L-氨基酸脱氨酶突变体的制备及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010185968.1 (22)申请日 2020.03.17 (71)申请人 江南大学 地址 214000 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大 道1800号 (72)发明人 吴静裴杉杉刘佳宋伟 陈修来罗秋玲 (74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211 代理人 林娟 (51)Int.Cl. C12N 9/06(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12P 7。

2、/40(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种L-氨基酸脱氨酶突变体的制备及其应 用 (57)摘要 本发明公开了一种L-氨基酸脱氨酶突变体 的制备及其应用， 属于基因工程技术领域。 本发 明的改造方法通过pmirLAAD的蛋白质改造， 通过 分析pmirLAAD产物结合位点周围柔性Loop环结 构， 并设计最佳突变体， 克服了之前野生型的酶 由于产物抑制而导致催化效率的降低， 并通过实 验验证。 最终得到最佳突变体pmirLAADM4， 催化 效率(1.61mM-1min-1)和产物抑制常数(5.4mM) 较对照分别提高了5.2倍和5.7倍。 -酮异戊酸。

3、 的产量可达到96.5g/L， 转化率97用本发明的 方法可以大大降低成本， 加快了酶转化法生产 -酮异戊酸的工业化进程。 权利要求书1页 说明书8页 序列表23页 附图1页 CN 111269900 A 2020.06.12 CN 111269900 A 1.一种L-氨基酸脱氨酶的突变体， 其特征在于， 所述突变体是在野生型L-氨基酸脱氨 酶的第98位、 第105、 第106位、 第341位的氨基酸中的一个或多个进行突变； 所述野生型L-氨 基酸脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 2.根据权利要求1所述的突变体， 其特征在于， 所述突变体为以下(a)(g)任一： (a)将氨基酸。

4、序列如SEQ ID NO.1所示的L-氨基酸脱氨酶的第98位突变为丙氨酸； (b)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-氨基酸脱氨酶的第105位突变为丙氨酸； (c)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-氨基酸脱氨酶的第106位突变为丙氨酸； (d)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-氨基酸脱氨酶的第341位突变为丙氨酸； (e)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-氨基酸脱氨酶的第98位和105位均突变为丙 氨酸； (f)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-氨基酸脱氨酶的第98位、 第105位和第106位 进行突变， 获得的突变体氨基酸序列如SEQ。

5、 ID NO.13； (g)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-氨基酸脱氨酶的第98位、 第105位、 第106位 和第341位进行突变， 获得的突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.15。 3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。 4.含有权利要求3所述基因的重组质粒。 5.表达权利要求1或2所述突变体， 或表达权利要求3所述基因， 或含有权利要求4所述 载体的宿主菌。 6.一种提高 -酮异戊酸产量的方法， 其特征在于， 将权利要求1或2所述突变体， 或权利 要求5所述的宿主菌作为催化剂， 催化L-缬氨酸得到 -酮异戊酸。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 将所述突变体。

6、或宿主菌添加至含有100 200g/LL-缬氨酸的转化体系中， 在通气量为15vvm的条件下反应2226h。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述宿主菌在转化体系中的终浓度为10 30g/L。 9.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述转化体系的反应条件为2040、 pH7.59.5。 10.权利要求12任一所述突变体， 或权利要求3所述基因， 或权利要求4所述重组质 粒， 或权利要求5所述宿主菌， 或权利要求69任一所述方法在食品、 医药、 化工领域制备 - 酮异戊酸或提高 -酮异戊酸产量中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111269900 A 2 一种L-。

7、氨基酸脱氨酶突变体的制备及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种L-氨基酸脱氨酶突变体的制备及其应用， 属于基因工程技术领 域。 背景技术 0002 L-氨基酸脱氨酶(LAAD)是一种能够催化L-氨基酸生成 -酮酸的黄素氧化酶。 研究 人员对L-氨基酸脱氨酶的空间结构、 底物特异性、 以及其对非天然底物的催化能力方面进 行过大量的研究， 近年来， 该酶在生物转化生产 -酮酸方面的应用逐渐引起研究人员的关 注。 0003 -酮酸是重要的中间体， 它主要应用于食品、 医药、 化妆品等领域， 这使得酶法转 化 -酮酸在工业生产上有着广泛的应用。 L-氨基酸脱氨酶是黄素蛋白酶， L-氨基酸的氧化 。

8、脱氨反应可以分为两个步骤： 首先将氨基酸C 上的氢转移给FAD， 氨基酸变成亚氨基酸， 亚 氨基酸不稳定分解成 -酮酸和水。 然后FADH2被氧分子氧化后， 变成了还原型FAD。 L-氨基酸 脱氨酶底物谱广泛， 催化效率高， 这为异源表达氨基酸脱氨酶转化L-缬氨酸生产 -酮异戊 酸提供了可能。 0004 然而， 目前利用L-氨基酸改造的方法一定程度上提高了 -酮异戊酸的产量和转化 率， 但是产量依然较低， 因此， 为提高 -酮异戊酸的产量和转化率， 增强其工业应用价值， 急 需提高L-氨基酸脱氨酶对L-缬氨酸的催化效率。 发明内容 0005 本发明提供了一种可以高效制备LAAD突变体及其改造方。

9、法， 并利用该突变体蛋白 催化L-缬氨酸制备 -酮异戊酸， 本发明所构建的菌株在 -酮异戊酸制备中具有高催化活 性， 极大提高了工业化生产的生产效率。 0006 本发明提供了一种L-氨基酸脱氨酶的突变体， 所述突变体以来源于奇异变形杆菌 (Proteus mirabilis)的L-氨基酸脱氨酶(pmirLAAD)为亲本， 亲本L-氨基酸脱氨酶氨基酸 序列如SEQ ID NO.1所示。 0007 在本发明的一种实施方式中， 编码所述L-氨基酸脱氨酶亲本的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 0008 在本发明的一种实施方式中， 所述突变体相对于pmirLAAD亲本， 将其第98位氨基 酸发生。

10、突变， 将丝氨酸变为丙氨酸， 获得突变体S98A。 0009 在本发明的一种实施方式中， 所述突变体相对于pmirLAAD亲本， 将其第105位氨基 酸发生突变， 将苏氨酸变为丙氨酸， 获得突变体T105A。 0010 在本发明的一种实施方式中， 所述突变体相对于pmirLAAD亲本， 将其第106位氨基 酸发生突变， 将丝氨酸突变为丙氨酸， 获得突变体S106A。 0011 在本发明的一种实施方式中， 所述突变体相对于pmirLAAD亲本， 将其第341位氨基 酸发生突变， 将亮氨酸突变为丙氨酸， 获得突变体L341A。 说明书 1/8 页 3 CN 111269900 A 3 0012 在。

11、本发明的一种实施方式中， 所述突变体相对于pmirLAAD亲本， 将第98位丝氨酸 变为丙氨酸并将第105苏氨酸变为丙氨酸， 获得突变体S98A/T105A。 0013 在本发明的一种实施方式中， 所述突变体相对于pmirLAAD亲本， 将第98位丝氨酸 变为丙氨酸、 将第105位苏氨酸变为丙氨酸并将第106位丝氨酸突变为丙氨酸， 获得突变体 S98A/T105A/S106A。 0014 在本发明的一种实施方式中， 所述突变体相对于pmirLAAD亲本， 将第98位丝氨酸 变为丙氨酸、 将第105位苏氨酸变为丙氨酸、 将第106位丝氨酸突变为丙氨酸并将第341位苏 氨酸变为丙氨酸， 获得突变体。

12、S98A/T105A/S106A/L341A。 0015 在本发明的一种实施方式中， 所述突变体S98A、 T105A、 S106A、 L341A、 S98A/T105A、 S98A/T105A/S106A、 S98A/T105A/S106A/L341A的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.5、 SEQ ID NO.7、 SEQ ID NO.9、 SEQ ID NO.11， SEQ ID NO.13， SEQ ID NO.15所示。 0016 本发明提供了一种编码所述突变体的基因， 编码所述突变体S98A、 T105A、 S106A、 L341A、 S98A/T105。

13、A、 S98A/T105A/S106A、 S98A/T105A/S106A/L341A的基因的核苷酸序列分 别如SEQ ID NO.4、 SEQ ID NO.6、 SEQ ID NO.8、 SEQ ID NO.10、 SEQ ID NO.12， SEQ ID NO.14， SEQ ID NO.16所示。 0017 本发明提供了一种获得所述pmirLAAD突变体的方法， 所述方法包括： 0018 (1)在奇异变形杆菌L-氨基酸脱氨酶pmirLAAD氨基酸序列的基础上确定突变位 点； 设计定点饱和突变和定点突变的引物， 以携带L-氨基酸脱氨酶pmirLAAD基因的载体为 模板进行定点突变； 构建含。

14、所述突变体的重组质粒； 0019 (2)将突变体质粒转化进宿主细胞； 0020 (3)挑选阳性克隆进行发酵培养、 诱导， 进而获得pmirLAAD突变体的蛋白， 用于后 续转化实验。 0021 在本发明的一种实施方式中， 所述宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。 0022 本发明提供了一种表达所述突变体、 或所述基因、 或含有所述重组载体的宿主菌。 0023 本发明提供了一种提高 -酮异戊酸产量的方法， 所述方法以L-缬氨酸为反应底 物， 将所述宿主菌加入反应液， 在pH7.59.5、 2040、 通气量为15vvm条件下反应22 26h。 0024 在本发明的一种实施方式中， 在pH。

15、8.59.5、 2535、 通气量为12vvm条件下 反应2225h。 0025 在本发明的一种实施方式中， 所述宿主菌在体系中的终浓度为1030g/L。 0026 在本发明的一种实施方式中， 所述宿主菌在体系中的终浓度为1015g/L。 0027 本发明提供了一种所述突变体， 或编码所述突变体的基因， 或所述重组质粒， 或所 述宿主菌， 或所述制备 -酮异戊酸的方法在食品、 医药、 化工领域中制备 -酮异戊酸或提高 -酮异戊酸产量中的应用。 0028 本发明的有益效果 0029 本发明构建了一种L-氨基酸脱氨酶突变体及其制备办法， 用于催化生产 -酮异戊 酸。 本发明的催化效率(1.61mM。

16、-1min-1)和产物抑制常数(5.4mM)较对照分别提高了5.2倍 和5.7倍。 提高了单位催化剂的生产能力， 有效降低了生产成本， 并且反应溶液仅以水为催 化介质， 具有反应条件温和， 操作简便， 易于分离， 对环境友好等优势， 且工艺简单， 便于控 说明书 2/8 页 4 CN 111269900 A 4 制， 易于推广应用。 本发明得到的突变体在3L发酵罐中以L-缬氨酸为底物时， -酮异戊酸的 产量可达到96.5g/L， 转化率97， 该产量是目前最高的产量， 加快了酶转化法生产 -酮异 戊酸的工业化进程。 附图说明 0030 图1为全细胞催化剂浓度和 -酮异戊酸生产量的关系。 具体实。

17、施方式 0031 基因来源： 本专利所涉及到的生物酶pmirLAAD基因来源于Proteus mirabilis， pET28a(+)质粒购自Novagen(Madison,WI,U.S.A.)， 限制性内切酶、 T4 DNA连接酶、 primeSTAR等购自TaKaRa(Dalian,China)。 标样购自SIGMA。 pmirLAAD突变体均为分子改造 所得， 其余试剂均为市场购买所得。 0032 LB培养基： 蛋白胨10g， 酵母粉5g， 氯化钠10g， 蒸馏水定容到1L。 0033 发酵培养基： (TB培养基)： 蛋白胨12g， 酵母提取物24g， 甘油4mL， 磷酸二氢钾 2.31。

18、g， 磷酸氢二钾16.42g， 蒸馏水定容到1L。 0034 HPLC法测定 -酮异戊酸含量的样品制备： 取1mL转化后的转化溶液， 在12000rpm下 离心5min， 取上清液稀释后， 经过0.45 m滤膜过滤， 过滤液供液相色谱分析。 0035 HPLC法测定 -酮异戊酸的含量： waters高效液相色谱仪(配紫外可见检测器)， 采 用伯乐Aminex HPX-87H(3007.8mm， 9 m)色谱柱， 流动相为浓度2.5mmol/L的稀硫酸， 流动 相经0.22 m滤膜过滤， 超声脱气， 流速为0.6mL/min， 柱温为35， 在紫外检测波长210nm下 检测。 0036 实施例1。

19、： 单突变体的构建和筛选 0037 (1)突变体构建： 设计第98、 第105位、 106位、 341位突变位点的引物， 如表1所示， 通 过全质粒PCR进行构建。 0038 表1突变引物序列 0039 0040 构建反应PCR扩增体系： PrimSTAR酶0.5 L、 5PrimeSTAR Buffer 10 L、 dNTP 4 L 每个突变位点的两条引物各1 L、 模板(pmirLAAD的核苷酸序列)4 L、 水32.5 L； 反应条件 为： 943min； 9810s； 5530s； 723min； 将三个步骤循环29次； 72 说明书 3/8 页 5 CN 111269900 A 5 。

20、5min； 12保温。 0041 将上述反应体系在37孵育3h以消化质粒模板(消化体系为： DpnI 0.5 L、 上述反 应PCR产物45 L、 10T Buffer 5 L)， 消化结束后得到的消化产物通过化学转化方法导入 大肠杆菌BL21感受态细胞， 化学转化法具体步骤： 0042 1)将10 l同源重组产物导入100 l BL21感受态细胞； 0043 2)冰浴15-30min； 0044 3)42水浴热激90s， 取出后迅速放入冰中静置冰浴3-5min； 0045 4)加入800 l无抗性LB培养基混匀， 于37， 200rpm培养1h； 0046 5)5000rpm离心2min收菌。

21、； 0047 6)移去上清， 剩余100-200 l吹吸混匀涂布至含0.05mg/mL卡那霉素抗性平板上， 37恒温培养12h左右。 0048 7)挑取单克隆于含0.05mg/mL卡那霉素抗性LB中， 200rpm、 37恒温培养12h后， 送 去公司测序， 测序正确的即为阳性转化子(突变体菌株)， 突变的位点分别为将第98位的S突 变为A， 将第105位的T突变为A， 将第106位的S突变为A， 将第341位的L突变为A。 0049 (2)单突突变体的摇瓶筛选： 将得到的4个突变体菌株接种至LB种子培养基， 200rpm、 37培养培养10h左右， 分别以培养基体积的5的接种量接种至摇瓶发酵。

22、培养基， 在200rpm、 37培养至OD6000.8左右， 加入终浓度为0.04mmol/L的IPTG诱导， 诱导条件为 200rpm、 25诱导14h， 6000rpm离心8min收集菌体， 离心收集的菌体用于后期转化实验。 0050 转化条件为： 转化温度25， 反应pH为8.0， 转化时间为24h。 0051 将转化结束后的转化液用HPLC方法进行测定 -酮异戊酸的产量， 结果如表2所示， 最终S98A生产得到 -酮异戊酸产量最高。 0052 表2单突变体摇瓶筛选结果 0053 0054 实施例2： 双突、 三突及四突突变体的构建和筛选 0055 (1)双突突变体构建： 在突变体Pmi。

23、rLAADS98A的基础上， 利用突变引物T105A-S和 T105A-A、 S106A-S和S106A-A、 L341A-S和L341A-A， 分别构建双突突变体； 在突变体 PmirLAADT105A的基础上， 利用突变引物S106A*-S和S106A*-A、 L341A-S和L341A-A， 分别构建 双突突变体； 在突变体PmirLAADS106A的基础上， 利用突变引物L341A-S和L341A-A(表3)； 通过 全质粒PCR进行双突突变体构建， 具体实施方式参见实施例1中步骤(1)， 制备得到6个双突 突变体PmirLAADS98A/T105A、 PmirLAADS98A/S10。

24、6A、 PmirLAADS98A/L341A、 PmirLAADT105A/S106A、 PmirLAADT105A/L341A、 PmirLAADS106A/L341A。 0056 表3双突变体突变引物序列 说明书 4/8 页 6 CN 111269900 A 6 0057 0058 (2)双突突变体的筛选： 具体实施方式参见实施例3中步骤(3)， 结果如表4所示， 最 终S98A/T105A生产得到 -酮异戊酸产量最高。 0059 表4双突变体摇瓶筛选结果 0060 0061 (3)三突突变体的构建： 在突变体PmirLAADS98A/T105A的基础上， 利用突变引物 S106A*-S和。

25、S106A*-A、 L341A-S和L341A-A， 分别构建三突突变体； 在突变体PmirLAADS98A /S106A和PmirLAADT105A/S106A的基础上， 利用突变引物L341A-S、 L341A-A， 分别构建三突突变体 (表4)， 通过全质粒PCR进行三突变体的构建， 具体实施方式参见实施例3中步骤(1)， 制备得 到四种三突突变体PmirLAADS98A/T105A/S106A、 PmirLAADS98A/T105A/L341A、 PmirLAADS98A/S106A/L341A、 PmirLAADT105A/S106A/L341A。 0062 (4)三突变体的筛选： 。

26、具体实施方式参见实施例1中步骤(2)， 结果如表5所示， 最终 S98A/T105A/S106A生产得到 -酮异戊酸产量最高。 0063 表5三突变体摇瓶筛选结果 0064 0065 (5)四突突变体构建： 在突变体PmirLAADS98A/T105A/S106A基础上对L341A进行突变： 以 说明书 5/8 页 7 CN 111269900 A 7 在突变体PmirLAADS98A/T105A/S106A为模板， 利用突变引物L341A-S和L341A-A(表3)进行全质粒 PCR， PCR产物进行消化， PCR体系与消化体系和实施例3相同。 0066 实施例3： 亲本酶及突变体的动力学参。

27、数、 产物抑制常数测定 0067 为了对突变体进行评价， 本发明测定了突变亲本PmirLAADWT及突变体PmirLAADM1、 PmirLAADM2、 PmirLAADM3、 PmirLAADM4在25下的动力学参数。 0068 kcat/Km通过在25条件下测定不同浓度的水解L-缬氨酸底物所产生 -酮异戊酸 的初始利率计算。 通过转化过程中的产物抑制常数测定实验来确定亲本酶和突变体的产物 抑制情况， 分别将PmirLAADWT亲本酶菌株和突变体菌株各以10g/L终浓度的湿细胞加入反应 液中， 以60mM的L-缬氨酸为底物， 在转化体系中加入10-100mM的 -酮异戊酸， 反应30min左。

28、 右测定初始反应率V0， 反应2h左右测定最大反应率Vmax， 并根据如下公式计算产物抑制常数 KPI： 0069 0070 V0： 初始反应速率， Vmax： 最大反应速率， Km： 米氏常数， S： 底物浓度， P： 产物浓 度， KPI： 产物抑制常数。 0071 如表6所示， 在25下， 所有的突变体与亲本酶相比， Kcat/Km值均提高， 其中突变体 PmirLAADM4的kcat/Km值提高5.2倍， 导致PmirLAAD的催化效率变大。 与之一致的是各突变体 的产物抑制常数与亲本酶相比均得到提高， 其中突变PmirLAADM4(以下简称M4菌株)的产物 抑制常数增加了5.7倍。 。

29、0072 表6 PmirLAAD亲本酶及其突变体的动力学参数 0073 0074 实施例4： 1L体系水平优化L-缬氨酸生产 -酮异戊酸 0075 将平板上测序正确的突变体M4菌株接种至含0.05mg/mL卡那霉素抗性LB中， 200rpm、 37培养10-12h， 以体积比5的接种量接种至TB培养基中， 200rpm、 37培养至 OD600为3时加入0.04mmol/L终浓度IPTG诱导， 诱导温度为25， 诱导时间14h后以6,000g 离心8min收集细胞， 放置-40冰箱用于转化。 0076 (1)不同全细胞催化剂浓度对 -酮异戊酸浓度的影响 0077 在发酵罐中配制转化反应体系： 。

30、将L-缬氨酸溶解于一定量Tris-HCl缓冲液中， 将 L-缬氨酸溶液倒入发酵罐中(使得L-缬氨酸在反应体系中的终浓度为160g/L)， 调节温度至 25， 转速为300rpm， 10g、 15g、 20g、 25g、 30g突变体湿菌体细胞(即为全细胞催化剂)同样使 用缓冲液溶解均匀， 待转化液温度升至25， 将溶解的菌液倒入发酵罐(全细胞催化剂的浓 说明书 6/8 页 8 CN 111269900 A 8 度分别为10g/L、 15g/L、 20g/L、 25g/L、 30g/L)。 0078 在25、 600rpm、 通气量为1vvm条件下进行转化反应， 转化反应后总体积为1L。 007。

31、9 转化反应结束后取部分转化液12,000g离心15min， 上清液用0.22 m的微滤膜过 滤后进行HPLC分析。 结果如图1所示， 当催化剂的浓度从10g/L提高至30g/L， -酮异戊酸的 浓度从76.7g/L提高至154.3g/L。 但是产物/催化剂的比值从7.6g/g降低至5.1g/g。 考虑到 工业对高产量以及低催化剂(菌体)用量， 10g/L的全细胞催化剂浓度同时具备较高 -酮异 戊酸浓度及高产物/催化剂比例(即单位菌体生产 -酮异戊酸能力)7.6g/g， 被用于转化实 验。 0080 (2)不同转化反应pH对 -酮异戊酸浓度的影响 0081 具体步骤同(1)， 将全细胞化剂浓度。

32、控制为10g/L， 将L-缬氨酸浓度控制为100g/L， 通气量为1vvm， 且将转化反应过程中的pH分别控制为7.5、 8.0、 8.5、 9.0、 9.5。 结果如表7所 示， 在弱酸碱性的条件下更适合 -酮异戊酸的合成， 因此选择转化pH控制在8.59.0， 此时 -酮异戊酸浓度为78.9g/L。 0082 表7转化pH优化结果 0083 0084 (3)不同转化反应温度对 -酮异戊酸浓度的影响 0085 具体步骤同(1)， 将转化pH控制为8.5， 全细胞化剂浓度控制为10g/L， 通气量为 1vvm， 将转化反应过程中的温度分别控制为20、 25、 30、 35、 40。 结果如表8。

33、所示， 在温度为30时更适合 -酮异戊酸的合成， 因此选择转化温度pH控制在30左右， 此时 - 酮异戊酸浓度为78.9g/L。 0086 表8转化温度优化结果 0087 0088 (4)不同转化反应通气量对 -酮异戊酸浓度的影响 0089 具体步骤同(1)， 将转化pH控制为8.5， 全细胞化剂浓度控制为10g/L， 温度控制为 30、 将通气量控制为1vvm、 1.5vvm、 2vvm、 2.5vvm、 3vvm。 结果如表9所示， 在通气量为 1.5vvm时更适合 -酮异戊酸的合成， 因此选择通气量控制在1.5vvm左右， 此时 -酮异戊酸 浓度为96.5g/L。 0090 表9转化通气。

34、量优化结果 0091 0092 对比例1 0093 具体实施方式参见实施例4， 不同之处在于， 将突变体M4菌株替换为野生型WT菌株 去进行发酵与转化实验。 转化结束后， 取部分转化液12,000g离心15min， 上清液用0.22 m 的微滤膜过滤后进行HPLC分析。 HPLC色谱图结果显示 -酮异戊酸产量为40g/L， 转化率为 说明书 7/8 页 9 CN 111269900 A 9 40.3。 0094 虽然本发明已以较佳实施例公开如上， 但其并非用以限定本发明， 任何熟悉此技 术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内， 都可做各种的改动与修饰， 因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所。

35、界定的为准。 说明书 8/8 页 10 CN 111269900 A 10 SEQUENCE LISTING 江南大学 一种L-氨基酸脱氨酶突变体的制备及其应用 32 PatentIn version 3.3 1 473 PRT Proteus mirabilis 1 Met Asn Ile Ser Arg Arg Lys Leu Leu Leu Gly Val Gly Ala Ala Gly 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Gly Ala Ala Leu Val Pro Met Val Arg Arg Asp Gly 20 25 30 Lys Phe Val Glu Al。

36、a Lys Ser Arg Ala Ser Phe Val Glu Gly Thr Gln 35 40 45 Gly Ala Leu Pro Lys Glu Ala Asp Val Val Ile Ile Gly Ala Gly Ile 50 55 60 Gln Gly Ile Met Thr Ala Ile Asn Leu Ala Glu Arg Gly Met Ser Val 65 70 75 80 Thr Ile Leu Glu Lys Gly Gln Ile Ala Gly Glu Gln Ser Gly Arg Ala 85 90 95 Tyr Ser Gln Ile Ile Ser。

37、 Tyr Gln Thr Ser Pro Glu Ile Phe Pro Leu 100 105 110 His His Tyr Gly Lys Ile Leu Trp Arg Gly Met Asn Glu Lys Ile Gly 115 120 125 Ala Asp Thr Ser Tyr Arg Thr Gln Gly Arg Val Glu Ala Leu Ala Asp 130 135 140 Glu Lys Ala Leu Asp Lys Ala Gln Ala Trp Ile Lys Thr Ala Lys Glu 145 150 155 160 Ala Ala Gly Phe。

38、 Asp Thr Pro Leu Asn Thr Arg Ile Ile Lys Gly Glu 165 170 175 Glu Leu Ser Asn Arg Leu Val Gly Ala Gln Thr Pro Trp Thr Val Ala 180 185 190 Ala Phe Glu Glu Asp Ser Gly Ser Val Asp Pro Glu Thr Gly Thr Pro 195 200 205 Ala Leu Ala Arg Tyr Ala Lys Gln Ile Gly Val Lys Ile Tyr Thr Asn 210 215 220 序列表 1/23 页 。

39、11 CN 111269900 A 11 Cys Ala Val Arg Gly Ile Glu Thr Ala Gly Gly Lys Ile Ser Asp Val 225 230 235 240 Val Ser Glu Lys Gly Ala Ile Lys Thr Ser Gln Val Val Leu Ala Gly 245 250 255 Gly Ile Trp Ser Arg Leu Phe Met Gly Asn Met Gly Ile Asp Ile Pro 260 265 270 Thr Leu Asn Val Tyr Leu Ser Gln Gln Arg Val Ser。

40、 Gly Val Pro Gly 275 280 285 Ala Pro Arg Gly Asn Val His Leu Pro Asn Gly Ile His Phe Arg Glu 290 295 300 Gln Ala Asp Gly Thr Tyr Ala Val Ala Pro Arg Ile Phe Thr Ser Ser 305 310 315 320 Ile Val Lys Asp Ser Phe Leu Leu Gly Pro Lys Phe Met His Leu Leu 325 330 335 Gly Gly Gly Glu Leu Pro Leu Glu Phe Ser。

41、 Ile Gly Glu Asp Leu Phe 340 345 350 Asn Ser Phe Lys Met Pro Thr Ser Trp Asn Leu Asp Glu Lys Thr Pro 355 360 365 Phe Glu Gln Phe Arg Val Ala Thr Ala Thr Gln Asn Thr Gln His Leu 370 375 380 Asp Ala Val Phe Gln Arg Met Lys Thr Glu Phe Pro Val Phe Glu Lys 385 390 395 400 Ser Glu Val Val Glu Arg Trp Gly。

42、 Ala Val Val Ser Pro Thr Phe Asp 405 410 415 Glu Leu Pro Ile Ile Ser Glu Val Lys Glu Tyr Pro Gly Leu Val Ile 420 425 430 Asn Thr Ala Thr Val Trp Gly Met Thr Glu Gly Pro Ala Ala Gly Glu 435 440 445 Val Thr Ala Asp Ile Val Met Gly Lys Lys Pro Val Ile Asp Pro Thr 450 455 460 Pro Phe Ser Leu Asp Arg Phe。

43、 Lys Lys 465 470 2 1422 DNA Proteus mirabilis 2 atgaacattt caaggagaaa gctactttta ggtgttggtg ctgcgggcgt tttagcaggt 60 ggtgcggctt tagttccaat ggttcgccgt gacggcaaat ttgtggaagc taaatcaaga 120 序列表 2/23 页 12 CN 111269900 A 12 gcatcatttg ttgaaggtac gcaaggggct cttcctaaag aagcagatgt agtgattatt 180 ggtgccggta 。

44、ttcaagggat catgaccgct attaaccttg ctgaacgtgg tatgagtgtc 240 actatcttag aaaagggtca gattgccggt gagcaatcag gccgtgcata cagccaaatt 300 attagttacc aaacatcgcc agaaatcttc ccattacacc attatgggaa aatattatgg 360 cgtggcatga atgagaaaat tggtgcggat accagttatc gtactcaagg tcgtgtagaa 420 gcgctggcag atgaaaaagc attagataa。

45、a gctcaagcgt ggatcaaaac agctaaagaa 480 gcggcaggtt ttgatacacc attaaatact cgcatcatta aaggtgaaga gctatcaaat 540 cgcttagtcg gtgctcaaac gccatggact gttgctgcat ttgaagaaga ttcaggctct 600 gttgatcctg aaacaggcac acctgcactc gctcgttatg ccaaacaaat cggtgtgaaa 660 atttatacca actgtgcagt aagaggtatt gaaactgcgg gtggtaa。

46、aat ctctgatgtg 720 gtgagtgaga aaggggcgat taaaacgtct caagttgtac tcgctggggg tatctggtcg 780 cgtttattta tgggcaatat gggtattgat atcccaacgc tcaatgtata tctatcacaa 840 caacgtgtct caggggttcc tggtgcacca cgtggtaatg tgcatttacc taatggtatt 900 catttccgcg aacaagcgga tggtacttat gccgttgcac cacgtatctt tacgagttca 960 a。

47、tagtcaaag atagcttcct gctagggcct aaatttatgc acttattagg tggcggagag 1020 ttaccgttgg aattctctat tggtgaagat ctatttaatt catttaaaat gccgacctct 1080 tggaatttag atgaaaaaac accattcgaa caattccgag ttgccacggc aacacaaaat 1140 acgcaacact tagatgctgt tttccaaaga atgaaaacag aattcccagt atttgaaaaa 1200 tcagaagttg ttgaac。

48、gttg gggtgccgtt gtgagtccaa catttgatga attacctatc 1260 atttctgagg tcaaagaata cccaggctta gtgattaaca cggcaacagt gtggggtatg 1320 acagaaggcc cggcagcggg tgaagtgacc gctgatattg tcatgggcaa gaaacctgtt 1380 attgatccaa cgccgtttag tttggatcgt tttaagaagt aa 1422 3 473 PRT 人工序列 3 Met Asn Ile Ser Arg Arg Lys Leu Leu。

49、 Leu Gly Val Gly Ala Ala Gly 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Gly Ala Ala Leu Val Pro Met Val Arg Arg Asp Gly 20 25 30 Lys Phe Val Glu Ala Lys Ser Arg Ala Ser Phe Val Glu Gly Thr Gln 35 40 45 Gly Ala Leu Pro Lys Glu Ala Asp Val Val Ile Ile Gly Ala Gly Ile 50 55 60 Gln Gly Ile Met Thr Ala Ile Asn Leu Ala Gl。

50、u Arg Gly Met Ser Val 65 70 75 80 Thr Ile Leu Glu Lys Gly Gln Ile Ala Gly Glu Gln Ser Gly Arg Ala 85 90 95 序列表 3/23 页 13 CN 111269900 A 13 Tyr Ala Gln Ile Ile Ser Tyr Gln Thr Ser Pro Glu Ile Phe Pro Leu 100 105 110 His His Tyr Gly Lys Ile Leu Trp Arg Gly Met Asn Glu Lys Ile Gly 115 120 125 Ala Asp T。