稠环吡啶酮衍生物及其制备方法和用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010142594.5 (22)申请日 2020.03.04 (71)申请人 江苏柯菲平医药股份有限公司 地址 210000 江苏省南京市玄武区徐庄路6 号1幢 (72)发明人 秦引林苏梅王德忠王伟 娄雅静王姗殷连珍 (74)专利代理机构 南京纵横知识产权代理有限 公司 32224 代理人 刘艳艳 (51)Int.Cl. C07D 498/14(2006.01) C07D 519/00(2006.01) A61K 31/5383(2006.01) A61P 31/16(20。

2、06.01) (54)发明名称 一种稠环吡啶酮衍生物及其制备方法和用 途 (57)摘要 本发明公开了一种稠环吡啶酮衍生物及其 制备方法和用途， 为式I所示的化合物， 或其旋光 异构体、 对映体、 非对映体、 外消旋体或外消旋混 合物， 或其溶剂合物、 前药， 或其药学上可接受的 盐。 所述的化合物、 包含所述化合物的药物组合 物在制备预防和/或治疗病毒性感染疾病的药物 中的应用。 所述病毒性感染疾病为具有帽依赖性 核酸内切酶的病毒引起的疾病， 更为具体的是流 感A型或流感B型引起的感染性疾病。 权利要求书6页 说明书23页 CN 111233891 A 2020.06.05 CN 111233。

3、891 A 1.一种化合物， 其特征在于， 为式I所示的化合物， 或其旋光异构体、 对映体、 非对映体、 外消旋体或外消旋混合物， 或其溶剂合物、 前药， 或其药学上可接受的盐； 其中， M选自氧、 硫、 N-R； B选自OH、 OR1、 NH2、 NR1R2； 并且， 在式I所示的化合物中， 以下的化合物除外， 其中， P为H或R1。 2.根据权利要求1所述的化合物， 其特征在于， 其中， R选自H、 直链或支链烷基、 环烷基、 烷氧基、 芳基、 饱和或不饱和杂环基； R表示的 基团中任一个H可被任意的卤素、 氰基、 氨基、 羟基、 硝基、 羧基、 甲酯基、 乙酯基取代， 任一 个-CH2-。

4、可被环戊烷基、 环丙烷基或环丁烷基取代； R1选自下式中的基团： a)-C(O)-PR0、 b)-C(O)-PR1、 g)-C(O)-O-PR2、 h)-C(O)-N(-K)(PR2)、 i)-C(O)-O-L-O-PR2、 l)-C(PR3)2-O-C(O)-PR4、 m)-C(PR3)2-O-C(O)-O-PR4、 o)-C(PR3)2-O-C(O)-O-L-O-PR4、 v)-C(PR3)2-PR6、 x)-C(PR3)2-C(PR3)2-C(O)-O-PR2、 y)-C(PR3)2-N(-K)-C(O)-O-PR2、 z)-P(O)(-PR8)(-PR9)； 权利要求书 1/6 页 2。

5、 CN 111233891 A 2 式中， L为直链或支链状的亚烷基， K为氢、 或任选被取代基组A取代的烷基， PR0为任选被取代基组A取代的烷基， PR1为任选被取代基组A取代的饱和或不饱碳环基、 任选被取代基组A取代的饱和或不饱 杂环基， PR2为任选被取代基组A取代的烷基、 任选被取代基组A取代的饱和或不饱和碳环基、 任 选被取代基组A取代的饱和或不饱杂环基、 任选被取代基组A取代的杂环烷基， PR3各自独立地为氢或烷基， PR4为任选被取代基组A取代的烷基、 任选被取代基组A取代的碳环基、 任选被取代基组A 取代的杂环基， PR6为任选被取代基组A取代的碳环基、 或任选被取代基组A取。

6、代的杂环基， PR8为任选被取代基组A取代的烷氧基， PR9为任选被取代基组A取代的烷氧基、 任选被取代基组A取代的烷氧氨基、 任选被取代 基组A取代的碳环氧基、 任选被取代基组A取代的杂环氧基、 任选被取代基组A取代的碳环氨 基或任选被取代基组A取代的杂环氨基， 并且， PR8及PR9任选与邻接的磷原子共同形成任选被取代基组A取代的杂环， 取代基组A： 氧代基、 烷基、 烷基氨基、 碳环基、 杂环基、 烷基羰基、 卤素、 羟基、 烷基羰基 氨基、 烷基羰氧基、 烷氧基羰基、 烷氧基羰基烷基、 烷基氨基羰氧基、 烷氧基、 硝基、 叠氮基、 烷基磺酰基、 三烷基甲硅烷基； R2独立地选自H、 烷。

7、基、 烷基氨基、 碳环基、 杂环基、 烷基羰基、 烷氧基羰基、 上述所述的取 代基团中的H可被任意的卤素、 氰基、 氨基、 羟基、 硝基、 羧基、 甲酯基、 乙酯基取代。 3.根据权利要求2所述的化合物， 其特征在于， 式I所示的化合物选自： 4.根据权利要求1所述的化合物， 其特征在于， 式I所示的化合物选自： 权利要求书 2/6 页 3 CN 111233891 A 3 权利要求书 3/6 页 4 CN 111233891 A 4 权利要求书 4/6 页 5 CN 111233891 A 5 5.根据权利要求1所述的化合物， 其特征在于， 式I所示的化合物选自： 权利要求书 5/6 页 6。

8、 CN 111233891 A 6 6.一种药物组合物， 其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物， 或及可药用的载 体、 佐剂或媒剂。 7.权利要求1所述的化合物、 权利要求6所述的药物组合物在制备预防和/或治疗病毒 性感染疾病的药物中的应用。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述病毒性感染疾病为具有帽依赖性核酸 内切酶的病毒引起的疾病。 9.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述病毒性感染疾病包括流行性感冒。 10.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述病毒性感染疾病包括流感A型或流感 B型引起的感染性疾病。 权利要求书 6/6 页 7 CN 1112338。

9、91 A 7 一种稠环吡啶酮衍生物及其制备方法和用途 技术领域 0001 本发明属于医药技术领域， 具体涉及一种稠环吡啶酮衍生物及其制备方法和用 途。 背景技术 0002 流行性感冒是由流行性感冒病毒引起的急性呼吸道感染病。 流行性感冒在世界范 围内流行是一个严重的公共卫生问题。 每年都有不同程度的爆发、 流行， 随着近年来交通更 加发达， 世界交流增多和全球气候回暖， 导致流行性感冒的传播进一步增强。 0003 流感病毒为正黏病毒科(Orthomyxoviridae)， 属于RNA病毒， 根据病毒核蛋白和基 质蛋白， 分为甲型、 乙型、 丙型。 每型均有8个不同的RNA节段， 编码至少10-。

10、11种蛋白。 在流感 病毒的生命历程中， 8段RNA片段的转录是一个关键的步骤。 这个步骤需要进行病毒反义RNA 的转录和复制。 RNA聚合酶是由PA、 PB1和PB2三个亚基组成的三聚体， 在感染的细胞核内负 责病毒RNA的复制和转录。 流感病毒的RNA的转录具有特殊的作用机制， PB2亚基负责识别和 结合宿主细胞前提mRNA的 “帽子结构” ， PA亚基剪切宿主细胞的mRNA作为引物， 启动转录过 程PA亚基的内切酶活性位点， 负责切割宿主细胞的mRNA， 在PB1亚基中用作进一步病毒mRNA 合成的引物。 PA亚基的帽依赖性内切核酸酶是病毒生命过程中必须的， 且具有宿主细胞所 不具备的病。

11、毒特异性酶活性。 所以选择帽依赖性内切核酸酶作为抗流感药物的靶点进行药 物开发是科学和合理的。 发明内容 0004 为解决现有技术中存在的技术问题， 本发明提供一种稠环吡啶酮衍生物及其制备 方法和用途。 0005 为达上述技术效果， 本发明采用以下技术方案： 0006 本发明目的之一在于提供一种化合物， 其特征在于， 为式I所示的化合物， 或其旋 光异构体、 对映体、 非对映体、 外消旋体或外消旋混合物， 或其溶剂合物、 前药， 或其药学上 可接受的盐； 0007 0008 其中， M选自氧、 硫、 N-R； B选自OH、 OR1、 NH2、 NR1R2； 说明书 1/23 页 8 CN 11。

12、1233891 A 8 0009 并且， 在式I所示的化合物中， 以下的化合物除外， 0010 0011 其中， P为H或R1。 0012 其中， R选自H、 直链或支链烷基、 环烷基、 烷氧基、 芳基、 饱和或不饱和杂环基； R表 示的基团中任一个H可被任意的卤素、 氰基、 氨基、 羟基、 硝基、 羧基、 甲酯基、 乙酯基取代， 任 一个-CH2-可被环戊烷基、 环丙烷基或环丁烷基取代； 0013 R1选自下式中的基团： 0014 a)-C(O)-PR0、 0015 b)-C(O)-PR1、 0016 g)-C(O)-O-PR2、 0017 h)-C(O)-N(-K)(PR2)、 0018 。

13、i)-C(O)-O-L-O-PR2、 0019 1)-C(PR3)2-O-C(O)-pR4、 0020 m)-C(PR3)2-O-C(O)-O-PR4、 0021 o)-C(PR3)2-O-C(O)-O-L-O-PR4、 0022 v)-C(PR3)2-PR6、 0023 x)-C(PR3)2-C(PR3)2-C(O)-O-PR2、 0024 y)-C(PR3)2-N(-K)-C(O)-O-PR2、 0025 z)-P(O)(-PR8)(-PR9)； 0026 式中， L为直链或支链状的亚烷基， 0027 K为氢、 或任选被取代基组A取代的烷基， 0028 PR0为任选被取代基组A取代的烷基，。

14、 0029 PR1为任选被取代基组A取代的饱和或不饱碳环基、 任选被取代基组A取代的饱和或 不饱杂环基， 0030 PR2为任选被取代基组A取代的烷基、 任选被取代基组A取代的饱和或不饱和碳环 基、 任选被取代基组A取代的饱和或不饱杂环基、 任选被取代基组A取代的杂环烷基， 0031 PR3各自独立地为氢或烷基， 0032 PR4为任选被取代基组A取代的烷基、 任选被取代基组A取代的碳环基、 任选被取代 基组A取代的杂环基， 0033 PR6为任选被取代基组A取代的碳环基、 或任选被取代基组A取代的杂环基， 0034 PR8为任选被取代基组A取代的烷氧基， 0035 PR9为任选被取代基组A取。

15、代的烷氧基、 任选被取代基组A取代的烷氧氨基、 任选被 取代基组A取代的碳环氧基、 任选被取代基组A取代的杂环氧基、 任选被取代基组A取代的碳 说明书 2/23 页 9 CN 111233891 A 9 环氨基或任选被取代基组A取代的杂环氨基， 并且， 0036 PR8及pR9任选与邻接的磷原子共同形成任选被取代基组A取代的杂环， 0037 取代基组A： 氧代基、 烷基、 烷基氨基、 碳环基、 杂环基、 烷基羰基、 卤素、 羟基、 烷基 羰基氨基、 烷基羰氧基、 烷氧基羰基、 烷氧基羰基烷基、 烷基氨基羰氧基、 烷氧基、 硝基、 叠氮 基、 烷基磺酰基、 三烷基甲硅烷基； 0038 R2独立地。

16、选自H、 烷基、 烷基氨基、 碳环基、 杂环基、 烷基羰基、 烷氧基羰基、 上述所 述的取代基团中的H可被任意的卤素、 氰基、 氨基、 羟基、 硝基、 羧基、 甲酯基、 乙酯基取代。 0039 本发明的目的之二在于提供所述化合物及、 包含所述化合物的药物组合物在制备 预防和/或治疗病毒性感染疾病的药物中的应用。 所述病毒性感染疾病为具有帽依赖性核 酸内切酶的病毒引起的疾病， 更为具体的是流感A型或流感B型引起的感染性疾病。 0040 有益效果： 相对于现有技术， 本发明的化合物提高了药物的抗病毒活性、 口服吸 收、 生物利用度。 更具体地， 本发明的化合物和/或本发明的化合物的母体化合物具有如。

17、下 优点， 即代谢稳定性高、 口服吸收性高， 良好的生物利用度等， 因此本发明的化合物具有更 好的成药性。 具体实施方式 0041 以下结合实施例进一步描述本发明， 但这些实施例并非限制着本发明的范围， 凡 在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。 下面 实施例未注明具体条件的实验方法， 通常按照本领域的公知手段。 下述实施例中所用的试 验材料， 如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。 0042 制备中间体Int-1 0043 0044 合成路线如下： 说明书 3/23 页 10 CN 111233891 A 10 0045 0046 步骤1.1化。

18、合物1的制备 0047 在氮气保护条件下， 向反应瓶中加入SM1(20.23g， 0.2mol)和无水THF(400mL)， 搅 拌降温至-78， 在此温度下滴加n-BuLi(80mL， 0.2mol)， 维持温度在-68-78， 滴加完 毕， 反应在此温度下继续搅拌60min。 继续滴加氯甲酸烯丙酯(24.2g， 0.2mol)， 维持温度在- 68-78， 滴加完毕， 反应在此温度下继续搅拌30min。 加入饱和氯化铵溶液搅拌20min， 加入乙酸乙酯， 萃取分层。 有机相用饱和食盐水洗涤一次， 无水硫酸钠干燥、 过滤、 浓缩、 室 温真空干燥过夜得到化合物1(26.4g， 收率71.28。

19、)。 0048 步骤1.2化合物2的制备 0049 在氮气保护条件下， 向反应瓶中加入化合物1(2.9g， 15.7mmol)和无水THF(30mL) 说明书 4/23 页 11 CN 111233891 A 11 搅拌降温至-78， 在此温度下滴加DIBAL-H(2.9g， 20.4mmol)， 维持温度在-68-78， 滴加完毕， 反应在此温度下继续搅拌60min。 加入丙酮(20mL)， 饱和氯化铵溶液(30mL)搅拌 20min， 加入乙酸乙酯， 萃取分层(30mL*2)。 有机相用饱和食盐水洗涤一次， 无水硫酸钠干 燥、 过滤、 浓缩、 室温真空干燥过夜得到化合物2(1.5g， 收率。

20、51.7)。 0050 步骤1.3化合物3的制备 0051 向反应瓶中加入化合物2(1 .5g， 8mmol)， 甲醇(15mL)， 对甲苯磺酸(0 .15g， 0.8mmol)， 室温下搅拌过夜。 加入饱和碳酸氢钠溶液(20mL)， 浓缩除去甲醇， 加入乙酸乙酯， 萃取分层(20mL*2)。 有机相用饱和食盐水洗涤一次， 无水硫酸钠干燥、 过滤、 浓缩、 室温真空 干燥过夜得到化合物3(0.5g， 收率31.25)。 0052 1H NMR(400MHz， CDCl3)： 85.85-5.95(m， 1H)， 5.05-5.30(m， 3H)， 4.58-4.60(m， 2H)， 3.88-。

21、3.94(m， 2H)， 3.74-3.81(t， 1H)， 3.44-3.51(q， 2H)， 3.24-3.39(m， 4H). 0053 步骤1.4化合物4的制备 0054 在氮气保护条件下， 向250mL反应瓶中加入化合物SM2(20g， 81mmol)、 DMF(100mL)、 碘乙烷(22.8g， 146mmol)， DBU(18.57g， 122mmol)， 室温搅拌20h。 向上述反应体系中加入饱 和NH4Cl溶液搅拌10min， 加入乙酸乙酯萃取。 有机相用饱和NaCl洗一次， 无水硫酸钠干燥、 过滤、 浓缩、 室温真空干燥过夜得到化合物4(24g， 收率100)。 0055。

22、 步骤1.5化合物5的制备 0056 在氮气保护条件下， 向250mL反应瓶中加入化合物4(5g， 18.23mmol)、 DMA(50mL)、 肼基甲酸叔丁酯(3.61g， 27.32mmol)、 对甲苯磺酸吡啶盐(13.7g， 54.52mmol)， 60搅拌 20h。 加入水搅拌10min， 加入乙酸乙酯萃取。 有机相用饱和NH4Cl溶液和饱和NaCl溶液洗一 次， 无水Na2SO4干燥， 有机相旋干。 硅胶柱纯化， PE EA2 1冲洗杂质， 杂质冲完后， 用EA冲洗 目标产物， 洗脱液浓缩、 真空继续干燥过夜得到化合物5(2.7g， 收率38.14)， 黄色油状物。 0057 步骤1。

23、.6化合物6的制备 0058 在氮气保护条件下， 向250mL反应瓶中加入化合物5(12.6g， 32.44mmol)、 盐酸乙酸 乙酯溶液(500mL， 4M)， 室温搅拌3h。 加入饱和NaHCO3溶液搅拌10min， 加入二氯甲烷萃取。 有 机相用饱和NaCl溶液洗一次， 无水硫酸钠干燥、 过滤、 浓缩、 室温真空干燥过夜得到化合物6 (8.6g， 收率92.47)， 黄色油状物。 0059 1H NMR(400MHz， CDCl3)： 7.29-7.33(m， 4H)， 6.2-6.36(d， J8Hz， 1H)， 5.28-5.44 (s， 2H)， 5.23(s， 2H)， 4.2。

24、4-4.32(q， 2H)， 1.21-1.28(t， 3H). 0060 步骤1.7化合物7&8的制备 0061 在氮气保护条件下， 向250mL反应瓶中加入化合物6(8.6g， 29.83mmol)， 化合物3 (7.2g， 35.80mmol)， 乙腈(150mL)降温至-25， 滴加SnCl4(52.2g， 44.75mmol)， 滴加结束后 搅拌4小时。 加入饱和NaHCO3溶液搅拌10min， 加入二氯甲烷萃取。 有机相用饱和NaCl溶液洗 一次， 无水Na2SO4干燥， 有机相旋干。 室温真空干燥1h， 得粗品化合物7。 在氮气保护条件下， 向反应瓶中加入上述得到的粗品化合物7、。

25、 THF(200mL)、 SM3(26mL)、 四(三苯基膦)钯(4.0g， 3.0mmol)， 室温搅拌2h。 加入MTBE(400mL)搅拌一小时。 抽滤， 固体用MTBE淋洗， 固体室温下 真空干燥过夜得到化合物8(7.5g， 收率100)。 0062 步骤1.8化合物9的制备 0063 室温条件下， 向反应瓶中依次加入化合物8(66g， 0.202mol)， T3P(333g， 0.52mol)， 说明书 5/23 页 12 CN 111233891 A 12 TEA(81g， 0.81mol)， EA(240mL)升温至60， 滴加SM4(27g， 0.238mol)， 滴加结束后搅。

26、拌过 夜。 降温至0， 搅拌1h， 滤出析出的固体， 用乙酸乙酯(300mL)和无水乙醇(300mL)淋洗固 体， 固体加入二氯甲烷加热至30刚好溶解， 共加二氯甲烷(300mL)， 搅拌下加入无水乙醇 (300mL)， 有固体析出， 继续保温搅拌3h， 过滤， 滤饼用少量无水乙醇淋洗， 抽干， 滤饼室温下 真空干燥过夜得到化合物9(36.7g， 收率43)。 0064 步骤1.9化合物10的制备 0065 室温条件下， 向反应瓶中依次加入化合物9(35g， 0.08mol)， DBU(0.24g， 1.6mmol)， 无水乙醇(250mL)， 30搅拌30min， 然后向反应体系中加入异丙醚。

27、(450mL)， 在此温度下继 续搅拌30min， 反应体系降温至0搅拌1h， 抽滤出固体并用乙酸乙酯淋洗固体， 固体真空干 燥， 得化合物11固体(25.17g， 收率93.46)。 0066 1H NMR(400MHz， DMSO-d6)： 7.7-7.8(d， J8Hz， 1H)， 7.58-7.60(d， J8Hz， 2H)， 7.36-7.42(t， 2H)， 7.29-7.36(q， 2H)， 6.24-6.26(d， J8Hz， 1H)， 5.10(s， 2H)， 4.72-4.9(m， 1H)， 4.1-4.2(m， 1H)， 3.99-4.12(m， 2H)， 3.39-3.。

28、53(m， 1H)， 3.08-3.21(t， 1H)， 2.89-3.03 (m， 1H). 0067 步骤1.10化合物11的制备 0068 室温条件下， 向反应瓶中依次加入化合物10(25g， 76 .37mmol)， 化合物SM5 (22 .20g， 84 .01mmol)， 乙酸乙酯(25mL)， T3P(72 .9g， 114 .56mmol)， 甲磺酸(10mL， 152.75mmol)， 70搅拌5h。 然后降温至0， 向反应体系中加入水(50mL)， 然后在室温继续 搅拌1h， 向反应体系加入THF和EA萃取， 有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次， 无水硫酸钠 干燥、 过滤、 。

29、浓缩、 室温真空干燥过夜得到化合物13(25.36g， 收率57.8)。 0069 1H NMR(400MHz， CDCl3)： 67.59-7.61(d， J8Hz， 2H)， 7.28-7.39(m， 3H)， 7.03-7.11 (q， 3H)， 6.98-7.01(d， J12Hz， 1H)， 6.93-6.98(q， 1H)， 6.63-6.69(q， 1H)， 6.37-6.39(d， J 8Hz， 1H)， 5.77-5.79(d， J8Hz， 1H)， 5.61-5.64(d， J12Hz， 1H)， 5.43-5.46(d， J12Hz， 1H)， 5.21-5.24(d， 。

30、J12Hz， 1H)， 4.64-4.68(d， J12Hz， 1H)， 4.43-4.45(dd， J4Hz， J 4Hz， 1H)， 3.01-4.05(d， J16Hz， 1H)， 3.85-3.88(dd， J4Hz， J12Hz， 1H)， 3.70-3.73(d， J 12Hz， 1H)， 3.24-3.39(m， 2H)， 2.82-2.92(m， 1H). 0070 步骤1.11中间体Int-1的制备 0071 室温条件下， 向反应瓶中依次加入化合物11(12g， 20.92mmol)， LiCl(4.43g， 104.6mmol)， DMA(36mL)， 80搅拌3h。 反应。

31、体系降温至0， 向反应体系中加入丙酮(12mL)， 0.5mol/LHCl(60mL)， 水(24mL)， 然后在此温度下继续搅拌1h， 抽滤， 滤饼用二氯甲烷刚好溶 解， 缓慢滴加异丙醚至体系变浑浊， 继续搅拌30min， 有大量固体析出， 过滤， 滤饼用少量异 丙醚淋洗， 抽干， 滤饼室温下真空干燥过夜得到中间体Int-1(8.87g， 收率87.73)。 0072 1H NMR(400MHz， DMSO-d6)： 7.41-7.45(m， 2H)， 6.85-7.18(m， 5H)， 5.78(s， 1H)， 5.56-5.58(d， J8Hz， 1H)， 4.42-4.45(m， 2H。

32、)， 4.07-4.11(d， J16Hz， 1H)， 3.93-3.97(d， J 16Hz， 1H)， 3.59-3.72(m， 2H)， 3.35-3.47(t， 2H)， 3.97-3.10(m， 1H). 0073 制备中间体Int-2 说明书 6/23 页 13 CN 111233891 A 13 0074 0075 合成路线如下： 0076 0077 步骤1.1中间体Int-2制备 0078 室温条件下， 向反应瓶中依次加入化合物Int-1(1.0g， 2.28mmol)， DMA(5mL)， K2CO3 (0.6g， 4.56mmol)， KI(0.4g， 2.28mmol)，。

33、 升温至50， 滴加氯甲基碳酸二甲酯(SM6)(0.48g， 3.42mmol)， 搅拌过夜。 然后降温至0， 向反应体系中加入2mol/LHCl(10mL)， 水(20mL)， 然 后在室温下搅拌1h， 抽滤， 固体溶于二氯甲烷加入硅胶拌样， 柱层析， 洗脱剂为DCM MeOH 60 1， 收集含产物的洗脱液， 旋蒸至干， 固体室温下真空干燥过夜得到Int-2(1.1g， 收率 90)。 0079 1H NMR(400MHz， DMSO-d6)： 7.43-7.45(t， 2H)， 7.22-7.28(m， 1H)， 7.14-7.21(t， 1H)， 7.09-7.14(m， 1H)， 6。

34、.99-7.06(m， 1H)， 6.84-6.91(t， 1H)， 5.73-5.79(m， 3H)， 5.66-5.72 (m， 1H)， 5.43-5.47(d， J16Hz， 1H)， 4.45-4.51(m， 1H)， 4.42-4.45(d， J12Hz， 1H)， 4.01- 4.11(m， 2H)， 3.71-3.76(m， 5H)， 3.31-3.35(m， 1H)， 2.90-3.04(m， 1H). 0080 实施例1： 化合物EXP-1的制备 0081 说明书 7/23 页 14 CN 111233891 A 14 0082 合成路线如下： 0083 0084 步骤1.。

35、1化合物EXP-1的制备 0085 室温条件下， 向反应瓶中依次加入化合物Int-1(500mg)， THF(10mL)， 开启搅拌， 加 入劳森试剂(880mg)， 室温下反应24h。 硅胶制备板纯化， 展开剂(甲醇 二氯甲烷1 20)， 产 物室温下真空干燥过夜得到产物EXP-1(311mg， 收率62.3)。 0086 1H NMR(400MHz， DMSO) 7.42-7.45(m， 2H)， 6.85-7.19(m， 5H)， 5.79(s， 1H)， 5.56- 5.58(d， J8Hz， 1H)， 5.42(m， 1H)， 4.60-4.35(m， 2H)， 4.08-4.11(。

36、m， 1H)， 3.63-3.71(m， 2H)， 3.42-3.49(m， 2H)， 3.06(m， 1H). 0087 实施例2： 化合物EXP-2的制备 0088 0089 合成路线如下： 0090 0091 步骤2.1化合物EXP-2的制备 0092 室温条件下， 向反应瓶中依次加入化合物Int-2(130mg)， THF(2mL)， 开启搅拌， 加 入劳森试剂(202mg)， 室温下反应24h。 硅胶制备板纯化， 展开剂(甲醇 二氯甲烷1 20)， 产 说明书 8/23 页 15 CN 111233891 A 15 物室温下真空干燥过夜得到目标产物EXP-2(16mg， 收率11.7。

37、)。 0093 1H NMR(400MHz， CDCl3) 7.17(m 3H)， 7.11-7.03(m， 2H)， 6.95(m， 2H)， 6.85(m， 1H)， 6.00(m， 2H)， 5.46-5.18(m， 2H)， 4.67(m， 2H)， 4.14(m， 2H)， 3.97(m， 1H)， 3.90(s， 3H)， 3.85-3.75(m， 1H)， 3.59(m， 1H)， 3.49(m， 1H)， 2.99(m， 1H). 0094 依据与上述实施例EXP-1、 EXP-2相同的方法， 使用市售化合物或参考所示的中间 化合物的制备方法而制备以下的表1实施例化合物。 00。

38、95 【表1】 0096 0097 实施例3： 化合物EXP-7的制备 说明书 9/23 页 16 CN 111233891 A 16 0098 0099 合成路线如下： 0100 0101 步骤3.1化合物12&EXP-7的制备 0102 室温搅拌条件下， 向反应瓶中依次加入中间体Int-1(100mg)， DCM(2mL)， 三乙胺 (102mg)， 然后温度冷却至0-5， 加入对甲苯磺酰氯(65mg)， 反应2h， 0-5加入正丙胺 (36mg)， 保温搅拌反应3h， 制备液相纯化， 得产物EXP-7(46mg， 收率44.2)。 0103 1H NMR(400MHz， CDCl3) 7。

39、.20-6.63(m， 6H)， 5.54(m， 2H)， 5.35(m， 2H)， 4.76(m， 1H)， 4.41(m， 1H)， 4.21-3.99(m， 1H)， 3.89(s， 1H)， 3.69(s， 1H)， 3.51(s， 1H)， 3.14(m， 4H)， 2.83(m， 1H)， 1.57(m， 3H)， 1.38-1.13(m， 2H). 0104 依据与上述实施例EXP-7相同的方法， 使用市售化合物或参考所示的中间化合物 的制备方法而制备以下的表2实施例化合物。 0105 【表2】 说明书 10/23 页 17 CN 111233891 A 17 0106 0107。

40、 0108 实施例4： 化合物EXP-12的制备 说明书 11/23 页 18 CN 111233891 A 18 0109 0110 合成路线如下： 0111 0112 步骤4.1化合物13的制备 0113 室温搅拌条件下， 向反应瓶中依次加入中间体Int-1(1.0g)， DCM(10mL)， 开启搅 拌， 加入三甲基氧鎓四氟硼酸(367mg)， 室温下反应6h。 硅胶制备板纯化， 展开剂(氯仿 甲醇 水90 18 2)， 产物室温下真空干燥过夜得到化合物13(632mg， 收率61.4)。 1H NMR (400MHz， CDCl3) 7.22-6.99(m， 5H)， 6.83(m， 。

41、2H)， 6.04(m， 1H)， 5.56(s， 1H)， 5.40-5.19(m， 3H)， 4.78(m， 1H)， 4.58(m， 1H)， 4.12(m， 1H)， 3.97-3.79(m， 2H)， 3.71(m， 1H)， 3.63-3.32(m， 2H)， 2.88(m， 1H). 0114 步骤4.2化合物EXP-12的制备 0115 向闷罐反应器中加入化合物13(100mg)， TCM(10mL)， 苄胺(215mg)， 开启搅拌， 升温 至110反应12h， 制备液相纯化， 得目标产物EXP-12(33mg， 收率28.9)。 1H NMR(400MHz， CDCl3) 。

42、7.49-7.24(m， 4H)， 7.19(d， J6.0Hz， 2H)， 7.09(dd， J20.2， 12.4Hz， 4H)， 6.90 (t， J12.6Hz， 1H)， 6.83(s， 1H)， 5.52(d， J13.2Hz， 2H)， 5.33(d， J6Hz， 2H)， 4.77(m， 1H)， 4.48(m， 3H)， 4.07(m， 1H)， 3.87(d， J9.4Hz， 1H)， 3.71(m， 1H)， 3.50(d， J8.6Hz， 2H)， 2.86(s， 1H). 0116 依据与上述实施例EXP-12相同的方法， 使用市售化合物或参考所示的中间化合物 的制备。

43、方法而制备以下的表3实施例化合物。 0117 【表3】 说明书 12/23 页 19 CN 111233891 A 19 0118 说明书 13/23 页 20 CN 111233891 A 20 0119 说明书 14/23 页 21 CN 111233891 A 21 0120 说明书 15/23 页 22 CN 111233891 A 22 0121 说明书 16/23 页 23 CN 111233891 A 23 0122 说明书 17/23 页 24 CN 111233891 A 24 0123 0124 实施例5： 化合物EXP-35的制备 说明书 18/23 页 25 CN 11。

44、1233891 A 25 0125 0126 合成路线如下： 0127 0128 步骤5.1化合物EXP-35制备 0129 室温条件下， 向反应瓶中依次加入氯甲酸氯甲酯(148mg， 1 .14mmol)， 丙二醇 (87mg， 1.14mmol)， 二异丙基乙胺(294.6mg， 2.28mmol)和二氯甲烷(10mL)， 室温搅拌1个小 时。 再加入化合物Int-1(1.0g， 2.28mmol)， DMA(5mL)， K2CO3(0.6g， 4.56mmol)， KI(0.4g， 2.28mmol)， 升温至50， 搅拌过夜。 然后降温至0， 向反应体系中加入2mol/LHCl(10m。

45、L)， 水(20mL)， 然后在室温下搅拌1h， 抽滤， 固体溶于二氯甲烷加入硅胶拌样， 柱层析， 洗脱剂为 DCM MeOH60 1， 收集含产物的洗脱液， 旋蒸至干， 固体室温下真空干燥过夜得到EXP-35 (300mg， 收率12)。 0130 MS(M+H)+： 1155.1 0131 实施例6： 细胞毒性检测和体外抗病毒活性检测 0132 6.1实验材料 0133 病毒株： 流感病毒株H1N1 PR8由本实验室扩增保存。 0134 细胞模型： 狗肾细胞系MDCK， 本实验室传代保存。 培养条件： DMEM+10胎牛血清、 37、 5CO2。 0135 6.2实验原理及方法 说明书 1。

46、9/23 页 26 CN 111233891 A 26 0136 6.2.1样品的细胞毒性检测 0137 实验采用CellTiter-GloTM(Promega)试剂盒检测样品对细胞的毒性作用。 0138 实验原理： CellTiter-Glo试剂盒通过对ATP进行定量测定来检测培养物中活细胞 数目。 有代谢活性细胞的呼吸作用和其他生命活动过程可以产生ATP， 试剂盒中使用萤光素 酶生成的稳定辉光型信号， 发光过程中萤光素酶需要ATP的参与。 向细胞培养基中加入 CellTiter-Glo试剂测量发光值， 光信号和体系中ATP量成正比， 而ATP量和活细胞数呈正相 关， 因此光信号值可以反映活。

47、细胞的数目。 0139 实验步骤： 将MDCK细胞接种于96孔细胞培养板中， 细胞贴壁后备用。 药物用DMEM培 养基从2倍最高检测浓度起连续3倍梯度稀释8个梯度。 将50 L药物及50 L培养基加入到细 胞中， 于37的CO2培养箱中培养。 加药培养24h后， 显微镜下观察药物引起的细胞病变效应 (CPE)， 加入CellTiter-Glo检测细胞存活率。 药物对细胞的毒性以细胞的活性表示。 0140 计算公式： 细胞活性()药物组数值/细胞对照组平均值*100 0141 6.2.2样品的抗病毒抑制活性检测 0142 实验原理： 实验采用测定流感病毒蛋白表达水平来检测病毒的复制水平。 流感病。

48、 毒的结构蛋白的表达水平与病毒的复制成正比； 实验采用高灵敏度的试剂检测流感病毒蛋 白的表达， 通过荧光强度的变化反应出来。 0143 方法步骤： MDCK细胞接种于96孔细胞培养板中， 37培养过夜后备用。 MDCK细胞中 同时加入50 L药物及50 L H1N1病毒液， 最终moi为0.004。 置于37细胞培养箱培养24h后， 取培养液上清进行检测。 0144 实验设空白对照孔(正常细胞)， 病毒对照孔(病毒感染后未加药物)， 阳性药物对 照孔(感染后加利巴韦林)。 0145 抑制率()100-(样品孔数值-空白对照数值)/(病毒对照数值-空白对照数 值)*100 0146 6.3检测结。

49、果 0147 【表4】 化合物对于流感病毒H1N1 PR8的抑制活性和毒性 说明书 20/23 页 27 CN 111233891 A 27 0148 0149 0150 结论： 化合物EXP-1， EXP-2， EXP-32， EXP-35具有优秀的抑制H1N1的活性， 并且具有 很低的细胞毒性。 0151 实施例7： 安氏突变实验(mini-AMES实验) 0152 对本发明化合物的诱突变性进行评价。 0153 7.1实验方法： 说明书 21/23 页 28 CN 111233891 A 28 0154 将0.1ml供试品溶液或溶剂、 0.1ml增菌液和0.5ml磷酸盐缓冲液(pH 7.4。

50、， 0.2mol/ L)或0.5ml S9混合液加入无菌试管内， 37振荡培养20分钟， 振荡频率约120rpm。 然后向试 管中加入2ml融化的顶层琼脂(顶层琼脂加入前维持在45水浴中)。 涡旋混匀管中成份后， 以0.54ml/孔铺至底层培养基表面。 待顶层琼脂凝固后， 将六孔板倒置放入培养箱中， 37 培养约48小时。 每个测试浓度在活化和非活化条件下平行各做三孔。 0155 7.2菌落计数： 显微镜下确认细菌背景菌苔生长良好， 与空白对照相比无明显稀疏 的前提下进行回变菌落计数。 0156 7.3结果统计与分析： 0157菌落计数结果取两次试验结果的均值， 以表示。 如供试品引起的回变菌。