具有光热效应的腐植酸的制备及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010258900.1 (22)申请日 2020.04.03 (71)申请人 山西益成宏业腐植酸科技有限公司 地址 034019 山西省忻州市忻府区兰村乡 煤化工循环经济园区 申请人 太原师范学院 (72)发明人 张彩凤李林蔡志峰邓晨华 罗翠侯玲杰赵晋宇 (74)专利代理机构 太原科卫专利事务所(普通 合伙) 14100 代理人 张彩琴李晓娟 (51)Int.Cl. C08H 7/00(2012.01) A61K 41/00(2020.01) A61P 35/00(2006。

2、.01) (54)发明名称 具有光热效应的腐植酸的制备及其应用 (57)摘要 本发明涉及肿瘤光热治疗的光热剂领域， 具 体涉及的是具有光热效应的腐植酸的制备及其 应用。 将煤炭磨成粉末加入到焦磷酸钠溶液或者 碱溶液中， 90加热回流， 使煤炭溶解形成反应 液并暴沸； 反应液暴沸后继续加热回流2h； 然后 将反应液自然冷却至室温后， 离心收集上清液， 将上清液通过凝胶色谱柱进行提纯后， 烘干， 获 得腐植酸。 通过本发明制备方法制备获得的腐植 酸具有价格便宜、 光热转换效率高、 光热效能稳 定且具有良好生物相容性的特点。 可用于皮肤、 口腔等表面部位肿瘤的治疗， 亦可借助腔镜系统 用于各腔道肿瘤。

3、的治疗。 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 CN 111286040 A 2020.06.16 CN 111286040 A 1.具有光热效应的腐植酸的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 将煤炭磨成粉末加入到焦磷酸钠溶液或者碱溶液中， 90加热回流， 使煤炭溶解形成 反应液并暴沸； 反应液暴沸后继续加热回流2h； 然后将反应液自然冷却至室温后， 离心收集 上清液， 将上清液通过凝胶色谱柱进行提纯后， 烘干， 获得腐植酸。 2.根据权利要求1所述的具有光热效应的腐植酸的制备方法， 其特征在于， 所述焦磷酸 钠溶液或者碱溶液的浓度为0.1mol/L。 3.根据权利要求2所述的具有光热效应。

4、的腐植酸的制备方法， 其特征在于， 所述煤炭与 焦磷酸钠溶液或者碱溶液的质量比为1:5。 4.根据权利要求1或2或3所述的具有光热效应的腐植酸的制备方法， 其特征在于， 所述 离心步骤的参数为3600r/min的转速离心20min。 5.根据权利要求1或2或3所述的具有光热效应的腐植酸的制备方法， 其特征在于， 所述 烘干的温度为60。 6.根据权利要求1或2或3所述的具有光热效应的腐植酸的制备方法， 其特征在于， 所述 煤炭为山西风化煤、 云南褐煤、 宁夏风化煤、 俄罗斯泥炭或新疆风化煤。 7.如权利要求1或2或3所述的具有光热效应的腐植酸的制备方法制备获得的腐植酸。 8.权利要求7所述腐植。

5、酸作为光热转换材料的应用。 9.权利要求7所述腐植酸作为光热剂在肿瘤光热治疗中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111286040 A 2 具有光热效应的腐植酸的制备及其应用 技术领域 0001 本发明涉及肿瘤光热治疗的光热剂领域， 具体涉及的是具有光热效应的腐植酸的 制备及其应用。 背景技术 0002 光热治疗作为一种新型的肿瘤治疗策略， 借助激光的定位作用， 利用光热剂将激 光的光能转换为热能杀死肿瘤细胞， 从而实现对肿瘤的定点消除。 得益于腔镜技术的发展， 临床上可以将激光光源、 光热剂在可视的情况下输送到口腔部、 鼻咽部、 食管、 胃肠道、 胸腹 腔、 子宫、 膀胱等人体腔道。

6、系统发挥肿瘤的光热治疗。 相比传统的手术切除、 化疗、 放疗， 光 热治疗具有显著的靶向微创性、 良好的治疗效果、 低的毒副作用， 近年来受到广泛的关注与 研究。 光热剂在通常情况下， 无组织升温效应， 但在特定激光的照射下， 可迅速升温加热周 围组织并引起细胞坏死。 当温度到达42可以达到杀死肿瘤细胞的作用， 达到50及以上 时可将肿瘤细胞完全消融。 0003 在肿瘤的光热治疗中， 近红外激光(波长6501100nm)具备较高的组织穿透能力。 在近红外区有较高吸光度值的无机纳米材料(如金纳米材料、 碳纳米材料、 石墨烯、 钯纳米 片等)已在肿瘤光热治疗中被广泛研究， 但此类无机材料大多尚未进。

7、行临床试验， 面临价格 昂贵， 潜在的长期毒性不明等问题。 而普鲁士蓝、 吲哚箐绿等有机材料由于分子量小在体内 降解速度过快而可能无法满足光热治疗的时间。 0004 具有等离子体共振效应的贵金属材料， 在相对强度较小的激光照射下， 也会发生 金纳米棒的破碎， 使等离子体共振峰消失， 导致后续光热治疗效果大大降低。 0005 有机纳米材料， 如聚苯胺、 聚吡咯和卟啉脂质体等， 这类化学方法合成的纳米材料 合成过程较为复杂， 反应过程中可能会涉及不可控的副反应； 而且在进行临床应用前， 化学 合成的产物往往还需要进行详细的代谢机理研究和漫长的毒性评价， 以确保其安全性。 0006 与化学合成材料相。

8、比， 天然生物材料在临床上更受欢迎， 并且其相关的产品也具 有更大的被美国食品药监局(FDA)批准可能性。 这一方面是由于这类材料通常具有优良的 生物相容性和可代谢特性， 另一方面这类材料的长期生物毒性往往已经过充分研究， 安全 性有保障。 发明内容 0007 本发明为了解决目前的合成纳米材料并不适用于肿瘤光热治疗的问题， 提供了一 种具有光热效应的腐植酸的制备及其应用。 0008 本发明是通过以下技术方案实现的： 具有光热效应的腐植酸的制备方法， 包括以 下步骤： 0009 将煤炭磨成粉末加入到焦磷酸钠溶液或者碱溶液中， 90加热回流， 使煤炭溶解 形成反应液并暴沸； 反应液暴沸后继续加热回。

9、流2h； 然后将反应液自然冷却至室温后， 离心 收集上清液， 将上清液通过凝胶色谱柱进行提纯后， 烘干， 获得腐植酸。 说明书 1/6 页 3 CN 111286040 A 3 0010 在本发明中， 所述焦磷酸钠溶液或者碱溶液的溶剂均为水， 具体实施时， 水可采用 去离子水、 蒸馏水、 超纯水等。 所述的碱溶液可采用任何无机强碱制成， 优选的碱类物质为 氢氧化钠。 0011 作为本发明技术方案的进一步改进， 所述焦磷酸钠溶液或者碱溶液的浓度为 0.1mol/L。 0012 作为本发明技术方案的进一步改进， 所述煤炭与焦磷酸钠溶液或者碱溶液的质量 比为1:5。 0013 作为本发明技术方案的进。

10、一步改进， 所述离心步骤的参数为3600r/min的转速离 心20min。 0014 作为本发明技术方案的进一步改进， 所述烘干的温度为60。 0015 作为本发明技术方案的进一步改进， 所述煤炭为山西风化煤、 云南褐煤、 宁夏风化 煤、 俄罗斯泥炭或新疆风化煤。 0016 本发明进一步提供了上述具有光热效应的腐植酸的制备方法制备获得的腐植酸。 0017 进一步的， 所述腐植酸作为光热转换材料的应用。 0018 进一步的， 所述腐植酸作为光热剂在肿瘤光热治疗中的应用。 0019 本发明所述的具有光热效应的腐植酸的制备方法， 通过萃取剂(碱/焦磷酸钠)萃 取得到腐植酸， 相对于金纳米材料原料易得。

11、， 便宜； 该制备方法方便、 简单， 得到的腐植酸为 天然产物， 其生物相容性和亲水性好； 由于腐植酸中具有苯环等结构， 具有显著的 - 共轭 效应， 使得该材料具有较强的光热效应， 10min就可快速升温到50以上， 从而用于光热治 疗； 该材料的光热效应受材料浓度和照射激光功率影响； 该材料溶于水形成水悬液， 无任何 沉淀和浑浊， 表明其分散性很好。 附图说明 0020 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案， 下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性。

12、劳动的前提下， 还可以 根据这些附图获得其他的附图。 0021 图1为不同煤样来源的腐植酸样品的光热转化曲线。 0022 图2为S1水悬液在808nm激光不同功率照射下的光热转化曲线。 0023 图3为不同浓度的S1样品在808nm-3W激光照射下的光热转化曲线。 0024 图4为不同浓度的S5样品随着时间的延长对人口腔角质细胞(HOK)的抑制作用曲 线。 0025 图5为不同浓度的S5样品随着时间的延长对人口腔鳞癌细胞(HSC-4)的抑制作用 曲线。 0026 图6为随着时间的延长不同浓度的S5样品对人口腔角质细胞(HOK)的抑制作用曲 线。 0027 图7为随着时间的延长不同浓度的S5样品。

13、对人口腔鳞癌细胞(HSC-4)的抑制作用 曲线。 说明书 2/6 页 4 CN 111286040 A 4 具体实施方式 0028 为使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将对本发明的技术方案进行 详细的描述。 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基 于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有 其它实施方式， 都属于本发明所保护的范围。 0029 下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细的说明。 0030 在本实施例中， 所采用的溶液均为药用溶液。 0031 实施例1 0032 四种具有光热效应的腐植酸的制。

14、备方法， 包括以下步骤： 0033 将山西风化煤、 云南褐煤、 宁夏风化煤、 新疆风化煤样分别磨成粉末加入到焦磷酸 钠(药用)溶液中(质量比为1:5)， 焦磷酸钠溶液的浓度为0.1mol/L， 90加热回流， 分别使 得山西风化煤、 云南褐煤、 宁夏风化煤、 新疆风化煤样溶解并暴沸。 反应液暴沸后， 继续回流 加热2h。 然后将反应液冷却至室温， 以3600r/min的转速离心20min收集上清液。 将上清液通 过凝胶色谱柱进行提纯。 0034 将纯化后的清液放入烘干箱内烘干(60)制备成对应的腐植酸(山西风化煤、 云 南褐煤、 宁夏风化煤、 新疆风化煤样通过焦磷酸钠萃取制备成的腐植酸分别标记。

15、为S1、 S2、 S3、 S4)。 0035 实施例2 0036 两种具有光热效应的腐植酸的制备方法， 包括以下步骤： 0037 将云南褐煤、 新疆风化煤样分别磨成粉末加入到氢氧化钠(药用)溶液中(混合比 例为1:5)， 氢氧化钠溶液的浓度为0.1mol/L， 90加热回流， 分别使得云南褐煤、 新疆风化 煤样溶解并暴沸。 反应液暴沸后， 继续回流加热2h。 然后将反应液冷却至室温， 以3600r/min 的转速离心20min收集上清液。 将上清液通过凝胶色谱柱进行提纯。 0038 将纯化后的清液放入烘干箱内烘干(60)制备成对应的腐植酸(云南褐煤、 新疆 风化煤样通过氢氧化钠萃取制备成的腐植。

16、酸分别标记为S5、 S6)。 0039 实施例3 0040 为了验证本发明所提供的腐植酸能够在近红外区域具有可观的吸收， 同时能够将 光能快速转化为热能， 本发明进行了如下的试验研究。 0041 1.1不同煤样来源的腐植酸光热转化研究对比 0042 1.1.1试验处理方法： 0043 将实施例1和2制备获得的S1至S6样品分别用超纯水配置浓度为2mg/mL的水悬液 以及超纯水(H2O)、 完全培养基(Complete medium简称CM)， 每次取样3mL置于透明圆底玻璃 管内， 采用808nm激光器照射管底部， 以输出功率为3W照射10min。 所述完全培养基的具体成 分为DMEM基础培养。

17、基+10胎牛血清(FBS)+100U/ml青霉素+100 g/mL链霉素， pH为6.8 7.2。 0044 1.1.2试验结果： 0045 如图1所示为S1至S6样品以及H2O、 CM的光热转化结果曲线图。 该结果表明其升温 性能与煤样的种类以及处理方法有关。 不同样品最终能达到的温度不同， 且S1-S6样品的光 热转化温度都达到了43以上。 超纯水在相同条件下升温不明显。 除了S4之外， 其余样品2 说明书 3/6 页 5 CN 111286040 A 5 分钟内达到43， 10min升到最大值。 0046 样品水悬液在前期升温较快， 而在后期则趋于平稳。 这是由于随着水悬液体系温 度的升。

18、高， 向环境中扩散的热量也逐渐增多， 在恒定功率的激光照射下， 水悬液体系通过光 能转化得到的热量与向环境中散发的热量的差值越来越小， 最后趋于平衡。 0047 1.2不同功率照射下的腐植酸光热转化研究对比 0048 1.2.1试验处理方法： 0049 将实施例1制备获得的S1样品用超纯水配置浓度为1mg/mL的水悬液， 每次取样3mL 置于透明圆底玻璃管内， 取样四次， 分别采用808nm激光器照射管底部， 分别以输出功率为 1W、 2W、 3W和4W照射10min。 0050 1.2.2试验结果： 0051 各腐植酸样品溶于水形成水悬液， 无任何沉淀和浑浊， 表明其分散性很好。 0052 。

19、如图2所示为S1水悬液在808nm激光不同功率照射下的光热转化曲线。 S1浓度为 1mg/mL， 体积为3mL， 分别以输出功率为1W、 2W、 3W和4W照射10min后， 除1W时最高温度43 外， 2W/3W/4W时样品温度都升高到50以上。 0053 该结果还表明其升温性能亦是输出功率依赖的， 随着输出功率的增加， 最终能达 到的温度也越高。 0054 1.3不同浓度的腐植酸光热转化研究对比 0055 1.3.1试验处理方法： 0056 将实施例1制备获得的S1样品用超纯水配置浓度为0.25mg/mL、 0.5mg/mL、 1mg/mL 和2mg/mL的水悬液， 每次取样3mL置于透明。

20、圆底玻璃管内， 采用808nm激光器照射管底部， 以 输出功率为3W照射10min。 0057 1.3.2试验结果： 0058 如图3所示为不同浓度的S1样品在808nm-3W激光照射下的光热转化曲线。 S1体积 均为3mL， 浓度分别为0.25mg/mL、 0.5mg/mL、 1mg/mL和2mg/mL， 在输出功率为3W照射10min 后， 样品温度都升高到43以上。 除浓度为0.25mg/mL外， 其余浓度条件下温度均升高到50 以上。 0059 该结果还表明其升温性能亦是浓度依赖的， 随着浓度的增加， 最终能达到的温度 也越高。 0060 实施例4 0061 为了验证本发明所提供的腐植。

21、酸能够作为光热剂用于肿瘤近红外光热治疗， 本发 明进行了如下的试验研究。 0062 2.1温度对HOK细胞和HSC-4细胞活性的影响 0063 2.1.1试验处理方法： 0064 实验中选用了人口腔角质细胞(HOK)和人口腔鳞癌细胞(HSC-4)两种细胞系。 根据 不同的加热温度43、 45、 48与不同的加热时间10min,20min和30min分为九组。 分别收 集对数期HOK细胞与HSC-4细胞， 接种于3.5cm培养皿内， 每个培养皿内加入3ml完全培养基。 置于37、 5CO2细胞培养箱孵育24h， 倒置显微镜下观察。 待细胞贴壁后采用水浴锅， 对接 种于细胞培养皿内的细胞进行加热处。

22、理。 处理完后在倒置显微镜下观察并计数细胞， 计算 大致死亡率。 重复三次实验计算平均值。 说明书 4/6 页 6 CN 111286040 A 6 0065 2.1.2试验结果： 0066 如下表所示， 研究不同温度对人口腔角质细胞(HOK)和人口腔鳞癌细胞(HSC-4)两 种细胞系的影响。 0067 温度对HOK细胞和HSC-4细胞活性的影响 0068 0069 结果表明： HOK和HSC-4的治疗温度和时间要求为： 48， 10min。 0070 2.2腐植酸作为光热剂对HOK细胞和HSC-4细胞活性的影响 0071 2.2.1试验处理方法： 0072 实验中选用了人口腔角质细胞(HOK。

23、)和人口腔鳞癌细胞(HSC-4)两种细胞系， 以S5 样品作为实验用药， 取对数期细胞接种于96孔板内， 每孔100uL细胞悬液， 每孔细胞数2 103-3103， 常规培养24h后按相应浓度加药。 用Bio-Rad550酶标仪， 以450nm波长测量， 测定 每孔OD值。 0073 两种细胞系分别添加不同的浓度的S5样品室温培养24h、 48h及72h后， 测定每孔OD 值， S5样品浓度分别为0.25mg/mL、 0.5mg/mL、 1mg/mL和2mg/mL。 0074 在本实施例中， 实验组为细胞系在培养基上经过常规细胞培养24小时、 铺板后加 药。 空白组为与实验组相同的培养基。 对。

24、照组为细胞系在在培养基上经过常规细胞培养24 小时、 铺板未加药。 0075 2.2.2试验结果： 0076 按下列公式计算细胞活力： (实验组平均OD值-空白组平均OD值)/(对照组平均OD 值-空白组平均OD值)100。 其结果参见4至图7。 0077 由图可知： S5样品对人口腔角质细胞(HOK)和人口腔鳞癌细胞(HSC-4)的抑制作用 随S5浓度增加而增强， S5样品对人口腔角质细胞(HOK)和人口腔鳞癌细胞(HSC-4)的抑制作 用随时间增加而增强。 0078 结果表明： 不同浓度S5样品对HOK及HSC-4随着时间的延长及浓度的增加有一定的 抑制作用， 且对HOK细胞的抑制作用更强。

25、。 早期(24h)吸光度值增加(细胞活力增加)可能是 因为腐植酸与细胞结合增加了吸光度值(OD值)， 而抑制作用尚未体现； 后期(24h)后表现出 抑制作用， OD值下降， 细胞活力降低。 0079 另外， 明李时珍著 本草纲目 石部第九卷金石之三石炭， 释名煤炭、 石墨、 铁炭、 乌金石、 焦石。 主治刀伤， 用石炭捣成粉， 敷伤口； 误吞金银及钱在腹中不下， 用石 炭(一块， 杏核大)、 硫磺(一块， 皂角子大)， 共研细， 酒送下； 月经不通， 用石炭末一钱调汤， 送下去油的巴豆三粒， 有效； 产后儿枕剌， 用石炭(火煅、 酒淬， 凡七次)。 石膏(火煅)， 等分为 末， 每服一钱半， 。

26、粥送下。 由上述说明煤炭有生物相容性和可代谢特性。 而本发明通过萃取 剂萃取获得的腐植酸属于煤炭中的成分， 因此本发明的腐植酸应用于人体也同样具有生物 相容性和可代谢特性。 将其开发为近红外光热剂并应用于肿瘤的光热治疗具有较好的市场 前景。 0080 腐植酸即石炭中主要的药用成分， 将煤炭通过萃取剂萃取出的腐植酸已被证明具 说明书 5/6 页 7 CN 111286040 A 7 有抗肿瘤、 抗炎、 抗溃疡、 止泻、 止血、 抗菌、 抗病毒、 提高免疫力、 改善微循环、 调节内分泌等 方面的药效和作用。 而腐植酸是由草炭、 褐煤、 风化煤等提取、 分离、 纯化而得到的一种结构 复杂的有机化合物。

27、， 腐植酸的组成结构， 迄今尚未完全清楚。 已知腐植酸分子中含有苯环、 稠环和某些杂环(如毗咯、 呋喃、 吲哚等)， 各芳环之间有桥键相连， 芳环上有各种功能基团， 主要是羧基、 酚羟基、 甲氧基、 醌基等。 由于腐植酸有如此复杂的分子结构， 因此有可能表现 出多种的物理化学特性。 例如， 由于腐植酸本身分子量较大， 在一定介质中还可缔合成更大 的粒子， 因此具有胶体特性和吸附能力； 腐植酸分子上有许多羧基和酚羟基， 因此具有弱酸 性， 有较强的离子交换能力、 螯合能力和缓冲能力； 腐植酸分子上的酚、 醌结构， 可能参与生 物氧化还原的电子传递系统。 这些物理化学特性， 也有可能影响生物大分子。

28、的功能， 从而出 现生理、 药理活性。 0081 综上可以看出， 通过本发明制备方法制备获得的腐植酸具有价格便宜、 光热转换 效率高、 光热效能稳定且具有良好生物相容性的特点。 可用于皮肤、 口腔等表面部位肿瘤的 治疗， 亦可借助腔镜系统用于各腔道(消化道、 气道、 生殖道、 泌尿道等)肿瘤的治疗。 0082 以上所述， 仅为本发明的具体实施方式， 但本发明的保护范围并不局限于此， 任何 熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内， 可轻易想到变化或替换， 都应涵 盖在本发明的保护范围之内。 因此， 本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。 说明书 6/6 页 8 CN 111286040 A 8 图1 图2 说明书附图 1/4 页 9 CN 111286040 A 9 图3 图4 说明书附图 2/4 页 10 CN 111286040 A 10 图5 图6 说明书附图 3/4 页 11 CN 111286040 A 11 图7 说明书附图 4/4 页 12 CN 111286040 A 12 。