STAT1在耐紫杉醇上皮性卵巢癌治疗中的用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010155521.X (22)申请日 2020.03.09 (71)申请人 复旦大学附属金山医院 地址 201508 上海市金山区龙航路1508号 (72)发明人 许国雄王繁晨 (74)专利代理机构 上海卓阳知识产权代理事务 所(普通合伙) 31262 代理人 曹翠娟 (51)Int.Cl. A61K 45/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 STAT1在耐紫杉醇上皮性卵巢癌治疗中的用 途 (57)摘要 本发明涉及生物医学技术。

2、领域， 具体地说， 是STAT1在耐紫杉醇上皮性卵巢癌治疗中的用 途。 本发明构建了单克隆耐紫杉醇上皮性卵巢癌 细胞株并通过转染siRNA构建了STAT1功能缺失 模型， 发现在STAT1表达降低后， 细胞中肿瘤干细 胞相关标志物的表达水平上升， 提示STAT1与干 性之间有负调控关系； 通过转染STAT1过表达质 粒构建了STAT1功能获得模型， 发现在STAT1表达 上升后， 细胞中肿瘤干细胞相关标志物表达水平 下降， 且细胞的成球能力降低， 说明过表达STAT1 可以抑制耐药细胞的干性。 且细胞的集落形成能 力和增殖生长能力也下降， 说明过表达STAT1可 以抑制耐紫杉醇的上皮性卵巢癌细。

3、胞的生长和 增殖。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图3页 CN 111184865 A 2020.05.22 CN 111184865 A 1.STA1的促进剂在制备治疗耐紫杉醇的上皮性卵巢癌的药物中的应用。 2.STA1的促进剂在制备抑制耐紫杉醇的上皮性卵巢癌细胞的增值、 迁移、 侵袭和/或成 球能力的试剂中的应用。 3.STA1的促进剂在制备降低耐紫杉醇的上皮性卵巢癌的标志物表达的试剂中的应用。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述的标志物为CD44、 CD133、 NANOG、 OCT4。 5.根据权利要求1-3任一所述的应用， 所述的促进剂选自以STAT1 或。

4、STAT1 蛋白或它 们的转录本为靶序列、 且能够促进其蛋白表达或基因转录的小干扰RNA、 dsRNA、 shRNA、 微小 RNA、 反义核酸； 或能表达或形成所述小干扰RNA、 dsRNA、 微小RNA、 反义核酸的构建物。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述的小干扰RNA序列是： 正义链： GCGUAAUCUUCAGGAUAAUtt(SEQ ID NO:1)； 反义链： AUUAUCCUGAAGAUUACGCtt(SEQ ID NO:2)。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111184865 A 2 STAT1在耐紫杉醇上皮性卵巢癌治疗中的用途 技术领域 0001 本发。

5、明涉及生物医学技术领域， 具体地说， 是STAT1在耐紫杉醇上皮性卵巢癌治疗 中的用途。 背景技术 0002 卵巢癌的发病率位列女性生殖系统恶性肿瘤的第三位， 同时也是致死率最高的妇 科肿瘤。 卵巢癌中最常见的病理类型是上皮性卵巢癌， 目前标准一线治疗为肿瘤减灭术后 辅以铂类联合紫杉醇化疗方案。 0003 患者在治疗初期可以获得较为明显的效果， 初次治疗的缓解率高， 但大多数患者 在完全缓解两年左右复发， 复发率高达80。 复发性上皮卵巢癌几乎对所有化疗药物耐药， 这极大地限制了化疗临床疗效和应用范围， 也是卵巢癌治疗失败的主要原因。 有研究显示， 上皮性卵巢癌的复发和耐药形成和肿瘤干细胞的存。

6、在相关。 因此， 对于耐药的上皮性卵巢 癌， 针对肿瘤干细胞的治疗或可成为一种有效的方法， 但是其具体的临床应用尚无报道。 0004 本发明目的在于寻找与肿瘤干细胞及耐药相关的新型上皮性卵巢癌标志物， 从而 提高该疾病的治疗效果与患者预后。 0005 STAT1是信号转导与转录激活子(Signal Transducer and Activator of Transcription， STAT)家族的成员之一， 是细胞因子/生长因子信号转导中重要的胞质转录 因子， 主要受干扰素的激活， 细胞因子可促进STAT1酪氨酸及丝氨酸位点的磷酸化， 入核后 形成同/异二聚体激活下游基因的表达。 STAT1。

7、有两个亚型， 包括全长STAT1 (含磷酸化位点 Tyr 701和Ser 727)(有C-末端反式激活区)和剪辑变体STAT1 (不含磷酸化位点Ser 727)。 STAT1可参与调节免疫系统、 细胞分化、 肿瘤、 细胞生长以及细胞凋亡等生理过程， 在多种肿 瘤中发挥抑制作用， 也有报道STAT1在肿瘤中发挥促进作用。 0006 但是关于本发明STAT1在作为耐紫杉醇上皮性卵巢癌治疗中的用途目前还未见报 道。 发明内容 0007 本发明的目的是针对现有技术的不足， 提供一种STAT1的新用途。 0008 为实现上述目的， 本发明采取的技术方案是： 0009 STA1的促进剂在制备治疗耐紫杉醇的。

8、上皮性卵巢癌的药物中的应用。 0010 STA1的促进剂在制备抑制耐紫杉醇的上皮性卵巢癌细胞的增值、 迁移、 侵袭和/或 成球能力的试剂中的应用。 0011 STA1的促进剂在制备降低耐紫杉醇的上皮性卵巢癌的标志物表达的试剂中的应 用。 0012 优选地， 所述的标志物为CD44、 CD133、 NANOG、 OCT4。 0013 优选地， 所述的促进剂选自以STAT1 或STAT1 蛋白或它们的转录本为靶序列、 且 能够促进其蛋白表达或基因转录的小干扰RNA、 dsRNA、 shRNA、 微小RNA、 反义核酸； 或能表达 说明书 1/5 页 3 CN 111184865 A 3 或形成所述。

9、小干扰RNA、 dsRNA、 微小RNA、 反义核酸的构建物。 0014 优选地， 所述的小干扰RNA序列是： 正义链： GCGUAAUCUUCAGGAUAAUtt(SEQ ID NO: 1)； 反义链： AUUAUCCUGAAGAUUACGCtt(SEQ ID NO:2)。 0015 本发明优点在于： 0016 1、 本发明通过构建单克隆耐紫杉醇上皮性卵巢癌细胞株并通过转染siRNA构建了 STAT1功能缺失模型， 发现在STAT1表达降低后， 细胞中肿瘤干细胞相关标志物的表达水平 上升， 提示STAT1与干性之间有负调控关系； 通过转染STAT1过表达质粒构建了STAT1功能获 得模型， 。

10、发现在STAT1表达上升后， 细胞中肿瘤干细胞相关标志物表达水平下降， 且细胞的 成球能力降低， 说明过表达STAT1可以抑制耐药细胞的干性。 且细胞的集落形成能力和增殖 生长能力也下降， 说明过表达STAT1可以抑制耐紫杉醇的上皮性卵巢癌细胞的生长和增殖， 为紫杉醇耐药患者的靶向治疗提供了新的治疗方案。 0017 2、 切入点贴近临床： 本发明的目的明确， 旨在在解决临床上上皮性卵巢癌治疗的 实际问题， 从目前治疗手段的不足之处出发， 发明了一种全新的潜在治疗手段， 有朝一日投 入临床实践， 可有针对性的改善现状， 从而使广大患者受益。 0018 3、 指导理念新颖： 本发明结合了国内外最新。

11、最先进的基础研究成果， 提出了富有 创造性的假说， 并在充分实验的基础上， 证明了假说的实际可操作性， 减轻了该类患者的压 力， 可很好的应用于临床， 具有很好的应用前景。 附图说明 0019 附图1是在构建成功的单克隆耐紫杉醇上皮性卵巢癌细胞株中， 通过转染siRNA构 建了STAT1功能缺失模型， 发现在STAT1表达降低后， 细胞中肿瘤干细胞相关标志物(CD44、 CD133、 NANOG、 OCT4)的表达水平有所上升， 提示STAT1与干性之间具有负调控关系。 0020 附图2是通过转染STAT1过表达质粒构建了STAT1功能获得模型， 发现在STAT1表达 上升后， 细胞中前述肿瘤。

12、干细胞相关标志物的表达水平有所下降， 并发现细胞的成球能力 降低， 提示其干性降低， 说明过表达STAT1可以抑制耐药细胞的干性。 另外这些细胞的集落 形成能力和增殖生长能力也出现下降， 说明过表达STAT1可以抑制耐紫杉醇的上皮性卵巢 癌细胞的生长和增殖。 0021 附图3是STAT1过表达质粒载体结构。 具体实施方式 0022 下面结合具体实施方式， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。 此外应理解， 在阅读了本发明记载的内容之后， 本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。 00。

13、23 实施例1构建单克隆耐紫杉醇上皮性卵巢癌细胞株 0024 构建方法： 0025 准备人上皮性卵巢癌细胞株OVCAR-3(美国， 美国模式培养物集存库)、 紫杉醇(中 国， 四川太极制药有限公司)。 OVCAR-3细胞株对紫杉醇敏感， 耐紫杉醇上皮性卵巢癌细胞株 构建自OVCAR-3细胞株， 方法如下： 说明书 2/5 页 4 CN 111184865 A 4 0026 (1)将OVCAR-3细胞以30的密度接种T25培养瓶中， 使用含10胎牛血清(美国， Gibco公司)的RPMI-1640(美国， Sigma公司)完全培养基进行培养。 24小时后弃去培养基， 用 磷酸盐缓冲液冲洗后， 换。

14、入含有0.01 M紫杉醇的完全培养基， 继续培养24小时。 随后弃去培 养基， 用磷酸盐缓冲液冲洗后， 换入无紫杉醇的完全培养基培养35天后， 再换为含有0.01 M紫杉醇的完全培养基培养24小时。 重复上述步骤直到细胞密度达到90。 0027 (2)将上述细胞传代至新的细胞培养瓶， 按照(1)中操作， 依次使用0.01， 0.1， 0.5 和5 M的紫杉醇浓度， 不断进行干预， 直到最终细胞生长状态及形状稳定， 从而得到耐紫杉 醇上皮性卵巢癌细胞株。 0028 (3)在此基础上， 使用流式分选技术， 从该耐紫杉醇上皮性卵巢癌细胞株中分选并 培养出具有稳定耐药表型的单克隆株， 即为单克隆耐紫杉。

15、醇上皮性卵巢癌细胞株。 0029 实施例2构建STAT1功能缺失模型 0030 1实验方法 0031 1.1细胞培养 0032 所用未做特殊强调的细胞使用RPMI-1640培养基并添加10胎牛血清， 在培养板 或培养瓶中进行培养。 0033 1.2转染siRNA 0034 合成好的siRNA(由上海吉玛公司合成)以干粉形式运输。 用一定体积的无菌DEPC 水(附送)溶解干粉， 配置成20 M的溶液。 siRNA序列见表1： 0035 表1 0036 0037 准备生长状态良好的待处理细胞， 当细胞达到合适密度时进行转染。 首先在每孔 中换入2ml的Opti-MEM培养基(美国， Gibco公司。

16、)， 再根据实验需要配置合适体积的转染复 合物， 并依次在每孔中滴加转染复合物。 对于六孔板每孔， 配置方法见表2： 0038 表2 0039 0040 培养箱中静置培养6小时后弃去旧培养基， 加入无转染复合物的新培养基再培养 48小时后用于进行后续实验。 0041 1.3Western blot 0042 准备预先用SDS抽提完成的细胞蛋白样， 在8的SDS-PAGE凝胶上进行电泳， 后使 用PVDF膜转膜， 使用相应的蛋白抗体(兔抗人STAT1的IgG抗体(美国， CST公司)4孵育过 夜。 次日使用HRP标记的相应二抗(羊抗兔IgG抗体(美国， proteintech公司)常温孵育1h并。

17、 曝光显影。 0043 实施例3构建STAT1功能获得模型 说明书 3/5 页 5 CN 111184865 A 5 0044 1实验方法 0045 1.1细胞培养 0046 所用未做特殊强调的细胞使用RPMI-1640培养基并添加10胎牛血清， 在培养板 或培养瓶中进行培养。 0047 1.2质粒转染 0048 所用STAT1过表达质粒载体结构如图3所示， 由苏州金唯智生物科技有限公司合 成， 并制备含有该质粒载体的DH5 大肠杆菌。 0049 进行转染实验时， 首先复苏含有STAT1过表达质粒的DH5 大肠杆菌， 并使用质粒无 内毒素质粒小提中量试剂盒(中国， 北京天根公司)进行质粒抽提。。

18、 获得质粒后， 配置成 500ng/ l备用。 0050 准备生长状态良好的待处理细胞， 当细胞达到合适密度时进行转染。 首先在每孔 中换入2ml的Opti-MEM培养基(美国， Gibco公司)， 再根据实验需要配置合适体积的转染复 合物， 并依次在每孔中滴加转染复合物。 对于六孔板每孔， 配置方法见表3： 0051 表3 0052 0053 培养箱中静置培养6小时后弃去旧培养基， 加入无转染复合物的新培养基再培养 48小时后用于进行后续实验。 0054 1.3Western blot 0055 准备预先用SDS抽提完成的细胞蛋白样， 在8的SDS-PAGE凝胶上进行电泳， 后使 用PVDF。

19、膜转膜， 使用相应的蛋白抗体(兔抗人STAT1的IgG抗体(美国， CST公司)4孵育过 夜。 次日使用HRP标记的相应二抗(羊抗兔IgG抗体(美国， Proteintech公司)常温孵育1小 时并曝光显影。 0056 实施例4分析实验 0057 1实验方法 0058 1.1干细胞成球分析实验 0059 先配置DMEM/F12无血清培养基， 并向其中添加20ng/ml表皮生长因子(EGF)、 20ng/ ml碱性成纤维细胞生长因子、 0.4 g/ml B27添加剂(美国， Thermo Fisher公司)、 4 g/ml肝 素(美国， Sigma公司)。 在超低黏附6孔板中每孔添加200ml该。

20、培养基。 使用该培养基将贴壁 细胞消化并使用处理成细胞悬液， 计数后， 在前述6孔板中每孔加入1000个细胞。 置于细胞 培养箱中培养11天， 并每隔四天补充200 l培养基。 0060 1.2细胞集落形成实验 0061 细胞消化处理成悬液， 计数后， 按照800个/孔的密度铺于6孔板内， 置于培养箱且 每个两天更换培养基。 第11天时取出6孔板， 吸去培养基并用PBS缓冲液冲洗数遍， 后用4 的多聚甲醛固定30分钟。 吸去多聚甲醛并用PBS冲洗数遍后， 用结晶紫染料染色15分钟。 吸 去结晶紫染料， PBS冲洗数遍直到洗净游离染料， 后观察并拍照。 说明书 4/5 页 6 CN 111184。

21、865 A 6 0062 1.3细胞增殖实验 0063 使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒。 取96孔板， 每孔加入200 l培养基， 并 将细胞按照3000个/孔的密度铺于板中， 培养24小时后进行过表达质粒转染。 所用载体同见 图3。 使用质粒无内毒素质粒小提中量试剂盒(中国， 北京天根公司)从含有STAT1过表达质 粒的DH5 大肠杆菌中进行质粒抽提。 获得质粒后， 配置成500ng/ l备用。 准备生长状态良好 的待处理细胞， 当细胞达到合适密度时进行转染。 首先在每孔中换入2ml的Opti-MEM培养基 (美国， Gibco公司)， 再根据实验需要配置合适。

22、体积的转染复合物， 并依次在每孔中滴加转 染复合物。 对于六孔板每孔， 配置方法见表3。 0064 培养箱中静置培养6小时后弃去旧培养基， 加入无转染复合物的新培养基。 换液后 继续培养24小时、 48小时、 72小时、 96小时， 并在各时间点按照说明书指示， 使用CCK-8试剂 盒测量细胞生长情况， 得到读数， 统计分析结果。 0065 2结果 0066 2.1我们在构建成功的单克隆耐紫杉醇上皮性卵巢癌细胞株中， 通过转染siRNA构 建了STAT1功能缺失模型， 发现在STAT1表达降低后， 细胞中肿瘤干细胞相关标志物(CD44、 CD133、 NANOG、 OCT4)的表达水平有所上升。

23、(图1)， 提示STAT1与干性之间具有负调控关系。 0067 2.2通过转染STAT1过表达质粒构建了STAT1功能获得模型， 发现在STAT1表达上升 后， 细胞中前述肿瘤干细胞相关标志物的表达水平有所下降， 并发现细胞的成球能力降低， 提示其干性降低(图2)， 说明过表达STAT1可以抑制耐药细胞的干性。 0068 2.3另外这些细胞的集落形成能力和增殖生长能力也出现下降(图2)， 说明过表达 STAT1可以抑制耐紫杉醇的上皮性卵巢癌细胞的生长和增殖。 0069 3结论 0070 从以上结果可以看出， STAT1可以抑制耐紫杉醇的上皮性卵巢癌中肿瘤干细胞特 性相关的标志物表达， 并可通过。

24、抑制肿瘤细胞的干性， 降低其生长增殖能力， 从而减少复 发。 针对STAT1设计靶向治疗， 可改善患者预后。 另一方面， STAT1的表达水平也可作为临床 上判断上皮性卵巢癌预后的重要指标。 0071 本发明切入点贴近临床： 目的明确， 旨在在解决临床上耐紫杉醇上皮性卵巢癌治 疗的实际问题， 从目前治疗手段的不足之处出发， 发明了一种全新的潜在治疗手段， 有朝一 日投入临床实践， 可有针对性的改善现状， 从而使广大患者受益。 指导理念新颖： 结合了国 内外最新最先进的基础研究成果， 提出了富有创造性的假说， 并在充分实验的基础上， 证明 了了假说的实际可操作性， 为紫杉醇耐药患者的靶向治疗提供。

25、了新的治疗方案， 可很好的 应用于临床上， 具有很好的应用前景。 0072 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和补充， 这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。 说明书 5/5 页 7 CN 111184865 A 7 SEQUENCE LISTING 复旦大学附属金山医院 STAT1在耐紫杉醇上皮性卵巢癌治疗中的用途 / 2 PatentIn version 3.3 1 21 DNA 人工序列 1 gcguaaucuu caggauaaut t 21 2 21 DNA 人工序列 2 auuauccuga agauuacgct t 21 序列表 1/1 页 8 CN 111184865 A 8 图1 说明书附图 1/3 页 9 CN 111184865 A 9 图2 说明书附图 2/3 页 10 CN 111184865 A 10 图3 说明书附图 3/3 页 11 CN 111184865 A 11 。