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据 提供的附图引伸获得其它的实施附图。 0022 图1为本发明提供的任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)透射电镜照片图； 0023 图2为本发明提供的任清芽孢杆菌极性酯检测结果图； 0024 图3为本发明提供的任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)16S rD。

13、NA序列及进 化树图。 具体实施方式 0025 以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式， 熟悉此技术的人士可由本说明 书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效， 显然， 所描述的实施例是本发明一 部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做 出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。 0026 实施例1、 任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)的分离与鉴定 0027 一、 任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)的分离 0028 本发明的任清芽孢杆菌(Bacillus renqi。

14、ngensis)四川一酿制白酒的酒厂的白酒 窖泥中筛选培养分离， 具体筛选培养分离方法过程如下： 0029 取窖泥10g， 用无菌蒸馏水稀释至10-5， 涂布于高糖培养基培养皿上37好氧培养； 其中， 高糖培养基的配方为： 葡萄糖1g、 麦芽糖1.8g、 阿拉伯糖0.75g、 果糖(左旋)0.9g、 木糖 0.75g、 核糖0.75g、 半乳糖0.9g、 甘露糖0.9g、 蔗糖1.7g、 果胶0.5g、 淀粉0.5g、 甘油0.46g、 胰 蛋白胨5g、 酵母浸粉5g、 1000ml去离子水。 在高糖筛选培养基上， 37好氧培养48h后挑取单 菌落， 三区划线分离纯化3次， 得到分离纯化的纯培。

15、养细菌， 分离第一步设计采用高糖培养 基， 常见的细菌繁殖较慢， 同一培养皿上， 难培养新的芽孢杆菌属细菌生长较快， 受常规微 说明书 2/7 页 4 CN 111172079 A 4 生物影响小。 0030 提取该纯化的细菌DNA， 利用PCR技术扩增16S rDNA序列， 扩增的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示， 通过序列比对， 对该新菌种进行全基因组测序， 最终， 确定该细菌为革兰氏阳 性菌， 芽孢杆菌属， 将该新菌株命名为： 任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)， 其中， 本 发明的任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)的最适培养方法为：。

16、 将分离得到的任清芽 孢杆菌选择最适培养基配方： 蛋白胨10g、 牛肉粉3g、 氯化钠5g、 琼脂15g、 1000mL去离子水。 将任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)接种到培养基上， 37， 好氧或兼性条件下培 养， 得到任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)培养产物。 0031 二、 任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)的鉴定 0032 任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)， 对菌种的进行形态学、 生理生化、 细胞 化学及基因水平研究。 0033 1、 菌株的细胞形态及生理生化特征检测 0034 菌株的。

17、生长温度范围为5-40， 生长盐度范围为0-3NaCl， 生长ph值范围为6.0- 8.0。 0035 菌株的生理生化特征使用API50CH、 API ZYM， 以及BIOLOG GEN碳源等检测试剂 盒。 其他菌株生理特征， 包括革兰氏染色属性、 氧需求、 接触酶活性、 氧化酶活性、 明胶水解 活性， 淀粉水解活性和纤维素水解活性， 主要参照 伯杰氏细菌鉴定手册 。 0036 如图1所示， 为任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)透射电镜照片图， 鉴定结 果显示， 任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)革兰氏阳性、 是严格需氧有荚膜的杆菌。 菌株在37。

18、下， 培养48小时后， 可形成菌落表面粗糙不透明， 污白色。 菌株的生长耐受范围 为5-40， 0-3NaCl， 生长ph值范围为6.0-8.0， 最适生长温度为37， 0-1NaCl， pH7。 0037 2、 任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)的细胞化学特征检测 0038 通过GC气相色谱、 HPLC液相色谱和TLC薄层色谱检测任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)的脂肪酸、 醌类型、 极性脂等细胞化学组分(Sasser M.Identification of bacteria by gas ghromatography of cellular 。

19、fatty acids， MIDI Technical Note 101.Newark,DE:MIDIinc； 1990.Minnikin DE,O Donnell AG,Goodfellow M,Alderson G, Athalye M et al.Anintegrated procedure for the extraction of bacterial isoprenoid quinones andpolar lipids.J Microbiol Methods 1984； 2:233-241)。 0039 任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)的细胞脂肪酸成分检测。

20、如表1所示， 结果 显示任清芽孢杆菌的主要脂肪酸是C14:0iso， 异式十四碳饱和脂肪酸； C14:0， 十四碳饱和 脂肪酸； C15:0iso， 异式十五碳饱和脂肪酸； C15:0anteiso， 反异式十五碳饱和脂肪酸； C16: 1w7c alcohol， W7c-十六碳单不饱和醇； C16:0iso， 异式十六碳饱和脂肪酸； C16:1w11c， W11c十六碳单不饱和脂肪酸； C16:0， 十六碳饱和脂肪酸； C17:0iso， 异式十七碳饱和脂肪 酸； C17:0anteiso， 反异式十七碳饱和脂肪酸； C17:0， 十七碳饱和脂肪酸； C18:1w9c W9c-十 八碳单不饱。

21、和脂肪酸； C18:0， 十八碳饱和脂肪酸。 0040 表1 说明书 3/7 页 5 CN 111172079 A 5 0041 0042 0043 在菌株任清芽孢杆菌细胞呼吸醌组份检测， 该菌株的主要醌MK-7(100)： 七烯甲 萘醌， 醌类化合物是一类广泛存在于自然产物、 抗肿瘤药物、 体内生化代谢物、 环境污染物 或多环芳烃代谢产生的氧化活性物质。 0044 任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)极性酯的检测， 具体步骤为： 极性脂提 取： 取100mg任清芽孢杆菌冻干菌体， 悬浮于9.5mL氯仿： 甲醇： 0.3NaCl(2.5:5:2)溶液中。 将上述菌体溶液放。

22、置80水浴， 15min。 冷却后， 滤纸过滤至50mL离心管中， 加入2.5mL氯仿 和2.5mL 0.3NaCl， 4000rpm离心5min。 小心分取下层氯仿相至干净的旋转蒸发仪专用烧 瓶中， 在旋转蒸发仪上减压旋转蒸发除去氯仿(水浴温度不超过40)。 加入250 L氯防-甲 醇(2:1， v/v)转至棕色螺口样品瓶中， 放置4冰箱中保存待测。 0045 极性脂的TLC分析： 将10cm10cm的硅胶板(Merck公司25TLC aluminiumn sheets 20cm20cm Silica gel 60F254)在110烘箱中活化1小时,取出冷却。 吸取2 L总脂样品 点样于TL。

23、C板上， 复点样3次。 0046 将TLC薄板置于第一个层析缸内展层， 第一向展层剂为氯仿:甲醇:水(65:25:4， v/ v)， 溶媒展至顶部后取出薄板吹干、 将薄板放入第二个层析缸， 第二向展层剂为氯仿： 甲醇： 乙酸： 水(80： 12： 15： 4， V/V)， 按与第一向垂直的方向上行， 溶媒展至顶部取出薄板吹干， 将 磷钼酸显色剂喷洒至TLC板至完全湿润， 100加热5-8min， 将清晰斑点显出， 立即在扫措仪 上扫描TLC板， 记录结果。 如图2所示， 在任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)中， 含有5 种极性酯， DPG： 二磷脂酰甘油； PG： 磷脂。

24、酰甘油， PE： 磷脂酰乙醇胺； PIM： 甘露糖苷磷脂酰肌 说明书 4/7 页 6 CN 111172079 A 6 醇； GL： 未知糖脂。 磷酸类脂(phospholipioides)属极性脂(polar lipid)， 与蛋白质、 糖等 构成细胞膜， 对于物质运输、 代谢及维持正常的渗透压都有重要作用。 不同属菌的磷酸类脂 组分是不同的， 它是鉴别属的重要特征之一， 是化学分类项目中不可缺少的分类指征。 0047 3、 菌株系统进化地位的确定 0048 任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)， 即Bacillus renqingensis REN2T菌株 由上海美吉。

25、生物医药科技有限公司进行全基因组测序， 得到全基因组序列。 Bacillus renqingensis REN2T相似株Bacillus rubiinfantis mt2T(NR144712)的全基因组从NCBI 中下载， 将REN 2全基因组与相似菌株Bacillus rubiinfantis mt2T(NR144712)在DSMZ (http:/ggdc.dsmz.de/home.php)进行比对， 将两者进行全基因组比对， 基因组DNA-DNA同 源性杂交(DDH)： DNA同源性70， 由进化树可以看出Bacillus renqingensis REN 2T的相 似株为Bacillus。

26、 rubiinfantis mt2T(NR144712)， 如图3所示。 0049 实施例2、 任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)菌剂酿酒中应用 0050 将某白酒企业酿酒车间蒸馏后的酒醅摊凉后按照200kg/组分堆， 对照组接种高温 大曲比例为投料量的15， 两个实验组接种高温大曲比例均为投料量的10(减少大曲用 量33.3)， 同时分别加入含实施例1的任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)的酿酒菌 剂和用含枯草芽孢杆菌标准菌株的酿酒菌剂组合物， 接种比例均为投料量的0.5(体积百 分比)， 替代33.3的高温大曲。 接种后进行高温堆积发酵3天， 。

27、堆料温度达48后入池发酵 30d， 取样蒸馏。 每个处理三个平行样。 0051 感官品评对比为： 对照组酒样分数在85-90， 评语是绵甜醇厚、 香味较谐调、 酒体较 丰满； 含枯草芽孢杆菌标准菌株酿酒菌剂组酒样分数在90-95， 评语为绵甜醇厚、 香味较谐 调、 酒体较醇厚； 含本发明实施例1的任清芽孢杆菌(Bacillus renqingensis)的酿酒菌剂 组酒样分数在95-100， 评语为酱香突出、 绵柔醇厚、 香味谐调、 酒体丰满。 表明高温大曲配合 使用本发明实施例1的菌剂可以明显改善酒质使酒中的香气更加协调， 口感更佳。 0052 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施例对本。

28、发明作了详尽的描述， 但在本 发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说明书 5/7 页 7 CN 111172079 A 7 0053 说明书 6/7 页 8 CN 111172079 A 8 0054 说明书 7/7 页 9 CN 111172079 A 9 序列表 北京工商大学 任清芽孢杆菌新菌种及其应用 GG19719838A 1 SIPOSequenceListing 1.0 1 1448 DNA Bacillus renqingensis 1 tacggc。

29、tacc ttgttacgac ttcaccccaa tcatctgtcc caccttaggc ggctggcccc 60 ttgcggttac cccaccgact tcgggtgtta caaactctcg tggtgtgacg ggcggtgtgt 120 acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag cgattccggc 180 ttcatgcagg cgagttgcag cctgcaatcc gaactgagaa tggttttatg ggattggctt 240 agcctcgcgg cttcgctgcc ctttg。

30、tacca tccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca 300 taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac cggcagtcac 360 cttagagtgc ccaactgaat gctggcaact aagatcaagg gttgcgctcg ttgcgggact 420 taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgtc actctgtccc 480 ccgaagggga acgtcctatc tctaggagtg tcagaggatg tca。

31、agacctg gtaaggttct 540 tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct 600 ttgagtttca gccttgcggc cgtactcccc aggcggagtg cttaatgcgt tagctgcagc 660 actaaagggc ggaaaccctc taacacttag cactcatcgt ttacggcgtg gactaccagg 720 gtatctaatc ctgtttgctc ccccgctttc gcgcctcagc gtcagttaca gaccagaaag 7。

32、80 ccgccttcgc cactggtgtt cctccacatc tctacgcatt tcaccgctac acgtggaatt 840 ccgctttcct cttctgcact caagtccccc agtttccaat gaccctccac ggttgagccg 900 tgggctttca catcagactt aaaggaccgc ctgcgcgcgc tttacgccca ataattccgg 960 acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc gtggctttct 1020 ggttaggtac cgtca。

33、aggta ccggcagtta ctccgatact tgttcttccc taacaacaga 1080 gctttacgac ccgaaggcct tcatcgctca cgcggcgttg ctccatcaga ctttcgtcca 1140 ttgtggaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtctg ggccgtgtct cagtcccagt 1200 gtggccgatc accctctcag gtcggctacg catcgtcgcc ttggtgagcc gttacctcac 1260 caactagcta atgcgccgcg ggcccatctg。

34、 taagtgacag cttgcgccgt cttttagctt 1320 atctacatgt gtagataaga atcatccggt attagctccg gtttcccgaa gttatcccag 1380 tcttacaggc aggttgccca cgtgttactc acccgtccgc cgctaatctc gaggagcaag 1440 ctcctctt 1448 序列表 1/1 页 10 CN 111172079 A 10 图1 图2 说明书附图 1/2 页 11 CN 111172079 A 11 图3 说明书附图 2/2 页 12 CN 111172079 A 12 。