用于检测新型冠状病毒（2019-nCoV）的CRISPR核酸检测试剂盒.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010160702.1 (22)申请日 2020.03.10 (71)申请人 中国人民解放军军事科学院军事医 学研究院 地址 100071 北京市丰台区东大街20号院 (72)发明人 李浩寇志华孙岩松周育森 董雪王彦贺何雷赵忠鹏 孙世慧谷宏婧 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 白艳 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6804(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12R。

2、 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测新型冠状病毒 （2019-nCoV） 的 CRISPR核酸检测试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测新型冠状病毒 (2019-nCoV)的CRISPR核酸检测试剂盒。 本发明 提供一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒， 包括 用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统和 与其配套使用的侧向流试纸； a1)单独包装的 crRNA和LwCas13a蛋白； a2)报告RNA， 其由20个U 组成； a3)用于扩增待测样本靶点序列的RT-RAA 扩增引物， 且所述RT-RAA扩增引物中的一条引物 的5末端具有被T7RNA聚合酶识。

3、别的区域； 本发 明的CRISPR核酸检测试纸可通过CRISPR-Cas13a 系统实现对新型冠状病毒核酸的高灵敏、 高特 异、 便捷检测， 灵敏度达到10copies/test。 权利要求书2页 说明书11页 序列表6页 附图3页 CN 111270012 A 2020.06.12 CN 111270012 A 1.一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒， 包括用于检测新型冠状病毒的CRISPR- Cas13a系统和与其配套使用的侧向流试纸； 所述用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统包括如下a1)-a3)； a1)单独包装的crRNA和LwCas13a蛋白， 或crRNA和LwCa。

4、s13a蛋白复合体； 所述crRNA的靶点序列为序列1； a2)报告RNA， 其由20个U组成， 且所述报告RNA的序列两端分别标记FAM和生物素； a3)用于扩增待测样本靶点序列的RT-RAA扩增引物， 且所述RT-RAA扩增引物中的一条 引物的5末端具有被T7 RNA聚合酶识别的区域； 所述侧向流试纸依次包括样品板、 与纳米金抗FITC抗体、 链亲和素线、 抗体捕获线和吸 收板； 所述抗体捕获线包被的抗体为羊抗兔IgG。 2.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于： 所述crRNA的核苷酸序列为序列2。 3.根据权利要求1或2所述的试剂盒， 其特征在于： 所述RT-RAA扩增引物由序列4。

5、所示的 单链DNA分子和序列5所示的单链DNA分子组成。 4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒， 其特征在于： 所述CRISPR-Cas13a系统还包 括a4)RNA聚合酶。 5.根据权利要求1-4中任一所述的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒还包括记载如下检测方法的可读载体： 所述检测方法包括如下步骤: b1、 提取待测样本的核酸， 所述RT-RAA扩增所需引物对待测样品核酸进行RT-RAA扩增， 得到RT-RAA扩增产物； b2、 将所述RT-RAA扩增产物、 所述crRNA、 所述LwCas13a蛋白在含有所述报告RNA的体系 中反应， 得到反应产物； b3、 将所述反应产物加入所述。

6、试纸条的样品板的加样孔中， 静置观察； 若试纸没有T线显现且有C线显现， 则待测样本含有或候选含有新型冠状病毒； 若试纸 有T线显现且有C线显现， 则待测样本不含有或候选不含有新型冠状病毒。 6.权利要求1-5中任一所述试剂盒中的用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统。 7.权利要求1-5中任一所述试剂盒或权利要求6中的CRISPR-Cas13a系统或所述系统中 的单独包装的crRNA和LwCas13a蛋白， 或crRNA和LwCas13a蛋白复合体在如下c1-c10任一中 的应用： c1)检测或辅助检测新型冠状病毒； c2)制备检测或辅助检测新型冠状病毒产品； c3)检测或辅助。

7、检测新型冠状病毒核酸； c4)制备检测或辅助检测新型冠状病毒核酸产品； c5)检测或辅助检测待测样本中是否含有新型冠状病毒； c6)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有新型冠状病毒产品； c7)检测或辅助检测待测样本中是否含有新型冠状病毒核酸； c8)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有新型冠状病毒核酸产品； c9)筛选或辅助筛选新型冠状病毒防治药物； 权利要求书 1/2 页 2 CN 111270012 A 2 c10)制备筛选或辅助筛选新型冠状病毒防治药物产品。 8.一种检测或辅助检测新型冠状病毒核酸的方法， 包括如下步骤： b1、 提取待测样本的核酸， 所述RT-RAA扩增所需引物对待测。

8、样品核酸进行RT-RAA扩增， 得到RT-RAA扩增产物； b2、 将所述RT-RAA扩增产物、 所述crRNA、 所述LwCas13a蛋白在含有所述报告RNA的体系 中反应， 得到反应产物； b3、 将所述反应产物加入所述试纸条的样品板的加样孔中， 静置观察； 若试纸没有T线显现且有C线显现， 则待测样本含有或候选含有新型冠状病毒； 若试纸 有T线显现且有C线显现， 则待测样本不含有或候选不含有新型冠状病毒。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111270012 A 3 一种用于检测新型冠状病毒(2019-nCoV)的CRISPR核酸检测 试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及一种用于检测新。

9、型冠状病毒(2019-nCoV)的CRISPR核酸检测试剂盒， 属于分子诊断技术领域。 背景技术 0002 新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019， COVID-19)是由新型冠状病毒 (2019-nCoV)引起、 导致人类发生急性感染的乙类传染病， 具有传染性强、 临床救治 能力薄 弱、 无批准上市的特效药物及无疫苗预防的特点。 新型冠状病毒的检测技术包 括病毒基因 测序、 IgM和IgG抗体的检测、 荧光定量PCR、 恒温扩增芯片核酸检测技 术等。 然而现有检测 技术均存在一定的不足， 胶体金法简单便携， 但灵敏度不足； 包 括LAMP、 RPA在内的恒温扩 。

10、增法灵敏度很高， 但在操作过程中易污染； 荧光定量PCR法 和病毒基因测序稳定、 可靠、 具 有一定的灵敏度， 但样本处理复杂， 且对仪器要求高。 0003 2017年4月， 美国研究人员建立了一种灵敏度达到埃摩级(单拷贝)， 特异性达 到 单碱基的核酸检测技术基于CRISPR-Cas13a的核酸检测平台SHERLOCK(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)， 利用Leptotrichia wadei Cas13a蛋白 (LwCas13a)的非特异剪切活性， 结合可以高效扩增目的片段的重组聚合酶扩增技术 (Recombi。

11、nase Polymerase Amplification， RPA)， 实现了对痕量核酸快速、 廉价、 高 灵敏 的检测。 2018年4月， 美国研究人员将以上技术运用到社区现场检测中， 发明了 一种侧向流 试纸， 通过显线法显示目的核酸的存在， 使此技术更加便捷。 发明内容 0004 本发明一个目的是提供一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒。 0005 本发明提供的试剂盒， 包括用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统和与其 配 套使用的侧向流试纸； 0006 所述用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统包括如下a1)-a3)； 0007 a1)单独包装的crRNA和L。

12、wCas13a蛋白(氨基酸序列为序列6)， 或crRNA和LwCas13a 蛋白复合体； 0008 所述crRNA的靶点序列为序列1； 0009 a2)报告RNA， 其由20个U组成， 且所述报告RNA的序列两端分别标记FAM和生物素； 0010 a3)用于扩增待测样本靶点序列的RT-RAA扩增引物， 且所述RT-RAA扩增引物中的 一条引物的5末端具有被T7 RNA聚合酶识别的区域； 0011 所述侧向流试纸依次包括样品板(含有加样孔)、 与纳米金抗FITC抗体、 链亲和素 线、 抗体捕获线和吸收板； 0012 所述抗体捕获线包被的抗体为羊抗兔IgG。 0013 更进一步的， 所述CRISP。

13、R-Cas13a系统还包括用于特异性扩增新型冠状病毒靶点 说明书 1/11 页 4 CN 111270012 A 4 序列的其他试剂， 所述用于特异性扩增新型冠状病毒靶点序列的其他试剂包括如下试 剂 中的全部或部分： NTP(如NTP Mix)、 T7 RNA聚合酶、 RNA酶抑制剂、 MgCl2溶液、 HEPES缓冲 液、 RNase free water， 具体见实施例中的表7中组分。 0014 上述试剂盒中， 所述crRNA的核苷酸序列为序列2。 0015 上述试剂盒中， 所述RT-RAA扩增引物由序列4所示的单链DNA分子和序列5所示的 单 链DNA分子组成。 0016 上述试剂盒中，。

14、 所述CRISPR-Cas13a系统还包括a4)RNA聚合酶。 0017 上述试剂盒中， 所述试剂盒还包括记载如下检测方法的可读载体： 0018 所述检测方法包括如下步骤: 0019 b1、 提取待测样本的核酸， 所述RT-RAA扩增所需引物对待测样品核酸进行RT-RAA 扩增， 得到RT-RAA扩增产物； 0020 上述RT-RAA扩增的反应条件为： 37-42反应15-40分钟； 0021 b2、 将所述RT-RAA扩增产物、 所述crRNA、 所述LwCas13a蛋白在含有所述报告 RNA 的体系中反应， 得到反应产物； 0022 上述反应的条件为： 37， 15-30分钟。 0023 。

15、b3、 将所述反应产物加入所述试纸条的样品板的加样孔中， 静置观察； 0024 静置时间为液体滴在试纸上2-5分钟； 0025 若试纸没有T线显现且有C线显现， 则待测样本含有或候选含有新型冠状病毒； 若 试纸有T线显现且有C线显现， 则待测样本不含有或候选不含有新型冠状病毒。 0026 上述试剂盒中的用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统也是本发明保护的 范围。 0027 上述试剂盒或上述CRISPR-Cas13a系统或上述系统中的单独包装的crRNA和 LwCas13a蛋白， 或crRNA和LwCas13a蛋白复合体在如下c1-c10任一中的应用也是本 发明保 护的范围： 0。

16、028 c1)检测或辅助检测新型冠状病毒； 0029 c2)制备检测或辅助检测新型冠状病毒产品； 0030 c3)检测或辅助检测新型冠状病毒核酸； 0031 c4)制备检测或辅助检测新型冠状病毒核酸产品； 0032 c5)检测或辅助检测待测样本中是否含有新型冠状病毒； 0033 c6)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有新型冠状病毒产品； 0034 c7)检测或辅助检测待测样本中是否含有新型冠状病毒核酸； 0035 c8)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有新型冠状病毒核酸产品； 0036 c9)筛选或辅助筛选新型冠状病毒防治药物； 0037 c10)制备筛选或辅助筛选新型冠状病毒防治药物产品。

17、。 0038 本发明另一个目的是提供一种检测或辅助检测新型冠状病毒核酸的方法。 0039 本发明提供的方法， 包括如下步骤： 0040 b1、 提取待测样本的核酸， 所述RT-RAA扩增所需引物对待测样品核酸进行RT-RAA 扩增， 得到RT-RAA扩增产物； 0041 b2、 将所述RT-RAA扩增产物、 所述crRNA、 所述LwCas13a蛋白在含有所述报告 RNA 说明书 2/11 页 5 CN 111270012 A 5 的体系中反应， 得到反应产物； 0042 b3、 将所述反应产物加入所述试纸条的样品板的加样孔中， 静置观察； 0043 若试纸没有T线显现且有C线显现， 则待测样。

18、本含有或候选含有新型冠状病毒； 若 试纸有T线显现且有C线显现， 则待测样本不含有或候选不含有新型冠状病毒。 0044 上述待测样本可为咽拭子、 痰液、 肺泡灌洗液， 也可为血液样本、 器官(如肝、 脾、 肾等)组织样本、 细胞等。 0045 本发明所提供的检测或辅助检测新型冠状病毒的方法既可为非疾病诊断治疗方 法， 也可为疾病诊断治疗方法。 其中， 所述非疾病诊断治疗方法可如在细胞水平筛选 新型 冠状病毒防治药物时检测用药前后细胞内是否含有新型冠状病毒。 0046 本发明基于CRISPR-Cas13a核酸检测技术， 通过设计、 构建、 筛选， 最终提供一 段 用于新型冠状病毒检测的靶点序列及。

19、能靶向该靶点序列的特异性crRNA， 并提供一 种基于 消线法的侧向流试纸， 该试纸可通过CRISPR-Cas13a系统实现对新型冠状病毒 核酸的高灵 敏、 高特异、 便捷检测， 灵敏度达到10copies/test。 附图说明 0047 图1为基于消线法侧向流试纸原理模式图。 0048 图2为RT-RAA扩增引物组合F1-R1扩增效率最高。 0049 图3为报告RNA(20U)对RNA酶最敏感。 0050 图4为CRISPR核酸检测试纸检测新型冠状病毒的灵敏度可达到10copies/test。 0051 图5为针对新型冠状病毒的CRISPR核酸检测试纸在检测其他病原时未出现交叉反 应。 具体。

20、实施方式 0052 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0053 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0054 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。 0055 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平均值。 0056 下述实施例中涉及的试剂及其来源如下： SOC液体培养基(索莱宝， L1020-1L)、 NTP mix(NEB， N0466S)， EDTA(赛默飞， 15576028)、 1M Tris pH 8.0(ENZO， JBS-CSS-353)， 琼脂糖凝胶电泳DNA纯化回收试剂盒(天根生。

21、化， DP219-03)， T7转录试剂盒(T7 Quick High Yield RNA Synthesis kit， NEB， E2050S)， RNA酶抑制剂(Murine RNase inhibitor， NEB， M0314L)， T7 RNA聚合酶(NEB， M0251S)， RNA纯化磁珠(Agencourt RNAClean XP， Beckman Coulter， A63987)， ExTaq Mix(TaKaRa， RR001Q)， 二硫苏糖醇(DTT， 麦克林， D806827-5g)， 氨苄西林钠(索莱宝， A6920-5g)， 酵母提取物(索莱宝， Y8020-500。

22、g*30)， 胰蛋白胨(OXOID， LP0042-500g)， Tris平衡酚(灏样生物， TBD0001HY)， RT-RAA扩增试剂盒(杭州众测， S003ZC) ， BCA蛋白浓度测定试剂盒 (上 海碧云天 ， P0012S) ， 报告RNA试剂盒 (RNaseAlertTMQC System v2， 赛默飞， 4479769)， 纳米金标兔抗FITC抗体(上海生工， D110003)， 链亲和素(索莱宝， S9170-10mg)， 羊抗兔IgG(赛默飞， N24916)， RNase A(赛默 飞， PA126787)， HEPES缓冲液(索莱 宝， YZ-B-HEPES250)， 。

23、MgCl2溶液(天根生化， RP107)。 说明书 3/11 页 6 CN 111270012 A 6 0057 下述实施例中的核苷酸序列如下： 0058 序列1为crRNA的靶点序列； 0059 序列2为crRNA序列； 0060 序列3为新型冠状病毒N基因的核苷酸序列； 0061 序列4为nCoVnp-F1引物序列； 0062 序列5为nCoVnp-R1引物序列； 0063 序列6为LwCas13a蛋白氨基酸序列。 0064 实施例1、 基于CRISPR-Cas13a系统的新型冠状病毒核酸检测试剂盒及检测方法 一、 基于CRISPR-Cas13a系统的新型冠状病毒核酸检测试剂盒 0065 。

24、(一)mRNA标准品的制备 0066 新型冠状病毒N基因为序列3， 其中序列3第992-1019位为COVID-19crRNA的靶 点 序列。 0067 mRNA由上述质粒的PCR扩增产物转录而成， 以模拟病毒核酸， 具体方法步骤如下： 0068 (1)PCR扩增 0069 以人工合成的序列3所示的DNA分子为模板， 用如下表1所示的体系进行PCR扩 增， 得到PCR产物。 0070 配制PCR反应体系如表1。 0071 表1、 PCR扩增体系 0072 名称 体积 序列3所示的DNA分子 2 L nCoVnp-F1 2 L nCoVnp-R1 2 L ExTaq Mix 25 L ddH2O。

25、 19 L 总体积 50 L 0073 PCR反应条件： 955min热变性； 9530s， 5530s， 7215s， 共38个循 环； 72自 动延伸10min； 4保存PCR产物。 0074 (2)PCR产物的纯化 0075 使用Tris平衡酚对步骤(1)获得的PCR产物进行纯化， 具体步骤如下： Tris平 衡酚 取500 L， 加入等体积的三氯甲烷， 振荡混匀后短暂离心， 弃上清； 取150 L 酚氯仿混合液加 入PCR产物中， 混匀后12,000rpm离心1min； 取上清液到一个新的 1.5mL离心管， 加入无水乙 醇使上清与乙醇比例为3:7， 12,000rpm离心10min，。

26、 弃 上清； 加入200 L 75的乙醇， 12, 000rpm离心10min， 弃上清(该步骤共进行三次)。 得到的沉淀室温晾干(约10min)， 加入50 L无RNA酶的水， 得到纯化PCR产物； Nanodrop(赛默飞ND-1000)检测浓度为510.5ng/ L， -20 保存。 0076 (3)转录 0077 取2 L步骤(2)获得的纯化PCR产物， 使用T7转录试剂盒转录mRNA。 mRNA转 录体系 如表2所示。 0078 表2、 mRNA转录体系 说明书 4/11 页 7 CN 111270012 A 7 0079 名称 体积 NTP Mix 10 L PCR产物 2 L T。

27、7 RNA聚合酶 2 L 无Nuclease水 6 L 总体积 20 L 0080 上述mRNA转录体系混匀后， 37转录过夜， 使用DNase 去除多余的DNA： 上一 步得 到的转录产物加入20 L无RNase的水， 加入2 L DNase ， 混匀， 37孵育 15min。 0081 (4)mRNA的纯化 0082 按照Agencourt RNA Clean XP说明书(Beckman Coulter)纯化步骤(3)转录 获得 的mRNA， 具体步骤如下： 磁珠振荡混匀， 向转录产物中加入1.8倍体积的磁珠， 吹打10次或 涡旋30s以混匀磁珠和转录体系， 室温静置5min。 将反应体系。

28、放到磁力 架， 静置5-10min以 分离磁珠。 轻轻吸出体系中的液体， 避免磁珠被吸出， 向磁珠中 加入200 L 70的乙醇(无 RNase水配制)， 室温孵育30s， 吸出乙醇； 重复此过程清 洗磁珠， 共3次。 室温晾干体系， 去除 体系中的乙醇， 约10min。 加入50 L RNase-free 水， 涡旋30s或用移液器吹打10次， 吸出上 清液， 放入无RNase的1.5mL离心管中， Nanodrop测定纯化得到的mRNA浓度为1999.7ng/ L， -80分装备用。 0083 (二)RT-RAA扩增所需引物及其扩增产物的制备 0084 根据国家基因组科学数据中心(NGDC。

29、)中公布的2019-nCoV病毒核酸序列 (https:/ dbId2019nCoVR&q2019-nCoV&page1)， 根据序列 比对 分析结果在相对保守的N基因选择设计相应的引物。 0085 1、 RT-RAA扩增引物的设计 0086 根据参考文献(PMID:27246147)中的RPA引物设计旨在用于CRISPR检测的新型 冠 状病毒特异性RT-RAA引物， 在所述引物的5 端具有一段T7转录序列， 使得 RT-RAA扩增得到 的双链DNA(dsDNA)可以被T7 RNA聚合酶识别并且进行转录。 引物 序列如表3所示， 由北京 天一辉远生物科技有限公司合成。 0087 表3、 201。

30、9nCoV-RT-RAA扩增引物 说明书 5/11 页 8 CN 111270012 A 8 0088 0089 2、 RT-RAA扩增产物的获得 0090 以mRNA标准品作为模板， 采用nCoVnp-F1和nCoVnp-R1为引物， 利用RT-RAA扩 增试 剂盒进行RT-RAA扩增， 得到RT-RAA扩增产物。 0091 上述RT-RAA扩增体系如表4所示。 0092 表4、 RT-RAA扩增体系 0093 名称 体积 模板 2 L nCoVnp-F(10 M) 2 L nCoVnp-R(10 M) 2 L A Buffer(试剂盒内组分) 41.5 L 总体积 47.5 L 0094 。

31、具体扩增操作步骤如下： 将混合好的表3所示的47.5 L溶液加入到装有冻干粉的 基础反应单元中， 使冻干粉充分重溶均匀。 向每个反应管管盖上加入2.5 L B Buffer 溶液 (试剂盒内组分)， 合上管盖， 上下颠倒5-6次混匀， 快速离心10秒钟。 将上述 反应管放置在 42条件下反应30分钟， 得到RT-RAA扩增产物。 0095 (三)crRNA的制备 0096 根据国家基因组科学数据中心(NGDC)中公布的2019-nCoV病毒核酸序列 (https:/ dbId2019nCoVR&q2019-nCoV&page1)， 根据序列 比 对分析结果在相对保守的N基因设计相应的crRNA。

32、， crRNA制备所需引物为如下表5 所 示， 0097 表5、 制备crRNA所需模板与引物序列 说明书 6/11 页 9 CN 111270012 A 9 0098 0099 crRNA的制备方法如下： 0100 将表5所示的引物序列用ddH2O稀释成10 M， 根据表6配制PCR反应体系。 PCR反应 条件如下： 955min热变性； 9530s， 5530s， 7215s， 共38个循环； 72自 动延伸 10min； 4保存， 得到PCR产物。 0101 表6.制备crRNA的PCR反应体系 0102 0103 0104 PCR产物的纯化、 转录以及crRNA的纯化同上述(一)中mR。

33、NA制备的方法， 最终得 到 浓度为3060.3ng/ L crRNA。 获得的crRNA序列具体如下： 0105 GGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACuccaauuugauggcaccuguguagguca(序 列2)， 其中， 序列2第1-38位为用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列； 序列2第39-66位为靶向 新 型冠状病毒靶点序列的向导序列。 0106 crRNA靶点序列如下： tgacctacacaggtgccatcaaattgga(序列1)， 位于新型冠状 病 毒基因组(GenBank ID： MN908947.3)第29265-29292。

34、位(序列3第992-1019位)。 0107 制备出的crRNA， 用于后续CRISPR-Cas13a检测。 0108 (四)LwCas13a蛋白 0109 LwCas13a蛋白氨基酸序列为序列6。 0110 LwCas13a蛋白的表达、 纯化及活性鉴定参见发明名称为 “一种有效以Cas13a为 基 础的抗登革病毒的核酸靶点及其应用” ， 公布号为CN108715849A的专利文件中的 方法。 具 体步骤如下： 0111 1、 LwCas13a蛋白诱导表达、 纯化及鉴定 0112 LwCas13a表达质粒Addgene-PC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a自Addge。

35、ne平台 获取， 将LwCas13a表达质粒转入Rosetta(DE3)感受态细胞中， TB液体培养基37、 200rpm 培养14h以上， 1:100接入新的Amp+抗性TB培养基中， 37、 300rpm培养至 OD6000.6左右， 加入IPTG使终浓度为500uM， 18、 200rpm培养16h。 离心收集菌 体经超声破碎后收集蛋白 说明书 7/11 页 10 CN 111270012 A 10 上清， 并利用LwCas13a蛋白所带的His标签通过Ni柱 (HisTrap HP column， GE Healthcare Life Science)进行初步纯化， 利用SUMO将 所。

36、带标签部分进行酶切， 再利用LwCas13a蛋白 的等电点特性通过阳离子交换柱 (UniGel-50SP， Nano-Micro Tech)进行第二次纯化， 实验 过程中利用SDS-PAGE蛋白 电泳鉴定每一步得到的蛋白， 进行蛋白大小分析， 同时利用His 标签抗体进行蛋白的 初步鉴定， 以确定诱导的蛋白为目的蛋白。 0113 2、 LwCas13a蛋白浓度及活性鉴定 0114 使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测LwCas13a蛋白浓度， 利用报告RNA试剂盒 (RNaseAlertTMQC System v2)， 检测490nm激发、 520nm波长下的发射光的荧光值， 判断体系 中的Cas。

37、13a蛋白是否被激活。 即在靶点RNA、 与靶点对应的crRNA的存在下， Cas13a蛋白是 否能被激活并剪切体系中的报告RNA， 使其发出荧光， 同时设置非特异 性靶点进行特异性 检测， 以及人细胞总RNA作为背景RNA， 检测体系是否会受到背景 RNA的干扰。 检测结果发 现， 本发明纯化得到纯度较高的LwCas13a蛋白， 并且无RNase 的污染， 该蛋白与crRNA结合 形成的复合体， 可被特异的靶序列激活， 并剪切体系中 的报告RNA， 从而发出荧光信号， 该 蛋白可用于后续的检测实验。 0115 在蛋白终浓度为45nM时即可检测到明显的荧光信号变化， 即LwCas13a蛋白的工。

38、 作浓度为45nM(与表7中一致)。 0116 (五)报告RNA 0117 报告RNA为序列两端标记FAM和生物素的20U(天一辉远生物科技有限公司合成)。 0118 (六)基于消线法的侧向流试纸的制备 0119 基于消线法的侧向流试纸(如图1所示)按流动方向排序依次包括样品板、 纳米金 标兔抗FITC抗体(包被浓度为0.01mg/ml)、 链亲和素线、 抗体捕获线、 吸收板五个部 分， 由 硝酸纤维素膜、 金垫、 吸水纸、 玻璃纤维、 胶板、 塑料卡壳组成。 链亲和素线 (T线)包被浓度 为1.5mg/ml， 抗体捕获线(C线)包被羊抗兔IgG(二抗)浓度为1mg/ml。 0120 (七)基。

39、于CRISPR-Cas13a系统的新型冠状病毒核酸试剂盒的制备 0121 本发明提供的基于CRISPR-Cas13a系统的新型冠状病毒核酸试剂盒包括用于检测 新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统及上述(一)中六制备的基于消线法的侧向流试纸； 0122 上述用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统包括单独包装的上述二制备的 RT-RAA扩增所需引物、 上述三制备的crRNA、 上述四制备的LwCas13a蛋白和上述五制备 的 报告RNA， 还包括CRISPR-Cas13a反应的如下试剂中的全部或部分： NTP(如NTP Mix)、 T7 RNA聚合酶、 RNA酶抑制剂、 Mg。

40、Cl2溶液、 HEPES缓冲液、 RNase free water。 0123 二、 基于CRISPR-Cas13a系统的新型冠状病毒核酸的检测方法的确定 0124 本发明检测原理如下： 0125 先用RT-RAA扩增所需引物对待测样本进行扩增， 得到RT-RAA扩增产物； 再将RT- RAA 扩增产物、 crRNA、 LwCas13a蛋白在含有报告RNA的CRISPR-Cas13a检测体系中反应， 得 到反应产物； 再将反应产物点在侧向流试纸的加样孔中， 反应产物流经纳米金标兔抗 FITC 抗体时， 体系中的报告RNA的FAM端会标记上用于显现的纳米金； 流经链亲和素线 时， 若待 测样本中。

41、含有新型冠状病毒靶点， 则crRNA、 LwCas13a蛋白和RT-RAA扩增产物 形成复合体， 且激活LwCas13a蛋白活性， 使其切割体系中的RNA(包括报告RNA)， 报告 RNA被剪切时， 其 FAM端不受生物素端的影响， 不显示第一条线( “T” 线)； 若待测样本 中不含有新型冠状病毒 说明书 8/11 页 11 CN 111270012 A 11 靶点， 则crRNA、 LwCas13a蛋白形成复合体， 不激活LwCas13a 蛋白活性， 无法切割报告RNA， 报告RNA未被剪切时， FAM端随生物素端同时被拦截在链 亲和素线(生物素和链亲和素结 合)， 其上标记的纳米金显现于。

42、第一条线( “T” 线)； 流经抗体(抗FITC抗体)捕获线时， 无论 报告RNA是否被剪切， 报告RNA的FAM端均有机 会到达抗体捕获线， 纳米金标兔抗FITC抗体 与羊抗兔IgG抗体结合， 即其上标记的纳米 金应该显现于第二条线( “C” 线)。 (图1) 0126 具体方法如下： 0127 1、 RT-RAA扩增 0128 提取待测样本的核酸， 用上述一的(七)制备的试剂盒中的RT-RAA扩增所需引物 nCoVnp-F1和nCoVnp-R1对待测样品核酸进行RT-RAA扩增， 得到RT-RAA扩增产物； 0129 2、 CRISPR-Cas13a系统检测体系的配制及反应 0130 将R。

43、T-RAA扩增产物、 上述(一)的七制备的试剂盒中的crRNA(序列2)、 上述(一) 的 七制备的试剂盒中的LwCas13a蛋白(序列6)和上述(一)的七制备的试剂盒中的 报告RNA (20U)按照如下表7所示的体系配制： 0131 表7、 CRISPR-Cas13a系统检测体系 0132 名称 用量 RT-RAA产物 5 L LwCas13a蛋白(浓度45nM) 2 L NTP Mix 4 L T7 RNA聚合酶 1 L RNA酶抑制剂(Murine RNase inhibitor) 2 L MgCl2溶液 10mM HEPES缓冲液 20mM crRNA 22.5nM 报告RNA 2nM。

44、 RNase free water Up to 50 L 总体积 50 L 0133 将表7中的RT-RAA产物替换为ddH2O， 且保持其他试剂组分不变， 即为阴性对照。 0134 将表7配制的反应体系的反应管盖上管盖， 上下颠倒5-6次混匀， 低速离心10 秒 钟， 将上述反应管放置在37条件下反应30分钟， 得到反应产物。 0135 3、 试纸条检测 0136 将上述2得到的反应产物全部加入上述(一)的七制备的试剂盒中的试纸条的样 品板的加样孔中， 静置2-5分钟肉眼观察。 0137 结果判定： 0138 若试纸没有 “T” 线显现且有 “C” 线显现， 则待测样本含有或候选含有新型冠状。

45、 病 毒； 若试纸有 “T” 线显现且有 “C” 线显现， 则待测样本不含有或候选不含有新型 冠状病毒； 若试纸没有 “C” 线显现， 则试纸失效， 需更换试纸重新实验。 0139 实施例2、 基于CRISPR-Cas13a系统的检测方法的条件优化和摸索 0140 一、 最优RT-RAA扩增引物的筛选 0141 以实施例1中的一(一)中制备的mRNA标准品为模板， 用实施例1的(二)的1 的方法 说明书 9/11 页 12 CN 111270012 A 12 进行RT-RAA扩增， 引物分别为表3所示的各引物组合(组合形式如图2所示)， 得到RT-RAA扩 增产物。 0142 设置水为模板的扩。

46、增产物作为阴性对照。 0143 取20 L扩增产物， 加入20 L的三氯甲烷： Tris平衡酚1： 1与反应后产物等量 混 匀， 振荡后离心10min， 弃去上清的混合液中， 振荡混匀， 10000rpm离心10min， 吸取上清10 L， 加入3 L 6*Loading Buffer， 混匀后琼脂糖凝胶电泳。 0144 检测如图2所示， 结果显示， 反向引物R1在与正向引物F1、 F2、 F3组合时扩增 效率 较高， 而与其他正向引物组合时扩增效率欠佳； 同时， 正向引物F1在与反向引物 R1、 R4组合 时扩增效率较高， 而与其他反向引物组合时扩增效率欠佳， 考虑到F1与 R4扩增产物片段。

47、较 长， 不利于扩增效率的提高。 0145 于是F1和R1组合作为最佳扩增引物用于针对2019-nCoV病毒的RT-RAA扩增。 0146 二、 最优报告RNA筛选 0147 为筛选出最适配CRISPR侧向流试纸检测的报告RNA， 通过RNA修饰的方法合成了 3 种含有不同碱基种类和个数报告RNA， 报告RNA具体序列见表8， 且两端分别标记FAM 和生物 素。 0148 表8、 报告RNA序列 0149 名称 序列 碱基数 5U UUUUU 5 6A AAAAAA 6 20U UUUUUUUUUUUUUUUUUUUU 20 0150 分别向3种报告RNA(2nM， 48 L)中加入RNA酶(。

48、RNase A， 赛默飞， PA126787) 2 L， 总 反应的体积为50 L， 37孵育10分钟， 得到反应产物。 0151 将上述反应产物滴加入实施例1的二(六)的试纸条检测中的试纸加样孔中， 静 置 2-5分钟肉眼观察。 0152 结果如图3所示， 5U和6A的报告RNA被RNaseA剪切前后CRISPR检测试纸上的 “T” 线 差异较弱， 而20U的报告RNA被RNaseA剪切前后CRISPR检测试纸上的 “T” 线差异较强。 0153 因此选择20U的报告RNA作为后续检测体系中的报告RNA。 0154 从上述结果可以看出， 实施例1的(二)的方法就是最优检测方法。 0155 实。

49、施例3、 基于CRISPR-Cas13a系统的新型冠状病毒核酸的检测方法的灵敏度检 测 0156 将实施例1的一的(一)制备的mRNA标准品利用无RNA酶的水进行10倍系列梯 度稀 释， 得到含有不同浓度新型冠状病毒基因mRNA的溶液， 按照实施例1中二的方法 检测， 将表 7中的RT-RAA产物替换含有不同浓度新型冠状病毒基因mRNA的溶液， 使 mRNA在反应体系中 的浓度为105-10-1copies/test， 同时设置水为模板的扩增产物作为 阴性对照。 0157 检测结果如图4所示， 105-101copies/test组 “T” 线消失且 “C” 线显现； 100 copies/ 。

50、test组、 10-1copies/test组和阴性对照组 “T” 线和 “C” 线均显现。 判定105-101 copies/test 组为阳性， 100copies/test组、 10-1copies/test组和阴性对照组为阴性， 说明 本方法的灵 敏度为10copies/test。 0158 实施例4、 基于CRISPR-Cas13a系统的新型冠状病毒核酸的检测方法的特异性检 说明书 10/11 页 13 CN 111270012 A 13 测 0159 以日本脑炎病毒(JEV)、 立克次氏体(RIC)、 乙肝病毒(HBV)、 埃博拉病毒 (EBOV)、 单增李斯特菌(LM)、 H7N。