黑木耳凝集素及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010031547.3 (22)申请日 2020.01.13 (71)申请人 黑龙江大学 地址 150000 黑龙江省哈尔滨市南岗区学 府路74号 (72)发明人 张彦龙赵丹丹曾伟民雷虹 马成瑶黄悦李鹏飞 (74)专利代理机构 哈尔滨市文洋专利代理事务 所(普通合伙) 23210 代理人 何强 (51)Int.Cl. C07K 14/375(2006.01) C07K 1/14(2006.01) C07K 1/34(2006.01) (54)发明名称 一种黑木耳凝集素及其制。

2、备方法 (57)摘要 一种黑木耳凝集素及其制备方法， 涉及一种 凝集素及其制备方法。 黑木耳凝集素制备方法： 一、 制备黑木耳凝集素粗提液； 二、 黑木耳凝集素 粗提液与猪胃粘蛋白II型-溴化氰活化的琼脂糖 凝胶混合； 三、 离心解离、 超滤， 冷冻干燥后得到 黑木耳凝集素LAA。 本发明黑木耳凝集素可抑制 癌细胞生长、 促进巨噬细胞释放NO、 IL-1与 TNF-， 具有提高免疫力的活性。 且本发明黑木 耳凝集素能够清除ABTS自由基、 羟基自由基和超 氧阴离子， 具有优异的抗氧化效果。 权利要求书1页 说明书12页 附图10页 CN 111217893 A 2020.06.02 CN 11。

3、1217893 A 1.一种黑木耳凝集素的制备方法， 其特征在于该黑木耳凝集素按以下步骤制备： 一、 制备黑木耳凝集素粗提液； 二、 黑木耳凝集素粗提液与猪胃粘蛋白II型-溴化氰活化的琼脂糖凝胶混合； 三、 离心解离、 超滤， 冷冻干燥后得到黑木耳凝集素LAA。 2.根据权利要求1所述的一种黑木耳凝集素的制备方法， 其特征在于猪胃粘蛋白II型- 溴化氰活化的琼脂糖凝胶是以猪胃粘蛋白II型为配基偶联到琼脂糖凝胶上制备而成。 3.根据权利要求1所述的一种黑木耳凝集素的制备方法， 其特征在于步骤一： 取黑木耳 加入磷酸盐缓冲液， 在捣碎机中搅碎至粘稠匀浆， 然后冷冻离心， 收集上清液高压过滤， 滤 。

4、液为黑木耳凝集素粗提液。 4.根据权利要求1所述的一种黑木耳凝集素的制备方法， 其特征在于步骤二中黑木耳 凝集素粗提液与猪胃粘蛋白II型-溴化氰活化的琼脂糖凝胶按1:1的体积比混合。 5.根据权利要求1所述的一种黑木耳凝集素的制备方法， 其特征在于步骤三中离心： 3000r/min离心5min， 离心后下层沉淀用PBS洗三次， 再次3000r/min离心5min， 将上清液弃 去， 沉淀加入甘氨酸混合液摇匀， 然后3000r/min离心5min， 取上清液加入Tris-HCl缓冲溶 液， 而沉淀再重复加入甘氨酸混合液、 离心、 取上清液加Tris-HCl缓冲溶液过程2次， 合并加 有Tris-。

5、HCl缓冲溶液的上清液， 得到超滤原液； 其中所述甘氨酸混合液为甘氨酸浓度为0.1M、 NaCl浓度为1M、 pH3.0的溶液； 其中所述Tris-HCl缓冲溶液浓度为1M、 pH 7.8。 6.根据权利要求5所述的一种黑木耳凝集素的制备方法， 其特征在于步骤三中超滤： 将 超滤原液5kDa超滤除盐， 然后将浓缩液用10kDa的超滤离心管4400r/min超滤。 7.黑木耳凝集素， 其特征在于黑木耳凝集素是按权利要求1所述方法制备获得。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111217893 A 2 一种黑木耳凝集素及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种凝集素及其制备方法。 背景技术 。

6、0002 凝集素(Lectin)是指一种从各种植物， 无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或 结合糖的蛋白， 因其能凝集红血球(含血型物质)， 故名凝集素。 常用的为植物凝集素 (Phytoagglutin， PNA)， 通常以其被提取的植物命名， 如刀豆素A(Conconvalina， ConA)、 麦 胚素(Wheat germ agglutinin， WGA)、 花生凝集素(Peanut agglutinin， PNA)和大豆凝集素 (Soybean agglutinin， SBA)等， 凝集素是它们的总称。 0003 凝集素是动物细胞和植物细胞都能够合成和分泌的、 能与糖结合的蛋白质， 。

7、在细 胞识别和粘着反应中起重要作用， 主要是促进细胞间的粘着。 凝集素具有一个以上同糖结 合的位点， 因此能够参与细胞的识别和粘着， 将不同的细胞联系起来。 发明内容 0004 本发明提供了一种黑木耳凝集素及其制备方法。 0005 黑木耳凝集素按以下步骤制备： 0006 一、 制备黑木耳凝集素粗提液； 0007 二、 黑木耳凝集素粗提液与猪胃粘蛋白II型-溴化氰活化的琼脂糖凝胶混合； 0008 三、 离心解离、 超滤， 冷冻干燥后得到黑木耳凝集素LAA。 0009 本发明黑木耳凝集素LAA按上述方法制备获得。 0010 运用MALDI-TOF/TOF测定本发明黑木耳凝集素LAA相对分子质量为1。

8、8913.22； 黑木 耳凝集素LAA的N-末端序列检测为ITAPTTTSSAATE； 经蛋白质鉴定并与UniProt数据库比对， 分析得出黑木耳凝集素LAA含有以下4条肽段： QIDAERK、 TNHSVVTWNDK、 RLNFTAGNPFPR、 VRELEQQVDSMTK。 在已有的黑木耳蛋白质质谱库中未发现相同序列的存在， 由此推断黑木耳 凝集素LAA为黑木耳中的新型蛋白质， 并确定是一种新的凝集素。 0011 本发明黑木耳凝集素可抑制癌细胞生长、 促进巨噬细胞释放NO、 IL-1 与TNF- ， 具 有提高免疫力的活性。 0012 而且本发明黑木耳凝集素能够清除ABTS自由基(ABTS。

9、+)、 羟基自由基(OH)和超 氧阴离子(O2-)， 具有优异的抗氧化效果。 0013 本发明黑木耳凝集素对巨噬细胞RAW264.7无毒性。 附图说明 0014 图1是黑木耳凝集素LAA抑制肺癌细胞A549的增殖的200倍观察图； 图1A： 阴性对 照； 图1B： LAA浓度为50 g/mL； 图1C： LAA浓度为100 g/mL； 图1D： LAA浓度为150 g/mL； 图1E： LAA浓度为200 g/mL； 图1F： LAA浓度为250 g/mL。 0015 图2是黑木耳凝集素LAA对A549细胞的抑制曲线图。 说明书 1/12 页 3 CN 111217893 A 3 0016 图。

10、3是黑木耳凝集素LAA抑制癌细胞MCF-7的增殖的200倍观察图； 图3A： 阴性对照； 图3B： LAA浓度为50 g/mL； 图3C： LAA浓度为100 g/mL； 图3D： LAA浓度为 150 g/mL； 图3E： LAA 浓度为200 g/mL； 图3F： LAA浓度为250 g/mL。 0017 图4是黑木耳凝集素LAA对MCF-7细胞的抑制曲线图。 0018 图5是黑木耳凝集素LAA抑制癌细胞SGC-7901的增殖的200倍观察图； 图5A： 阴性对 照； 图5B： LAA浓度为50 g/mL； 图5C： LAA浓度为100 g/mL； 图5D： LAA浓度为150 g/mL；。

11、 图5E： LAA浓度为200 g/mL； 图5F： LAA浓度为250 g/mL。 0019 图6是黑木耳凝集素LAA对SGC-7901细胞的抑制曲线图。 0020 图7是黑木耳凝集素LAA抑制癌细胞HepG-2的增殖的200倍观察图； 图7A： 阴性对 照； 图7B： LAA浓度为50 g/mL； 图7C： LAA浓度为100 g/mL； 图7D： LAA浓度为150 g/mL； 图7E： LAA浓度为200 g/mL； 图7F： LAA浓度为250 g/mL。 0021 图8是黑木耳凝集素LAA对HepG-2细胞的抑制曲线图。 0022 图9是黑木耳凝集素LAA与NO释放量的关系图， (。

12、n3)， *p0.05， *p0.01， *p 0.001。 0023 图10是黑木耳凝集素LAA的纯度检测图， (n3)， *p0.05， *p0.01， *p0.001。 0024 图11是蛋白激酶K抑制NO释放关系图， (n3)， *p0.05， *p0.01， *p0.001。 0025 图12是ATP与LPS协同产生IL-1 ， (n3)， *p0.05， *p0.01， *p0.001。 0026 图13是黑木耳凝集素LAA与ATP协同产生IL-1 ， (n3)， *p0.05， *p0.01， *p 0.001。 0027 图14是TNF- 释放的触发条件， (n3)， *p0.。

13、05， *p0.01， *p0.001。 0028 图15是TNF- 释放量与黑木耳凝集素LAA浓度的关系图， (n3)， *p0.05， *p 0.01， *p0.001。 0029 图16是多粘菌素B对TNF- 释放量的影响， (n3)， *p0.05， *p0.01， *p 0.001。 0030 图17是黑木耳凝集素LAA的DPPH清除率曲线图。 0031 图18是Vc的DPPH清除率曲线图。 0032 图19是黑木耳凝集素LAA的ABTS清除率曲线图。 0033 图20是Vc的ABTS清除率曲线图。 0034 图21是黑木耳凝集素LAA的O2-清除率曲线图。 0035 图22是Vc的。

14、O2-清除率曲线图。 0036 图23是黑木耳凝集素LAA的OH自由基清除率曲线图。 0037 图24是Vc的OH自由基清除率曲线图。 0038 图25是黑木耳凝集素LAA的总抗氧化能力FeSO4的标准曲线图。 具体实施方式 0039 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式， 还包括各具体实施方式间的 任意组合。 0040 具体实施方式一： 本实施方式黑木耳凝集素按以下步骤制备： 0041 一、 制备黑木耳凝集素粗提液； 说明书 2/12 页 4 CN 111217893 A 4 0042 二、 黑木耳凝集素粗提液与猪胃粘蛋白II型-溴化氰活化的琼脂糖凝胶混合； 0043 三、 离心解离。

15、、 超滤， 冷冻干燥后得到黑木耳凝集素LAA。 0044 具体实施方式二： 本实施方式与具体实施方式一的不同点是： 猪胃粘蛋白II型-溴 化氰活化的琼脂糖凝胶是以猪胃粘蛋白II型为配基偶联到琼脂糖凝胶(sepharose-4B)上 制备而成。 其它步骤及参数与实施方式一相同。 0045 具体实施方式三： 本实施方式与具体实施方式一或二的不同点在于： 步骤一： 取黑 木耳加入磷酸盐缓冲液， 在捣碎机中搅碎至粘稠匀浆， 然后冷冻离心， 收集上清液高压过 滤， 滤液为黑木耳凝集素粗提液。 其它与具体实施方式一或二相同。 0046 具体实施方式四： 本实施方式与具体实施方式一至三之一的不同点在于： 步。

16、骤一 中磷酸盐缓冲液浓度为10mM、 pH 7.6。 其它与具体实施方式一至三之一相同。 0047 具体实施方式五： 本实施方式与具体实施方式一至四之一的不同点在于： 步骤一 中磷酸盐缓冲液与黑木耳的比例为100mL:5g。 其它与具体实施方式一至四之一相同。 0048 具体实施方式六： 本实施方式与具体实施方式一至五之一的不同点在于： 步骤一 中冷冻离心转速为5000r/min、 时间为30min。 其它与具体实施方式一至五之一相同。 0049 具体实施方式七： 本实施方式与具体实施方式一至六之一的不同点在于： 步骤一 中收集的上清液用四层FN 15膜(Whatman公司Filtrak FN。

17、15色谱纤维素膜)高压过滤。 其它 与具体实施方式一至六之一相同。 0050 具体实施方式八： 本实施方式与具体实施方式一至七之一的不同点在于： 步骤二 中黑木耳凝集素粗提液与猪胃粘蛋白II型-溴化氰活化的琼脂糖凝胶按1:1的体积比混合。 其它与具体实施方式一至七之一相同。 0051 具体实施方式九： 本实施方式与具体实施方式一至八之一的不同点在于： 步骤二 中混合温度为6。 其它与具体实施方式一至八之一相同。 0052 具体实施方式十： 本实施方式与具体实施方式一至九之一的不同点在于： 步骤二 中混合持续时间为812h。 其它与具体实施方式一至九之一相同。 0053 具体实施方式十一： 本实。

18、施方式与具体实施方式一至十之一的不同点在于： 步骤 三中离心： 3000r/min离心5min， 离心后下层沉淀用PBS洗三次， 再次3000r/min离心5min， 将 上清液弃去， 沉淀加入甘氨酸混合液摇匀， 然后3000r/min离心5min， 取上清液加入 Tris- HCl缓冲溶液， 而沉淀再重复加入甘氨酸混合液、 离心、 取上清液加Tris-HCl缓冲溶液过程2 次， 合并加有Tris-HCl缓冲溶液的上清液， 得到超滤原液； 0054 其中所述甘氨酸混合液为甘氨酸浓度为0.1M、 NaCl浓度为1M、 pH3.0的溶液； 0055 其中所述Tris-HCl缓冲溶液浓度为1M、 p。

19、H 7.8。 其它与具体实施方式一至十之一 相同。 0056 具体实施方式十二： 本实施方式与具体实施方式一至十一之一的不同点在于： 步 骤三中超滤： 将超滤原液5kDa超滤除盐， 然后将浓缩液用10kDa的超滤离心管4400r/min超 滤。 其它与具体实施方式一至十一之一相同。 0057 具体实施方式十三： 本实施方式与具体实施方式一至十二之一的不同点在于： 超 滤过程中加水除盐3次。 其它与具体实施方式一至十二之一相同。 0058 具体实施方式十四： 本实施方式与具体实施方式一至十三之一的不同点在于： 10kDa 的超滤离心管4400r/min超滤至体积为浓缩液1/4。 其它与具体实施方。

20、式一至十三之 说明书 3/12 页 5 CN 111217893 A 5 一相同。 0059 实施例1 0060 黑木耳凝集素按以下步骤制备： 0061 一、 取黑木耳加入液浓度为10mM、 pH 7.6的磷酸盐缓冲液， 在捣碎机中搅碎至粘稠 匀浆， 然后冷冻离心、 离心转速为5000r/min、 离心时间为30min， 收集上清液用四层FN 15膜 高压过滤， 滤液为黑木耳凝集素粗提液； 其中磷酸盐缓冲液与黑木耳的比例为100 mL:5g； 0062 二、 黑木耳凝集素粗提液与猪胃粘蛋白II型-溴化氰活化的琼脂糖凝胶6混合8 12h， 其中黑木耳凝集素粗提液与猪胃粘蛋白II型-溴化氰活化的琼。

21、脂糖凝胶按1:1的体 积比混合； 0063 三、 3000r/min离心5min， 离心后下层沉淀用PBS洗三次， 再次3000r/min离心5min， 将上清液弃去， 沉淀加入甘氨酸混合液摇匀， 然后3000r/min离心5min， 取上清液加入 Tris-HCl缓冲溶液， 而沉淀再重复加入甘氨酸混合液、 离心、 取上清液加Tris-HCl缓冲溶液 过程2次， 合并加有Tris-HCl缓冲溶液的上清液， 得到超滤原液； 0064 其中所述甘氨酸混合液为甘氨酸浓度为0.1M、 NaCl浓度为1M、 pH3.0的溶液； 0065 其中所述Tris-HCl缓冲溶液浓度为1M、 pH 7.8； 00。

22、66 将超滤原液5kDa超滤除盐， 然后将浓缩液用10kDa的超滤离心管4400r/min超滤至 体积为浓缩液1/4。 ； 超滤过程中加水除盐3次； 冷冻干燥后得到黑木耳凝集素LAA。 0067 运用MALDI-TOF/TOF测定黑木耳凝集素LAA相对分子质量为18913.22； 黑木耳凝集 素LAA的N-末端序列检测为ITAPTTTSSAATE； 经蛋白质鉴定并与UniProt数据库比对， 分析得 出黑木耳凝集素LAA含有以下4条肽段： QIDAERK、 TNHSVVTWNDK、 RLNFTAGNPFPR、 VRELEQQVDSMTK。 0068 抗肿瘤实验： 0069 CCK-8试验： C。

23、ell Counting Kit-8试剂盒用于检测黑木耳凝集素抑制肿瘤细胞的 增殖。 0070 具体操作如下： 0071 (1)在96孔板的四周加入ddH2O， 以防止培养基蒸发， 在96孔板中选择合适的孔作 为样品孔和对照孔， 分别设置三组平行孔。 0072 (2)对处于对数生长期的细胞进行胰酶消化后， 加入培养基将细胞吹匀成密度为 2.5 104个/mL的细胞悬液， 每个孔内接种200 l细胞悬液， 随后将96孔板置于37、 5CO2 的湿润培养箱中培养24h。 0073 (3)次日取出96孔板， 将原培养液吸出， 加入等体积的PBS溶液， 轻轻摇晃， 吸出， 重 复三次， 加入100 l。

24、不同浓度的黑木耳凝集素LAA液， 对照孔加入等体积含1DMSO 的培养 基， 继续培养24、 48或72h。 0074 (4)每孔加入10 l CCK-8溶液， 培养箱中孵育1h， 酶标仪检测OD450。 0075 (5)根据公式计算黑木耳凝集素对肿瘤细胞的抑制率() 0076 0077 利用SPSS统计分析软件， 计算凝集素对肿瘤细胞的半数抑制浓度， 即IC50。 0078 实验结果： 说明书 4/12 页 6 CN 111217893 A 6 0079 抑制肺癌细胞A549的增殖： 0080 本实验设置不同浓度黑木耳凝集素LAA对A549细胞进行实验， 实验结果如图1所 示， 实验结果表明。

25、与阴性对照组相比， 当凝集素浓度为250 g/mL时， A549细胞逐渐失去原有 的无规则多角型形态， 多呈现空气泡化， 细胞核逐渐消失， 呈凋亡趋势， A549细胞的生长明 显受到抑制。 0081 黑木耳凝集素LAA浓度为100-200 g/mL， 细胞数量减少， 且开始出现气泡化； 黑木 耳凝集素LAA浓度为50 g/mL， A549细胞形态并未出现较大改变， 只观察到细胞开始聚集， 细 胞体积变大， 判断细胞开始出现气泡化。 0082 选择100 g/mL作为黑木耳凝集素LAA抑制A549细胞增殖的初始浓度； 等浓度梯度 稀释后(100 g/mL、 50 g/mL、 25 g/mL、 1。

26、2.5 g/mL及6.25 g/mL)分别作用A549细胞 24h、 48h 和72h， 经CCK-8试剂盒检测， 各浓度黑木耳凝集素LAA作用A549细胞后对其增长的抑制情况 如图2所示； A549细胞的生长受抑制情况呈浓度和时间依赖性， 随着黑木耳凝集素LAA浓度 的升高， 对A549细胞的增殖抑制程度逐渐加深， 同一浓度处理不同时间， 对A549细胞的抑制 程度也不相同， 当黑木耳凝集素LAA的浓度为100 g/mL， 作用时间为72h时， 对A549细胞的抑 制率达到最大值74。 0083 抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖： 0084 黑木耳凝集素LAA对乳腺癌细胞的初筛结果如图3所示，。

27、 与对照组相比， 100-250 g/mL黑木耳凝集素LAA处理下的MCF-7细胞形态发生明显变化， 梭型或多角型的正常形态消 失， 细胞体积增大变圆， 与瓶底的吸附力降低； 50 g/mL黑木耳凝集素LAA 处理的MCF-7细胞 依旧保持原有细胞的形态， 个别出现体积变大变圆的情况。 0085 选择100 g/mL的黑木耳凝集素LAA作为复筛时的初始浓度； 复筛结果如图4所示， 等梯度稀释黑木耳凝集素LAA， 分别与MCF-7细胞于375CO2培养箱中孵育24h、 48h、 72h， 结果显示MCF-7细胞的增殖情况与黑木耳凝集素LAA的浓度呈负相关， 即黑木耳浓度越 高， MCF-7细胞增。

28、殖受抑制的情况越明显， 且随时间的推移， MCF-7细胞的抑制率越高。 黑木 耳凝集素LAA浓度为100 g/mL， 孵育72h后， 对乳腺癌细胞MCF-7的抑制率高达78。 0086 抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖： 0087 黑木耳凝集素LAA对SGC-7901细胞的初筛结果如图5所示， 对照细胞多呈梅花状且 成簇分布， 形态规则划一， 轮廓较为清晰； 加入黑木耳凝集素LAA后SGC-7901细胞开始出现 气泡化， 形态变圆逐渐脱离瓶底。 0088 复筛结果如图6所示， SGC-7901细胞与黑木耳凝集素呈浓度和时间依赖性， 与黑木 耳凝集素LAA共培养72h后， 对SGC-7901的。

29、抑制率仅有53。 0089 抑制肝癌细胞HepG-2的增殖： 0090 在黑木耳凝集素LAA抑制HepG-2的初筛试验中， 50 g/mL的黑木耳凝集素LAA处理 下(如图7所示)， 细胞的延伸形态开始消失， 细胞质收缩， 逐渐出现空气泡； 待浓度达到100 g/mL时， 原有形态完全消失， 所有细胞体积变大， 数量减少并开始脱离瓶底， 后续浓度作用 下的HepG-2细胞形态及数量没有太大差异。 0091 选择100 g/mL作为黑木耳凝集素LAA抑制HepG-2细胞增殖的初始浓度； 黑木耳凝 集素LAA等体积浓度梯度稀释分别作用HepG-2细胞24h、 48h、 72h(如图8所示)， He。

30、pG-2 的抑 制率与黑木耳凝集素LAA呈浓度依赖性， 但在作用时间上48h与72h凝集素LAA处理下的 说明书 5/12 页 7 CN 111217893 A 7 HepG-2的抑制率并无明显差异， 说明HepG-2在48h以内对黑木耳凝集素LAA的浓度存在依赖 性， 且黑木耳凝集素LAA对HepG-2细胞的最大抑制率达到80。 0092 免疫调节实验 0093 细胞处理： 0094 (1)在96孔板的四周加入ddH2O， 以防止培养基蒸发， 在96孔板中选择合适的孔作 为样品孔和对照孔， 分别设置三组平行孔。 0095 (2)对处于对数生长期的细胞进行胰酶消化后， 加入培养基将细胞吹匀成密。

31、度为 2.5 104个/mL的细胞悬液， 每个孔内接种200 l细胞悬液， 随后将96孔板置于37、 5CO2 的湿润培养箱中培养24h。 0096 (3)次日取出96孔板， 将原培养液吸出， 加入等体积的PBS溶液， 轻轻摇晃， 吸出， 重 复三次， 加入100 l不同浓度的黑木耳凝集素LAA液， 培养24h后， 收集培养液， 即为待测样品 溶液。 0097 酶联免疫吸附试验： 0098 (1)根据说明书要求， 将10Coating Buffer稀释成1Coating Buffer， 5 ELISA/ELISPOT稀释成1ELISA/ELISPOT， 分别用这两种稀释液配制Capture A。

32、ntibody 和 Detection Antibody备用。 0099 (2)标准品中注入1mL ddH2O， 配制成浓度为15ng/mL的标准品溶液， 取100 l标准 品溶液， 经1ELISA/ELISPOT稀释液稀释成最终浓度为1000pg/mL。 0100 (3)1ELISA/ELISPOT稀释液配制抗生物蛋白标记的辣根过氧化物酶溶液备用。 0101 (4)向酶联板9018各孔中加入100 l Capture Antibody， 用保鲜膜密封96孔板， 2- 8过夜培养。 0102 (5)96孔板各孔中加入250 l清洗缓冲液(1PBS， 0.05Tween-20)， 浸泡12min。

33、 后弃掉， 此过程重复至少3次， 用滤纸条吸干剩余的洗涤液。 0103 (6)各孔中加入200 l 1ELISA/ELISPOT稀释液， 室温培养1h。 0104 (7)重复步骤(5)。 0105 (8)向96孔板第一孔加入100 l标准品溶液， 连续2倍梯度稀释至第八孔， 在合适孔 中加入100 l待测样品溶液(含黑木耳凝集素LAA)， 设置3组生物学重复， 另外加入 100 l 1 ELISA/ELISPOT稀释液作为空白对照组。 0106 (9)重复步骤(5)。 0107 (10)向对应孔中加入100 l Detection Antibody， 保鲜膜密封室温孵育1h。 0108 (11。

34、)重复步骤(5)。 0109 (12)在96孔板相应孔中加入100 l Avidin-HRP， 密封室温孵育30min。 0110 (13)重复步骤(5)。 0111 (14)在96孔板对应孔中加入100 l 1TMB溶液， 室温孵育15min。 0112 (15)每孔加入50 l终止液(1M H3PO4)。 0113 (16)使用酶标仪， 在450nm处测定标准品及样品的吸光值。 0114 格里斯试验： 0115 细胞处理： 0116 (1)在96孔板的四周加入ddH2O， 以防止培养基蒸发， 在96孔板中选择合适的孔作 说明书 6/12 页 8 CN 111217893 A 8 为样品孔和。

35、对照孔， 分别设置三组平行孔。 0117 (2)对处于对数生长期的细胞进行胰酶消化后， 加入培养基将细胞吹匀成密度为 2.5 104个/mL的细胞悬液， 每个孔内接种200 l细胞悬液， 随后将96孔板置于37、 5CO2 的湿润培养箱中培养24h。 0118 (3)次日取出96孔板， 将原培养液吸出， 加入等体积的PBS溶液， 轻轻摇晃， 吸出， 重 复三次， 加入100 l不同浓度的黑木耳凝集素LAA液， 培养24h后， 收集培养液， 即为待测样品 溶液。 0119 根据Griess法， 检测鼠巨噬细胞释放的NO含量。 由于NO在体内或在水溶液里容易 被氧化成NO2-， 而在酸性的环境中，。

36、 NO2-易与重氮盐磺胺发生反应生成重氮化合物， 进而与 萘基乙烯基二胺发生耦合反应。 可根据生成产物的浓度与NO2-的线性关系， 计算NO的含量。 详细步骤如下： 0120 (1)配制10mM NaNO2标准储备液； 实验前将储备液稀释10倍， 作为初始浓度溶液， 并连续等梯度稀释， 用作NO标准曲线的测定。 0121 (2)Griess试剂的配制。 0122 A液： 无水对氨基苯磺酸1.0g， 加入70mL去离子水加热使之充分溶解， 另加85浓 硫酸6mL， 定容至100mL。 0123 B液： N-1-萘乙二胺盐酸盐0.1g， 溶于去离子水， 定容至100mL。 0124 (3)在96孔。

37、板竖排加入50 l各浓度的NaNO2溶液， 另取空白孔加入待测样品溶液 (含不同浓度黑木耳凝集素LAA)50 l， 重复三次平行试验。 0125 (4)向各孔中加入50 l A液， 在37培养箱中孵育10min； 取出96孔板继续再各孔 加入B液50 l， 混匀后继续在37培养箱中孵育10min。 0126 (5)取出96孔板， 轻轻振荡数次， 避免出现气泡， 于酶标仪540nm波长检测相应孔的 OD值。 0127 (6)根据测定结果， 绘制NO标准曲线， 依据标准曲线计算不同处理下鼠巨噬细胞释 放的NO含量。 0128 实验结果： 0129 黑木耳凝集素LAA诱导NO产生， 选择小鼠单核巨噬。

38、细胞J774A.1作为免疫活性试验 材料， 该细胞来源于雌性小鼠腹腔肉瘤细胞， 能较好的反映黑木耳凝集素LAA刺激下所做出 的免疫应答反应， 为试验结果提供可靠的数据支撑。 0130 利用格里斯法检测黑木耳凝集素LAA作用J774A.1细胞NO的释放量如图9所示， NO 的释放量与黑木耳凝集素LAA的浓度呈线性依赖关系(图9)， 即随着黑木耳凝集素 LAA浓度 的升高， 诱导巨噬细胞产生并释放的NO也逐渐升高， 且验证了NO的释放是非LPS依赖性的。 由于在试验过程中材料时常会伴随着脂多糖LPS的污染而给试验造成假阳性的结果， 导致 试验结果的不准确性， 因此排除假阳性结果带来的误差尤为重要。。

39、 LPS是革兰氏阴性菌细胞 壁的主要成分， 耐热性强， 于沸水中加热10min仍然保持活性， 而黑木耳凝集素LAA在高温处 理下蛋白发生变性， 丧失了其生物学功能， 导致NO的释放量减少 (图10)， 从侧面验证了黑 木耳凝集素并无LPS污染， 保证试验结果的准确性。 蛋白激酶 K是一种蛋白抑制剂， 可有效 将蛋白水解成氨基酸， 失去复杂的结构与蛋白功能， 黑木耳凝集素LAA在蛋白激酶K的作用 下， NO释放量显著降低(图11)， 而蛋白激酶作用下的 LPS并无NO释放量减少的现象， 说明蛋 说明书 7/12 页 9 CN 111217893 A 9 白激酶K是良好的凝集素抑制剂， 可抑制免疫。

40、调节水平。 0131 黑木耳凝集素LAA诱导白细胞介素IL-1 产生 0132 本试验应用ELISA方法检测黑木耳凝集素LAA素刺激小鼠巨噬细胞产生的白介素 IL-1 的含量如图12所示， 当培养基中单独加入ATP或LPS， 几乎没有IL-1 的释放， 而同时加 入ATP与LPS后， 观察结果发现IL-1 的释放量显著增多， 说明IL-1 的释放需要 ATP与LPS的 协同刺激。 图13单独向培养基中加入黑木耳凝集素LAA， 可见IL-1 的释放量寥寥无几， 当黑 木耳凝集素LAA与ATP同时加入巨噬细胞中， 培养24h后发现IL-1 的释放量明显提高， 与对 照组相比差异显著， 结果表明黑木。

41、耳凝集素LAA可以作为一种类似于LPS的存在， 与ATP协同 调节生物体的免疫活性。 0133 黑木耳凝集素LAA诱导肿瘤坏死因子TNF- 产生 0134 ELISA检测黑木耳凝集素LAA刺激J774A.1细胞产生TNF- 如图1416所示， 在反应 体系中加入ATP， 无TNF- 释放， 向培养基中加入LPS后， TNF- 释放量明显增多， 且同时加入 LPS及ATP， 检测到的释放量与单独加入LPS时TNF- 释放量无差异(图14)， 表明TNF- 释放量 仅与LPS的刺激有关。 图15结果说明TNF- 的释放量与黑木耳凝集素 LAA呈浓度依赖性。 多 粘菌素PMB是良好的内毒素抑制剂， 。

42、图16结果显示， 加入PMB 的黑木耳凝集素LAA TNF- 释 放量与未加入PMB的TNF- 释放量无显著差异， 与单独用 LPS处理的巨噬细胞的TNF- 释放 量相比， 再培养基中加入PMB后， TNF- 释放量明显降低， 从而验证了试验样品的可靠性。 0135 抗氧化实验 0136 DPPH自由基清除试验： 0137 (1)用甲醇溶解DPPH粉末， 配制6mmol/L的DPPH储备液， 于-20保存备用， 用时甲 醇稀释100倍， 即60 mol/L。 0138 (2)在1.5mL EP管中加入不同浓度的黑木耳凝集素LAA溶液， 取50 l加入比色杯 中， 另取50 l DMSO作为参比。

43、溶液， 再分别加入3mL 60 mol/L DPPH甲醇溶液， 轻轻振荡摇 匀， 在室温条件下避光静置30min。 0139 (3)分光光度计测定各溶液在515nm波长处的吸光值， 测量前先用等体积的甲醇溶 液进行调零， 并按照下式计算待测样品溶液的自由基清除率。 0140 0141 其中， As为样品管的吸光度值， A0为参比管的吸光度值。 0142 实验结果： 选择黑木耳凝集素LAA对DPPH自由基进行清除试验， 并用IC50值来衡量 其抗氧化能力强弱。 黑木耳凝集素LAA各浓度(6.25 g/mL、 12.5 g/mL、 25 g/mL、 50 g/mL、 100 g/mL)的DPPH清。

44、除曲线及Vc各浓度(0.00625 g/mL、 0.0125 g/mL、 0.025 g/mL、 0.50 g/mL、 0.1 g/mL)的DPPH清除曲线如图17、 18所示， 可见黑木耳凝集素LAA对DPPH自由基的清 除率明显低于Vc作用下的DPPH清除率， 结果表明黑木耳凝集素LAA对DPPH的清除率一般。 0143 黑木耳凝集素LAA对DPPH的EC50值为91.444.20 g/mL， 与对照组Vc对DPPH 的 EC50值相比， 差异及其显著(P0.001)， 说明黑木耳凝集素LAA对DPPH的清除率较差， 不能有 效的清除DPPH。 0144 表1清除DPPH 说明书 8/12。

45、 页 10 CN 111217893 A 10 0145 0146 MeanSD， n3， *p0.05， versus control. 0147 ABTS自由基清除试验： 0148 ABTS在氧化剂的作用下， 易被氧化成绿色的ABTS+， 在抗氧化物存在时， ABTS+的 产生会被抑制， 可在734nm测定ABTS +的吸光度计算样品的抗氧化能力。 0149 (1)ABTS+储备液的配制： PBS配制5mmol/L的ABTS溶液， 与140nmol/L的过硫酸钾 混合， 并用PBS稀释至在734nm处的吸光值为0.700.02， 静置避光于-20保存备用。 0150 (2)取100 l不同。

46、浓度的黑木耳凝集素LAA溶液加入比色杯中， 另取100 l DMSO 作 为参比溶液， 分别在比色杯中加入3mL ABTS+储备液， 振荡摇匀， 在室温避光静置 10min。 0151 (3)先用等体积PBS进行调零， 再测定各溶液在734n处的吸光值， 并按照下面公式 计算待测样品溶液(黑木耳凝集素LAA溶液)的自由基清除率。 0152 0153 其中， As为样品管的吸光度值， A0为参比管的吸光度值。 0154 实验结果： 黑木耳凝集素LAA对ABTS的清除率如图19， 结果表明随着黑木耳凝集素 浓度的升高， 其对ABTS的清除率逐渐增强， 显示一定的浓度依赖性。 0155 黑木耳凝集素。

47、LAA对ABTS的EC50值为45.700.11 g/mL， 与对照组Vc对ABTS 的 EC50值相比差异不显著， 说明黑木耳凝集素LAA对ABTS有清除能力， 可作为一种抗氧化剂， 防 止生物体被ABTS氧化， 从而避免了相关疾病与不良症状的发生。 0156 表2对ABTS+的EC50值 0157 0158 MeanSD， n3， *p0.05， versus control. 0159 超氧阴离子自由基清除试验 0160 邻苯三酚， 又称焦性没食子酸， 其在碱性条件下易自氧化， 释放出超氧阴离子， 而 超氧阴离子的出现又加速邻苯三酚的氧化。 加入抗氧化剂可阻断超氧阴离子的产生， 从而 降。

48、低邻苯三酚的自氧化速率， 通过比较加入抗氧化剂前后的自氧化速率来计算清除超氧阴 离子的能力。 0161 邻苯三酚自氧化速率的测定： 4.5mL pH8.2的Tris-HCl溶液与4.2mL ddH2O混匀， 说明书 9/12 页 11 CN 111217893 A 11 于 25孵育30min， 迅速加入0.3mL邻苯三酚溶液， 轻轻振荡混匀后， 记录5min内在320nm 处吸光度的变化， 并绘制时间(t)-吸光度(A)曲线， 计算邻苯三酚的自氧化速率(V0)。 0162 待测黑木耳凝集素LAA作用下邻苯三酚的自氧化速率测定： 4.5mL Tris-HCl溶液 与 3.3mL ddH2O混匀。

49、， 于25孵育30min， 迅速加入0.9mL黑木耳凝集素LAA梯度稀释溶液及 0.3mL邻苯三酚溶液， 轻轻振荡混匀后， 记录5min内在320nm处吸光度的变化， 并绘制时间 (t)-吸光度(A)曲线， 计算邻苯三酚在受试物作用下的自氧化速率(V1)。 如下式： 0163 0164 实验结果： 黑木耳凝集素LAA对超氧阴离子(O2-)的清除情况如图21所示， 可见超 氧阴离子(O2-)的清除率与凝集素的浓度成线性正相关， 且具有浓度依赖性， 拥有良好的 抗氧化能力。 0165 黑木耳凝集素LAA对超氧阴离子(O2-)的清除能力的EC50值为35.031.24 g/ mL， 统计分析结果表明。

50、， 其EC50值与对照组差异不显著， 说明黑木耳凝集素LAA有较好的清除 超氧阴离子(O2-)的能力。 0166 表3对O2-的EC50值 0167 0168 MeanSD， n3， *p0.05， versus control. 0169 羟基自由基清除试验： 0170 在亚铁离子存在的条件下， 过氧化氢易被还原成羟基自由基， 加入水杨酸可对羟 基自由基进行捕捉， 在510nm波长处产生特征吸收。 当向反应体系中加入抗氧化剂时， 水杨 酸捕捉羟基自由基的能力受阻， 进而在特定波长处的吸光值降低， 以此来评价待测物的抗 氧化能力。 0171 100 l待测黑木耳凝集素LAA梯度稀释溶液与100。