基于DNA水凝胶的铅离子检测设备及其制备和检测方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010059893.2 (22)申请日 2020.01.19 (71)申请人 重庆文理学院 地址 402160 重庆市永川区双竹镇 (72)发明人 谢顺碧彭琴滕柳梅唐英 张进 (74)专利代理机构 重庆强大凯创专利代理事务 所(普通合伙) 50217 代理人 伍琴琴 (51)Int.Cl. G01N 27/02(2006.01) G01N 27/327(2006.01) C12Q 1/00(2006.01) (54)发明名称 一种基于DNA水凝胶的铅离子检测设备及其 制备和。

2、检测方法 (57)摘要 本发明属于污染物检测领域， 涉及一种铅离 子检测设备及其制备和检测方法， 具体涉及一种 基于DNA水凝胶的铅离子检测设备及其制备和检 测方法。 本方案采用铅离子依赖的脱氧核酶辅助 形成的DNA水凝胶包裹蛋白质的信号放大策略， 构建电化学生物传感器， 进而对铅离子进行检 测， 该方法线性范围好、 检测限低、 准确度高和特 异性好等优点。 本方案可以应用于铅离子的检测 实践和新型检测设备的开发研究中。 权利要求书2页 说明书9页 序列表1页 附图4页 CN 111239196 A 2020.06.05 CN 111239196 A 1.一种基于DNA水凝胶的铅离子检测方法，。

3、 其特征在于， 包括以下步骤： 步骤(1)制备修饰电极： 所述修饰电极包括固定在外层的DNA水凝胶， 所述DNA水凝胶包 括由底物链和丙烯酰胺聚合形成的聚丙烯酰胺复合物P1、 由酶链和丙烯酰胺聚合形成的聚 丙烯酰胺复合物P2和蛋白质分子； 酶链为脱氧核酶， 底物链上有酶链的识别序列， 酶链用于 在铅离子激活后在所述识别序列切割底物链， 且在酶链和底物链的5 端均修饰有丙烯酰胺 基； 步骤(2)电化学检测： 将待测样品加入所述修饰电极上的DNA水凝胶中， 使酶链切割底 物链， 获得待测电极， 再测定待测电极的阻抗值。 2.根据权利要求1所述的一种基于DNA水凝胶的铅离子检测方法， 其特征在于， 。

4、在步骤 (1)中， DNA水凝胶中包裹的蛋白质分子为牛血清蛋白。 3.根据权利要求2所述的一种基于DNA水凝胶的铅离子检测方法， 其特征在于， 在步骤 (1)中， 制备修饰电极的方法为： 在玻碳电极表面覆盖纳米金颗粒层， 将捕获链固定在纳米 金颗粒层上， 再通过捕获链将DNA水凝胶固定在纳米金颗粒层上； 所述捕获链为单链DNA， 捕 获链的5端通过间隔物连接有氨基， 所述捕获链用于与所述底物链形成互补配对。 4.根据权利要求3所述的一种基于DNA水凝胶的铅离子检测方法， 其特征在于， 在步骤 (1)中， 底物链上的酶链的识别序列为rA。 5.根据权利要求4所述的一种基于DNA水凝胶的铅离子检测。

5、方法， 其特征在于， 在步骤 (1)中， 所述DNA水凝胶的制备方法为： 将底物链加入丙烯酰胺溶液中， 在过硫酸铵的氧化作 用和N,N,N,N-四甲基乙二胺的催化作用下， 通过自由基聚合反应获得聚丙烯酰胺复合物 P1； 将酶链加入丙烯酰胺溶液中， 在过硫酸铵的氧化作用和N,N,N,N-四甲基乙二胺的催 化作用下， 通过自由基聚合反应获得聚丙烯酰胺复合物P2； 将聚丙烯酰胺复合物P1、 聚丙烯 酰胺复合物P2和牛血清蛋白溶液混合， 获得混合溶液； 将混合溶液滴加在所述纳米金颗粒 层上， 经孵育后获得一层覆盖在纳米金颗粒层上的DNA水凝胶。 6.根据权利要求5所述的一种基于DNA水凝胶的铅离子检测。

6、方法， 其特征在于， 在步骤 (2)中， 将待测样品加入所述修饰电极上的DNA水凝胶中， 在35-40的条件下， 使酶链切割 底物链的时长大于或等于1h。 7.根据权利要求6所述的一种基于DNA水凝胶的铅离子检测方法， 其特征在于， 所述酶链的序列为： Acrydite-5-ATCTCTGAAGTAGCGCCGCCGTATAGT-3； 所述底物链的序列为： Acrydite-5-ACTCACTATrAGGAAGAGATGATCCACATTTTCA-3； 所述捕获链的序列为： NH2-(CH2)6-5-GAGAAAATGTGG-3； Acrydite表示丙烯酰胺基， rA表示腺嘌呤核糖核苷酸， 。

7、NH2表示氨基； (CH2)6表示连接捕 获链5端和氨基的间隔物。 8.根据权利要求1-7中任一项所述的一种基于DNA水凝胶的铅离子检测方法， 其特征在 于， 还包括步骤(3)定量检测： 配制标准溶液系列， 所述标准溶液系列包括若干标准溶液， 所 述标准溶液中的铅离子的浓度为已知， 且铅离子在若干标准溶液中的浓度相异； 将标准溶 液分别加入所述修饰电极上的DNA水凝胶中， 使酶链切割底物链， 获得若干标准电极， 再分 别测定标准电极的阻抗值； 建立阻抗值和标准溶液中的铅离子浓度的标准曲线； 再通过标 准曲线和步骤(2)中获得的待测电极的阻抗值， 获取待测样品中的铅离子浓度数值。 9.一种基于D。

8、NA水凝胶的铅离子检测设备， 其特征在于， 包括修饰电极， 所述修饰电极 权利要求书 1/2 页 2 CN 111239196 A 2 包括玻碳电极， 覆盖在玻碳电极外的纳米金颗粒层和固定在纳米金颗粒层上的DNA水凝胶； 所述DNA水凝胶包括由底物链和丙烯酰胺聚合形成的聚丙烯酰胺复合物P1、 由酶链和丙烯 酰胺聚合形成的聚丙烯酰胺复合物P2和牛血清蛋白； 酶链为脱氧核酶， 底物链上有酶链的 识别序列， 酶链用于在铅离子激活后在所述识别序列切割底物链， 且在酶链和底物链的5 端均修饰有丙烯酰胺基； 所述DNA水凝胶通过捕获链固定在纳米金颗粒层上； 所述捕获链为 单链DNA， 捕获链的5端通过氨基。

9、固定在纳米金颗粒层上， 所述捕获链用于与所述底物链形 成互补配对。 10.根据权利要求9所述的一种基于DNA水凝胶的铅离子检测设备的制备方法， 其特征 在于， 包括修饰电极的制备： 步骤(a)DNA水凝胶的制备： 将底物链加入丙烯酰胺溶液中， 在过硫酸铵的氧化作用和 N,N,N,N-四甲基乙二胺的催化作用下， 通过自由基聚合反应获得聚丙烯酰胺复合物P1； 将酶链加入丙烯酰胺溶液中， 在过硫酸铵的氧化作用和N,N,N,N-四甲基乙二胺的催化作 用下， 通过自由基聚合反应获得聚丙烯酰胺复合物P2； 将聚丙烯酰胺复合物P1、 聚丙烯酰胺 复合物P2和牛血清蛋白溶液混合， 获得混合溶液； 步骤(b)修。

10、饰电极的组装： 在玻碳电极表面电沉积纳米金颗粒层， 再将捕获链通过氨基 固载在纳米金颗粒层上， 并使用巯基己醇封闭表面非特异性位点； 再通过捕获链和底物链 的互补配对使得DNA水凝胶固定在纳米金颗粒层上， 获得修饰电极； 将DNA水凝胶固定在纳 米金颗粒层上的方法为： 将混合溶液滴加在纳米金颗粒层表面， 然后在35-40的条件下孵 育2h或2h以上。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111239196 A 3 一种基于DNA水凝胶的铅离子检测设备及其制备和检测方法 技术领域 0001 本发明属于污染物检测领域， 涉及一种铅离子检测设备及其制备和检测方法， 具 体涉及一种基于DNA水凝胶的铅离。

11、子检测设备及其制备和检测方法。 背景技术 0002 重金属产业对我国社会经济发展以及科学技术进步起到了重要的推动作用， 随着 重金属产品利用度加大， 人们逐渐认识到重金属元素对生态环境的破坏是非常严重的， 威 胁着人类的生存安全。 众所周知， 铅是重金属当中的一种， 由于铅离子(Pb2+)在环境中不能 被生物降解,而且可以通过食物链在生物体内富集， 甚至可以转化为毒性更强的化学形态。 所以重金属离子进入生物体后,会对生物体的正常生理功能和代谢功能造成不同程度的干 扰和损害,从而使生物体表现为中毒现象,严重时甚至死亡。 因此预防、 处理铅污染已经关 系到人类的生命健康问题， 如何发掘高灵敏和高选。

12、择性测定铅离子浓度的方法具有极其重 要的意义。 0003 传统的重金属检测技术包括原子吸收光谱法、 原子荧光光谱法、 原子发射光谱法 等， 这些方法都能够很好的检测痕量重金属离子， 但这些方法在检测的过程中普遍存在过 程繁琐、 仪器费用昂贵、 携带困难等其缺陷， 并且会因元素、 光谱等干扰而无法进行有效地 测定。 中国专利CN105296598A(基于8-17DNAzyme原理的铅离子荧光检测方法及其应用)公 布了利用脱氧核酶以及荧光淬灭原理实现铅离子的检测的方案。 其中， 脱氧核酶(DNAzyme) 由一个碱基环和两条单链侧臂构成， 在金属离子的作用下发生构象改变， 能将与其互补的 单链DN。

13、A链或单链RNA链连接或切断。 但是现有技术的检测手段需要使用荧光基团和淬灭基 团的标记核酸， 检测的灵敏度有限； 并且该检测方法缺少信号放大策略， 导致检出限值稍高 (该现有技术的Pb2+的最低检测限为20nM)， 不能满足对痕量铅离子检测的需求。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种基于DNA水凝胶的铅离子检测方法， 本方法结合脱氧 核酶和电化学方法， 通过信号放大策略， 可提高对铅离子的检测的灵敏度和降低检测限值。 0005 为解决上述技术问题， 本发明技术方案如下： 0006 一种基于DNA水凝胶的铅离子检测方法， 包括以下步骤： 0007 步骤(1)制备修饰电极： 所述修饰电。

14、极包括固定在外层的DNA水凝胶， 所述DNA水凝 胶包括由底物链和丙烯酰胺聚合形成的聚丙烯酰胺复合物P1、 由酶链和丙烯酰胺聚合形成 的聚丙烯酰胺复合物P2和蛋白质分子； 酶链为脱氧核酶， 底物链上有酶链的识别序列， 酶链 用于在铅离子激活后在所述识别序列切割底物链， 且在酶链和底物链的5 端均修饰有丙烯 酰胺基； 0008 步骤(2)电化学检测： 将待测样品加入所述修饰电极上的DNA水凝胶中， 使酶链切 割底物链， 获得待测电极， 再测定待测电极的阻抗值。 0009 采用上述技术方案， 技术原理如下： 将聚丙烯酰胺复合物P1、 P2以及蛋白质分子孵 说明书 1/9 页 4 CN 111239。

15、196 A 4 育到电极表面， 在电极表面形成三维网状的且包裹有蛋白质分子的DNA水凝胶层。 可使用现 有技术中的电化学工作站检测待测电极的阻抗值， DNA水凝胶中的聚丙烯酰胺和蛋白质分 子对检测底液中离子的扩散具有阻碍作用， 从而产生一个大的阻抗值。 当有Pb2+存在时， Pb2 +诱导酶链的活性中心形成， 特异性剪切底物链， 破坏电极表面形成的DNA水凝胶的同时释 放出蛋白质分子， 使得电极的阻抗值变小。 在Pb2+存在的情况下， 在底物链被剪切之后， DNA 水凝胶发生局部瓦解并逐渐脱落， 在瓦解的过程中蛋白质分子逐步释放， 直至剪切底物链 的反应充分。 Pb2+的浓度与DNA水凝胶的瓦。

16、解程度以及蛋白质分子的释放程度相对应， 使得 电化学阻抗值的减小值与相对应的Pb2+浓度成正比， 可以通过检测阻抗值的变化来实现对 Pb2+的高灵敏检测。 在本技术方案中， 底物链和酶链起到了感知和探测溶液环境中Pb2+浓度 情况的作用， 在Pb2+存在的情况下， 可根据其浓度情况， 酶链切割底物链(Pb2+促进酶链正确 折叠形成催化中心)， 使得聚丙烯酰胺形成的三维网状凝胶局部瓦解， 并同时释放网状结构 中包裹的蛋白质分子， 实现了Pb2+浓度信号的级联放大。 0010 有益效果： 0011 (1)本技术方案构建的修饰电极是一种电化学生物传感器， 可将生物分子识别过 程的特异性与电化学分析的。

17、强大功能相结合， 具有灵敏度高、 易微型化、 设备简单、 操作简 便、 能在复杂体系样品中进行检测等优势。 虽然已有现有技术利用脱氧核酶和Pb2+的相互作 用来检测Pb2+， 但是现有技术的检测方法对痕量的Pb2+还具有一定局限。 脱氧核酶切割底物 链并不会有电信号变化的发生， 将DNA断裂信号转化为稳定可靠的电信号是一个较难解决 的问题。 发明人巧妙地将脱氧核酶和Pb2+的相互作用和电化学检测相结合， 通过聚丙烯酰胺 和蛋白质分子两种物质将DNA断裂的信号转换成可量化的电信号， 实现了对痕量Pb2+的检 测。 0012 (2)脱氧核酶(DNAzyme)制备的DNA水凝胶中包裹蛋白质分子， 可。

18、实现信号放大， 从 而实现对Pb2+的高灵敏的测定。 本方案的检测方法以及检测系统的Pb2+检出限可达 0.24pmol/L， 远低于现有技术的Pb2+检出限， 可实现对痕量污染物的准确检测。 破坏的水凝 胶(即破坏聚丙烯酰胺形成的三维网状结构)和释放的蛋白质都可以使得电极表面的阻抗 值减小， 相当于将Pb2+的浓度信号进行的扩增放大， 增加了本方案的检测灵敏度。 0013 (3)本检测方法具有较广的线性范围， 在0.0005-500nmol/L范围内， 电化学阻抗值 随着Pb2+浓度增加而减小， 可满足多种实际应用场景的检测需求。 本检测方法的特异性好， 实验证明本方法对非目标离子产生的信号。

19、值与空白对照的电信号值相近， 对Pb2+具有较强 的选择性。 0014 (4)使用本法进行Pb2+的检测， 不用对样品进行特殊前处理， 无需特殊设备， 样品制 作方法简单。 0015 进一步， 在步骤(1)中， DNA水凝胶中包裹的蛋白质分子为牛血清蛋白。 0016 采用上述技术方案， 牛血清蛋白为常用的蛋白质分子， 已经商业化生产， 性质稳定 易于获取。 0017 进一步， 在步骤(1)中， 制备修饰电极的方法为： 在玻碳电极表面覆盖纳米金颗粒 层， 将捕获链固定在纳米金颗粒层上， 再通过捕获链将DNA水凝胶固定在纳米金颗粒层上； 所述捕获链为单链DNA， 捕获链的5 端通过间隔物连接有氨基。

20、， 所述捕获链用于与所述底物 链形成互补配对。 说明书 2/9 页 5 CN 111239196 A 5 0018 采用上述技术方案， 通过捕获链的5 端的氨基可将捕获链固定在纳米金颗粒层表 面， 再通过捕获链和底物链的互补配对， 可将DNA水凝胶固定在纳米金颗粒层上， 制备获得 修饰电极。 0019 进一步， 在步骤(1)中， 底物链上的酶链的识别序列为rA。 0020 采用上述技术方案， rA为腺嘌呤核糖核酸(腺嘌呤RNA)， 酶链可以识别该核酸并在 此位置剪切底物链。 0021 进一步， 在步骤(1)中， 所述DNA水凝胶的制备方法为： 将底物链加入丙烯酰胺溶液 中， 在过硫酸铵的氧化作。

21、用和N,N,N,N-四甲基乙二胺的催化作用下， 通过自由基聚合反 应获得聚丙烯酰胺复合物P1； 将酶链加入丙烯酰胺溶液中， 在过硫酸铵的氧化作用和N,N, N,N-四甲基乙二胺的催化作用下， 通过自由基聚合反应获得聚丙烯酰胺复合物P2； 将聚 丙烯酰胺复合物P1、 聚丙烯酰胺复合物P2和牛血清蛋白溶液混合， 获得DNA水凝胶。 0022 采用上述技术方案， 丙烯酰胺在氧化剂和催化剂的作用下可形成聚丙烯酰胺， 聚 丙烯酰胺为具有三维网状结构的凝胶， 凝胶中的空腔可以将牛血清蛋白包裹在其中。 聚丙 烯酰胺通过底物链与捕获链的结合固定在修饰电极上。 0023 进一步， 在步骤(2)中， 将待测样品加。

22、入所述修饰电极上的DNA水凝胶中， 在35-40 的条件下， 使酶链切割底物链的时长大于或等于1h。 0024 采用上述技术方案， 随着Pb2+剪切时间的延长， 阻抗值逐渐地减小， 这是因为滴加 到电极表面的Pb2+的时间越长， Pb2+可特异性剪切更多底物链， 从而破坏电极表面形成的水 凝胶， 释放更多的BSA， 使电极表面对铁氰根离子的阻碍作用明显降低， 从而产生较小的阻 抗值。 在60min之后其阻抗值就基本保持不变， 说明60min时Pb2+已经充分剪切底物链。 孵育 超过60min， 都可以让Pb2+充分剪切底物链。 0025 进一步， 所述酶链的序列为： Acrydite-5-AT。

23、CTCTGAAGTAGCGCCGCCGTATAGT-3； 0026 所述底物链的序列为： Acrydite-5-ACTCACTATrAGGAAGAGATGATCCACATTTTCA-3； 0027 所述捕获链的序列为： NH2-(CH2)6-5-GAGAAAATGTGG-3； 0028 Acrydite表示丙烯酰胺基， rA表示腺嘌呤核糖核苷酸， NH2表示氨基； (CH2)6表示连 接捕获链5 端和氨基的间隔物。 0029 采用上述技术方案， 捕获链、 酶链和底物链均为单链DNA， 酶链和底物链的5端均 通过共价键连接修饰有丙烯酰胺基(Acrydite)， 捕获链的5端均通过(CH2)6间隔。

24、物共价键 连接修饰有氨基(氨基用于与纳米金颗粒形成Au-N键)。 底物链的序列中包括一个腺嘌呤核 糖核苷酸(rA)， 是酶链切割底物链的识别位点， 酶链是一种脱氧核酶(DNAzyme)。 酶链由一 个碱基环和两条单链侧臂构成， 酶链的靠近5端的序列(5-ATCTCT-3)与底物链的靠近3 端的序列(5-AGAGAT-3)互补配对， 酶链靠近3 端的序列(5-ATAGT-3)与底物链靠近5 端的序列(5-ACTAT-3)互补配对。 两处的互补配对使得酶链和底物链可以互补结合， 并且 将rA暴露在碱基环对面， 当Pb2+存在时， 促进酶链正确折叠形成催化中心， 进而在rA处切割 底物链。 底物链靠。

25、近3端的序列(5-CCACATTTTC-3)与捕获链上的序列(5-AAAATGTGG- 3)形成互补配对， 捕获链可将底物链固定在纳米金颗粒表面。 0030 进一步， 还包括步骤(3)定量检测： 配制标准溶液系列， 所述标准溶液系列包括若 干标准溶液， 所述标准溶液中的铅离子的浓度为已知， 且铅离子在若干标准溶液中的浓度 相异； 将标准溶液分别加入所述修饰电极上的DNA水凝胶中， 使酶链切割底物链， 获得若干 说明书 3/9 页 6 CN 111239196 A 6 标准电极， 再分别测定标准电极的阻抗值； 建立阻抗值和标准溶液中的铅离子浓度的标准 曲线； 再通过标准曲线和步骤(2)中获得的待。

26、测电极的阻抗值， 获取待测样品中的铅离子浓 度数值。 0031 采用上述技术方案， 利用标准溶液系列中Pb2+浓度的差异， 找到Pb2+浓度和电化学 信号之间的关系， 绘制和建立反应电化学响应信号和标准溶液中Pb2+浓度之间关系的标准 曲线， 通过标准曲线可以获知待测样品中的Pb2+的具体浓度数值， 实现定量检测。 0032 进一步， 一种基于DNA水凝胶的铅离子检测设备， 其特征在于， 包括修饰电极， 所述 修饰电极包括玻碳电极、 覆盖在玻碳电极外的纳米金颗粒层和固定在纳米金颗粒层上的 DNA水凝胶； 所述DNA水凝胶包括由底物链和丙烯酰胺聚合形成的聚丙烯酰胺复合物P1、 由 酶链和丙烯酰胺。

27、聚合形成的聚丙烯酰胺复合物P2和牛血清蛋白； 酶链为脱氧核酶， 底物链 上有酶链的识别序列， 酶链用于在铅离子激活后在所述识别序列切割底物链， 且在酶链和 底物链的5端均修饰有丙烯酰胺基； 所述DNA水凝胶通过捕获链固定在纳米金颗粒层上； 所 述捕获链为单链DNA， 捕获链的5端通过氨基固定在纳米金颗粒层上， 所述捕获链用于与所 述底物链形成互补配对。 0033 采用上述技术方案， Pb2+依赖的脱氧核酶辅助形成的DNA水凝胶包裹蛋白质形成的 电化学生物传感器(修饰电极)， 可实现信号放大， 提高对Pb2+的高灵敏检测。 0034 进一步， 一种基于DNA水凝胶的铅离子检测设备的制备方法， 其。

28、特征在于， 包括修 饰电极的制备： 0035 步骤(a)DNA水凝胶的制备： 将底物链加入丙烯酰胺溶液中， 在过硫酸铵的氧化作 用和N,N,N,N-四甲基乙二胺的催化作用下， 通过自由基聚合反应获得聚丙烯酰胺复合物 P1； 将酶链加入丙烯酰胺溶液中， 在过硫酸铵的氧化作用和N,N,N,N-四甲基乙二胺的催 化作用下， 通过自由基聚合反应获得聚丙烯酰胺复合物P2； 将聚丙烯酰胺复合物P1、 聚丙烯 酰胺复合物P2和牛血清蛋白溶液混合， 获得混合溶液； 0036 步骤(b)修饰电极的组装： 在玻碳电极表面电沉积纳米金颗粒层， 再将捕获链通过 氨基固载在纳米金颗粒层上， 并使用巯基己醇封闭表面非特异。

29、性位点； 再通过捕获链和底 物链的互补配对使得DNA水凝胶固定在纳米金颗粒层上， 获得修饰电极； 将DNA水凝胶固定 在纳米金颗粒层上的方法为： 将混合溶液滴加在纳米金颗粒层表面， 然后在35-40的条件 下孵育2h或2h以上。 0037 采用上述技术方案， 可制备获得线性范围好、 检测限低、 准确度高和特异性好的电 化学生物传感器(修饰电极)。 附图说明 0038 图1为实施例1的电极逐步修饰过程的CV表征。 0039 图2为实施例1的电极逐步修饰过程的EIS表征(带Randle等效电路图)。 0040 图3为实施例1的修饰电极对不同浓度Pb2+检测的电化学阻抗图。 0041 图4为实施例1。

30、的修饰电极对不同浓度Pb2+检测的标准曲线。 0042 图5为对比例1的传感器对目标离子的选择性分析结果。 0043 图6为实验例1的电极的阻抗值与DNA水凝胶孵育时间的关系曲线。 0044 图7为实验例2的电极的阻抗值与Pb2+剪切时间的关系曲线。 说明书 4/9 页 7 CN 111239196 A 7 具体实施方式 0045 下面通过具体实施方式进一步详细说明： 0046 实施例1： 0047 1.复合物的制备： 0048 取浓度为100 M的捕获链溶液5 L， 加入Tirs-HCl(pH8)缓冲溶液195 L进行稀释 后摇匀， 配置成浓度为2.5 M的捕获链溶液后于-20的冰箱保存待用。

31、。 然后准确称取0.05g 的丙烯酰胺， 加入0.95mL的Tirs-HCl缓冲溶液配置成质量分数5的丙烯酰胺溶液。 接着准 确移取4 L(100 M)的底物链溶液和16 L的5丙烯酰胺溶液混合后摇匀(混合溶液A)， 同时 移取4 L(100 M)的酶链溶液和16 L的5丙烯酰胺溶液混合后摇匀(混合溶液B)。 再将混合 后的溶液(混合溶液A和B)放置在37的真空干燥箱内10min。 将新鲜配置的0.28 L APS(过 硫酸铵)(10,w/w APS)和0.56 L TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺)(5,v/v)溶液立即 分别添加到混合溶液A和B中(APS和TEMED溶液均需要现配现。

32、用)， 摇匀。 然后放置在37真 空干燥箱内15min进行聚合反应分别生成聚丙烯酰胺复合物P1和聚丙烯酰胺复合物P2， 然 后放置在4冰箱待用， P1和P2均用于后续的DNA水凝胶的制备。 0049 捕获链、 酶链和底物链均为单链DNA， 它们的DNA序列见表1(所有的寡核苷酸由生 工生物工程(上海)股份有限公司(中国， 上海)合成并纯化)。 在表1中， 酶链(SEQ ID NO:1) 和底物链(SEQ ID NO:2)的5端均通过共价键连接修饰有丙烯酰胺基(Acrydite)， 捕获链 (SEQ ID NO:3)的5端均通过(CH2)6间隔物共价键连接修饰有氨基(氨基用于与纳米金颗粒 形成A。

33、u-N键)。 酶链、 底物链和捕获链均为单链DNA， 底物链的序列中(第10位核酸)为一个腺 嘌呤核糖核苷酸(rA， 为RNA、 非DNA)， 是酶链切割底物链的识别位点， 底物链除了第10位是 核糖核酸(RNA)外， 其他均为脱氧核糖核酸(DNA)。 酶链是一种脱氧核酶(DNAzyme)， 酶链由 一个碱基环和两条单链侧臂构成， 酶链的靠近5端的序列(5-ATCTCT-3)与底物链的靠近 3端的序列(5-AGAGAT-3)互补配对， 酶链靠近3端的序列(5-ATAGT-3)与底物链靠近 5端的序列(5-ACTAT-3)互补配对。 两处的互补配对使得酶链和底物链可以互补结合， 并 且将rA暴露。

34、在碱基环对面， 当Pb2+存在时， 促进酶链正确折叠形成催化中心， 进而在rA处切 割底物链。 底物链靠近3端的序列(5-CCACATTTTC-3)与捕获链上的序列(5-AAAATGTGG- 3)形成互补配对， 捕获链可将底物链固定在纳米金颗粒表面。 0050 表1： DNA序列表 0051 0052 2.修饰电极的制备 0053 使用前， 将玻碳电极在麂皮上用0.3 m或0.05 m的三氧化二铝(Al2O3)粉末打磨干 净， 用超纯水将其清洗干净后在室温下晾干备用。 将抛光处理至光滑镜面的玻碳电极浸入 到1的HAuCl4溶液中， 在-0.2V电位下沉积金30s后， 在电极表面沉积一层均匀的纳。

35、米金颗 粒(AuNPs)， 将电极用超纯水清洗干净待用。 修饰电极的构建步骤如下： 首先在沉积金后的 电极表面滴加8 L的捕获链溶液(2.5 M)于室温下孵育12h。 孵育好后用超纯水清洗干净， 再 说明书 5/9 页 8 CN 111239196 A 8 在电极表面滴加8 L的巯基己醇(MCH， 1mmol/L)封闭电极表面的非特异性位点， 在室温下孵 育20min后用超纯水清洗干净后静置。 将配置好的聚丙烯酰胺复合物P1、 P2(上一个步骤中 制备的P1和P2全部加入)及10 L的BSA(5 mol/L)(本实施例具体使用的蛋白质分子为牛血 清蛋白)溶液混合后摇匀， 获得混合溶液， 取8 。

36、L的上述混合溶液滴加到电极表面， 放入37 (37为最适温度， 35-40均可达到上述目的)的烘箱中孵育2h， 在纳米金颗粒层表面孵育 得到一层DNA凝胶(按照上述操作， 可保证凝胶中酶链和底物链的用量比为1:1)。 孵育之后 用超纯水清洗干净， 再在电极上滴加8 L不同浓度超纯水配制的Pb2+， (即不同浓度的标准溶 液， 其中Pb2+浓度分别为： 0.0005nM,0.001nM， 0.01nM， 0.1nM， 1nM， 10nM， 100nM， 500nM， 均由 标准母液配置而成， 标准母液由国家有色金属及电子材料分析测试中心(北京， 中国)提供) 放入37(37为最适温度， 35-4。

37、0均可达到上述目的)的烘箱中孵育1h。 用超纯水轻轻清 洗后， 将上述修饰好的玻碳电极(即为标准电极)浸入到检测底液中， 连接电化学工作站， 即 可用于电化学测定。 0054 本实施例采用传统的三电极来检测电极的电流， 其中滴加有Pb2+的修饰电极作为 工作电极， 铂丝电极为辅助电极， 饱和的甘汞电极(SCE)为参比电极。 采用5mmol/LFe (CN)63-/4-(且含有0.1mol/L KCl)的缓冲液作为循环伏安法(CV)的测试底液对电极修饰过 程中界面电化学性质的变化进行表征， 扫描电位范围为-0.2-0.6V， 电位扫描速度为50mV/ s； 选择电化学阻抗法(EIS)在5mmol。

38、/LFe(CN)63-/4-(含有0.1mol/L KCl)的测试底液中对 电极修饰过程进行表征以及实验条件的优化， 生物传感器(修饰电极)性能的考察。 EIS的参 数为： 振幅为0.005V， 扫描频率范围为0.1Hz-100KHz。 0055 3.修饰电极的表征 0056 在浓度为5mmol/L的Fe(CN)63-/4-溶液中， 通过测试CV响应信号表征修饰电极的 制备过程。 如图1所示， 裸电极(未加任何修饰的玻碳电极， GCE)的CV曲线表现出对准可逆的 Fe(CN)63-/4-的氧化还原峰(曲线a:GCE)， 当沉积金后， 由于纳米金可促进电子传递， CV响 应信号有所增强(曲线b:。

39、GCE/Au)。 当捕获链修饰到电极表面上时， 因为带有负电荷的捕获 链对同样带有负电荷的Fe(CN)63-/4-具有排斥作用， 导致其逐渐远离电极表面， 响应信号 有所降低(曲线c:GCE/Au/捕获链)。 用电惰性的MCH封闭非特异性位点后响应信号进一步降 低(曲线d:GCE/Au/捕获链/MCH)， 最后将聚丙烯酰胺复合物P1、 P2及BSA孵育到电极表面形 成DNA水凝胶后， 利用DNA水凝胶的三维网状结构， 将BSA包裹在水凝胶内， 由于水凝胶和BSA 对铁氰根离子的扩散具有阻碍作用， 使铁氰化物难以扩散到电极表面发生氧化还原反应， 使CV响应信号大大降低(曲线e:GCE/Au/捕获。

40、链/MCH/DNA水凝胶)。 当加入Pb2+之后， Pb2+活 化酶链特异性剪切底物链， 从而破坏电极表面形成的DNA水凝胶， 并释放BSA， 电极表面阻碍 电子传递的物质减少， CV响应信号增强(曲线f:GCE/Au/捕获链/MCH/DNA水凝胶/Pb2+)。 通过 以上的CV表征结果， 证明传感器(修饰电极)的构建是成功的。 0057 此外， 使用EIS进一步表征了修饰电极的制备过程。 如图2所示， 裸电极的EIS曲线 具有较小的阻抗值(曲线a:GCE)， 当纳米金沉积上去之后， 由于其能促进电子的传递， 阻抗 值明显减小， 阻抗图谱几乎是一条直线(曲线b:GCE/Au)。 然后将捕获链修。

41、饰到电极表面上 时， 阻抗值进一步增大(曲线c:GCE/Au/捕获链)。 接着用MCH封闭电极表面的非特异性位点 后， 阻抗值进一步增大(曲线d:GCE/Au/捕获链/MCH)， 最后将聚丙烯酰胺复合物P1、 P2及牛 血清蛋白(BSA)孵育到电极表面形成DNA水凝胶， 利用DNA水凝胶的三维网状结构， 将BSA包 说明书 6/9 页 9 CN 111239196 A 9 裹在水凝胶内， 由于水凝胶和BSA对铁氰根离子的扩散具有较强的阻碍作用， 使铁氰化物难 以扩散到电极表面发生氧化还原反应， 从而产生一个较大的阻抗值(曲线e:GCE/Au/捕获 链/MCH/DNA水凝胶)。 将Pb2+加到水。

42、凝胶包裹BSA的电极表面， Pb2+活化酶链特异性剪切底物 链， 从而破坏电极表面形成的DNA水凝胶， 同时释放出BSA， 使电极表面对铁氰根离子的阻碍 作用明显降低， 阻抗值降低(曲线f:GCE/Au/捕获链/MCH/DNA水凝胶/Pb2+)。 CV和EIS表征结 果具有一致性， 证明传感器(修饰电极)是成功构建的。 0058 4.标准曲线的建立 0059 为了验证所构建的生物传感器(修饰电极)是否对Pb2+具有高灵敏度和定量检测的 潜能， 在5mmol/LFe(CN)63-/4-的底液中对不同Pb2+浓度处理后的修饰电极进行EIS检测。 如 图3所示， 在0.0005-500nmol/L范。

43、围内， 电化学阻抗值随着Pb2+浓度增加而减小。 图4给出了 其对应的阻抗值与Pb2+浓度对数的标准曲线， 线性方程为： R-704.37lgc-3608.15(c为Pb2 +的浓度)， 相关系数r0.9971， 计算得出检出限为0.24pmol/L。 :实验数据表明， 所构建的 生物传感器可以应用于Pb2+的定量检测， 且检出限值低， 可适应于低Pb2+浓度样品的检测。 0060 实施例2 0061 本实施例使用实施例1建立的检测体系对样品进行检测。 为了验证此本方案的Pb2+ 检测方法在实际样品分析中是否具有实用性， 我们在不同样品(包括自来水和湖水)中加入 不同浓度的Pb2+溶液获得待测。

44、样品(待测样品情况如表1所示，“加入的Pb2+浓度” 表示样品 中的实际的Pb2+浓度)， 并使用实施例1构建的检测系统(包括标准曲线在内)， 对于待测样品 和待测电极进行EIS的测定。 具体操作如下： 按照实施例1的方法在覆盖有纳米金颗粒的玻 碳电极上覆盖DNA水凝胶， 然后在修饰电极上滴加8 L待测样品， 放入37的烘箱中孵育1h。 用超纯水轻轻清洗后， 将上述修饰好的玻碳电极(即为待测电极)浸入到检测底液中， 连接 电化学工作站， 即可用于电化学测定， 且电化学检测条件同实施例1。 根据实施例1中的标准 曲线进行实验结果的分析， 分析后的数据列于表2中( “测量得到的Pb2+浓度” 表示。

45、Pb2+浓度 的检测值)。 实际样品的回收率在91至107.6之间， 由表2结果可知， 具有较好的回收率。 因此， 所构建的检测方法和修饰电极对检测环境中水溶液中的Pb2+具有实用性和检测准确 性。 0062 表2： 环境样品溶液中Pb2+浓度检测结果 0063 0064 对比例1： 说明书 7/9 页 10 CN 111239196 A 10 0065 为了验证所构建的生物传感器是否对Pb2+具有选择性， 在最优实验条件下， 我们用 浓度均为50nmol/L的十种干扰离子Cu2+、 Mn2+、 Ni2+、 Co2+、 Ca2+、 Cd2+、 Ag2+、 Ba2+、 Cr2+、 Al3+、 F。

46、e2+ 和浓度为1nmol/L的目标离子Pb2+进行干扰实验。 检测方法图实施例2， 只是使用纯水配置上 述金属离子浓度的溶液， 来代替待测样品。 如图5所示， 十一种离子中只有Pb2+的电信号较 小， 其他十种离子信号值都比较高与空白值相近， 说明所构建的生物传感器是对Pb2+具有选 择性。 0066 实验例1： DNA水凝胶的孵育时间的优化 0067 DNA水凝胶孵育时间的优化是基于Pb2+孵育时间的长短导致电化学阻抗值变化来 确定， 使用不同的孵育时间来检测阻抗值(将包裹有蛋白质分子的DNA水凝胶溶液滴加到电 极表面， 再进行孵育的步骤)， 实验结果如图6所示， 从图6中可以看到， 随着。

47、孵育时间的延 长， 阻抗值在逐渐地增加。 这是因为孵育时间越长， 在电极表面形成的DNA水凝胶越多， 利用 DNA水凝胶的三维网状结构， 将BSA包裹在水凝胶内， 水凝胶和BSA对铁氰根离子的扩散的阻 碍作用越大， 产生更大的阻抗值。 在120min之后其阻抗值就基本保持不变， 说明在120min 时， DNA水凝胶在电极表面已经完全形成。 因此选择120min作为电极表面DNA水凝胶的最佳 孵育时间(实施例1中采用了37的烘箱中孵育2h的孵育条件)。 孵育超过120min， 都可以让 DNA水凝胶在电极表面完全形成。 0068 实验例2： Pb2+的剪切时间的优化 0069 本实验例探究了P。

48、b2+的剪切时间与电化学阻抗值之间的关系。 使用不同的剪切时 间来检测阻抗值(即将Pb2+溶液滴加到修饰电极上， 再进行孵育的步骤， 在孵育当中Pb2+作 用于酶链对底物链进行剪切)， 结果如图7所示。 从图7中， 随着Pb2+剪切时间的延长， 阻抗值 逐渐地减小， 这是因为滴加到电极表面的Pb2+的时间越长， Pb2+可特异性剪切更多底物链， 从而破坏电极表面形成的水凝胶和释放出的BSA越多， 使电极表面对铁氰根离子的阻碍作 用明显降低， 产生的阻抗值就越小。 在60min之后其阻抗值就基本保持不变， 说明60min时 Pb2+已经充分剪切底物链。 因此选择60min作为Pb2+的最佳剪切时。

49、间(实施例1中采用了37 的烘箱中孵育1h)。 孵育时间超过60min， 都可以让Pb2+充分剪切底物链。 0070 以上所述的仅是本发明的实施例， 方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作 过多描述。 应当指出， 对于本领域的技术人员来说， 在不脱离本发明结构的前提下， 还可以 做出若干变形和改进， 这些也应该视为本发明的保护范围， 这些都不会影响本发明实施的 效果和专利的实用性。 本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准， 说明书中的 具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。 0071 说明书 8/9 页 11 CN 111239196 A 11 0072 说明书 9/9 页 。

50、12 CN 111239196 A 12 SEQUENCE LISTING 重庆文理学院 一种基于DNA水凝胶的铅离子检测设备及其制备和检测方法 2020.01.13 3 PatentIn version 3.5 1 27 DNA 人工序列 1 atctctgaag tagcgccgcc gtatagt 27 2 33 DNA 人工序列 2 actcactata ggaagagatg atccacattt tca 33 3 12 DNA 人工序列 3 gagaaaatgt gg 12 序列表 1/1 页 13 CN 111239196 A 13 图1 图2 说明书附图 1/4 页 14 CN 。