包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPT的重组质粒、重组菌及应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010031979.4 (22)申请日 2020.01.13 (71)申请人 中国科学院昆明植物研究所 地址 650201 云南省昆明市蓝黑路132号 (72)发明人 何明霞黄俊潮 (74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569 代理人 马云华 (51)Int.Cl. C12N 15/82(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A01H 5/10(2018.01) A01H 6/20(2018.01) (54)发明名称 一种包括虾青素合成酶融合基因、。

2、 无筛选标 记基因NPT的重组质粒、 重组菌及应用 (57)摘要 本发明提供了一种包括虾青素合成酶融合 基因、 无筛选标记基因NPT的重组质粒、 重组 菌及应用， 属于基因工程育种技术领域； 所述虾 青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQID NO： 1所示； 所述重组质粒以pBI121作为原始质 粒； 所述重组质粒中删除了筛选标记基因NPT 。 本发明将四个虾青素合成关键酶基因用2A短 肽序列连接， 能够简化重组质粒(表达载体)的构 建， 并实现各基因的协同表达。 另外， 本发明的重 组质粒中删除了筛选标记基因NPT， 增加了重 组质粒用于转基因的安全性。 权利要求书1页 说明书9页 序列表。

3、4页 附图3页 CN 111118059 A 2020.05.08 CN 111118059 A 1.一种包括虾青素合成酶融合基因、 无筛选标记基因NPT的重组质粒， 所述虾青素合 成酶融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 1所示； 所述重组质粒以pBI121作为原始质粒； 所 述重组质粒中删除了筛选标记基因NPT。 2.根据权利要求1所述的重组质粒， 其特征在于， 所述重组质粒以Napin启动子作为启 动子。 3.一种包括权利要求1或2所述重组质粒的重组菌。 4.权利要求1或2所述重组质粒或者权利要求3所述重组菌在亚麻荠育种中的应用。 5.权利要求1或2所述重组质粒或者权利要求3所述重。

4、组菌在提高亚麻荠种子中类胡萝 卜素的含量中的应用。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述类胡萝卜素包括虾青素。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 所述类胡萝卜素还包括新黄质、 酮式叶黄 素、 虾青素、 叶黄素、 酯化叶黄素、 叶绿素、 隐黄质、 海胆酮、 番茄红素、 -胡萝卜素和 胡萝卜 素。 8.权利要求1或2所述重组质粒或者权利要求3所述重组菌在提高亚麻荠种子总抗氧化 能力中的应用。 9.根据权利要求48任意一项所述应用， 其特征在于， 所述应用包括以下步骤： 将所述重组质粒或者重组菌导入亚麻荠植株， 培育， 得到亚麻荠种子， 从亚麻荠种子中 选择颜色为红色的种子。

5、， 得到目标亚麻荠种子。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述导入的方法包括农杆菌花序浸染法。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111118059 A 2 一种包括虾青素合成酶融合基因、 无筛选标记基因NPT的重 组质粒、 重组菌及应用 技术领域 0001 本发明涉及基因工程育种技术领域， 尤其涉及一种包括虾青素合成酶融合基因、 无筛选标记基因NPT的重组质粒、 重组菌及应用。 背景技术 0002 虾青素是一种分子结构独特的红色酯溶性酮式类胡萝卜素， 具有极强的抗氧化活 性以及抗辐射， 抗衰老、 抗肿瘤和预防心血管等疾病的功能。 虾青素的生物合成只发生于少 量细菌和绿藻中， 。

6、且产量很低； 植物中也只有夏侧金盏花(Adonis aestivalis)可以在其花 瓣中合成微量的虾青素。 由于虾青素的自然资源有限， 科学家们都在通过基因工程方法寻 求不同的植物来生产更高产量的天然虾青素， 并在莴苣、 马铃薯、 小麦、 油菜、 烟草、 番茄和 水稻等植物中获得成功。 但在这些转基因植物中经常使用潮霉素抗性基因(HPT)、 卡那霉素 抗性基因(NPT)和草丁膦抗性基因(BAR)等抗性标记基因筛选以获得成功转化的细胞。 由 于这些抗性基因存在对食品和生态环境的潜在危害， 已经成为影响转基因植物商品化应用 的主要障碍， 当务之急是培育出不含抗性标记基因、 安全的能生产虾青素的转。

7、基因植物。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种包括虾青素合成酶融合基因、 无筛选标记基因NPT 的重组质粒、 重组菌及应用， 该重组质粒、 重组菌能够用于培育不含抗性标记基因NPT的 转基因植物。 0004 为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技术方案： 0005 本发明提供了一种包括虾青素合成酶融合基因、 无筛选标记基因NPT的重组质 粒， 所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 1所示； 所述重组质粒以pBI121 作为原始质粒； 所述重组质粒中删除了筛选标记基因NPT。 0006 优选的， 所述重组质粒以Napin启动子作为启动子。 0007 本发明提供了。

8、一种包括上述方案所述重组质粒的重组菌。 0008 本发明提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在亚麻荠育种中的应用。 0009 本发明提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在提高亚麻荠种子中类胡 萝卜素的含量中的应用。 0010 优选的， 所述类胡萝卜素包括虾青素。 0011 优选的， 所述类胡萝卜素还包括新黄质、 酮式叶黄素、 虾青素、 叶黄素、 酯化叶黄 素、 叶绿素、 隐黄质、 海胆酮、 番茄红素、 -胡萝卜素和/或 胡萝卜素。 0012 本发明提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在提高亚麻荠种子总抗氧 化能力中的应用。 0013 优选的， 所述应用包括以下步骤： 0014 将所。

9、述重组质粒或者重组菌导入亚麻荠植株， 培育， 得到亚麻荠种子， 从亚麻荠种 说明书 1/9 页 3 CN 111118059 A 3 子中选择颜色为红色的种子， 得到目标亚麻荠种子。 0015 优选的， 所述导入的方法包括农杆菌花序浸染法。 0016 本发明的有益效果： 本发明提供了一种包括虾青素合成酶融合基因、 无筛选标记 基因NPT的重组质粒， 所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 1所示； 所 述重组质粒以pBI121作为原始质粒； 所述重组质粒中删除了筛选标记基因NPT。 本发明的 虾青素合成酶融合基因包括将虾青素合成途径中的三个关键酶基因以及促进有色体分化 与类。

10、胡萝卜素储藏的Orange(来自花椰菜)基因， 其中三个关键酶基因分别是来自莱茵衣藻 的 -胡萝卜素酮化酶(CrBKT)和来自雨生红球藻的羟化酶(HpBHY)基因、 八氢番茄红素合成 酶(CrtB)基因。 本发明将四个关键酶基因用2A短肽序列连接， 能够简化重组质粒(表达载 体)的构建， 并实现各基因的协同表达。 另外， 本发明的重组质粒中删除了筛选标记基因NPT ， 增加了重组质粒用于转基因的安全性。 通过农杆菌花序浸染法将本发明的重组质粒导 入亚麻荠植株， 得到的亚麻荠转化植株， 经检测， 亚麻荠转化植株的种子中总类胡萝卜素含 量为913.54 g/gDW， 是野生型(16.08 g/gD。

11、W)的56倍， 更为重要的是虾青素含量由0增加至 42.72 g/gDW。 亚麻荠转化植株种子总抗氧化能力转化株系显著高于野生型。 亚麻荠转化植 株种子可以直接通过常规物理榨油方式获得亚麻荠籽油， 比传统的通过超临界CO2临界萃 取的方法简单快捷， 且低成本高效率； 同时利用本发明的重组质粒用于亚麻荠育种， 能够获 得安全性更高、 品质更好的亚麻荠株系， 使得转基因亚麻荠产品商品化成为可能。 因此， 将 本发明的重组质粒用于亚麻荠育种， 并利用亚麻荠生产高品质的、 兼具不饱和脂肪酸和类 胡萝卜素的食用油具有极大的商业前景。 附图说明 0017 图1为本发明重组质粒图谱； 0018 图2为T0转。

12、化成功幼苗和野生型幼苗实物图， 其中A为T0转化成功幼苗， B为野生型 幼苗； 0019 图3为T1代种子和野生型种子实物图， 其中A为T1代种子， B为野生型种子； 0020 图4为T1代种子色素提取液和野生型种子色素提取液实物图， 其中A为T1代种子色 素提取液； B为野生型种子色素提取液； 0021 图5为T1代株系种子的PCR扩增结果； 0022 图6为转化子种子UHPLC色谱图； 0023 图7为野生型种子UHPLC色谱图； 0024 图8为转化子种子和野生型种子总抗氧化能力分析结果。 具体实施方式 0025 本发明提供了一种包括虾青素合成酶融合基因、 无筛选标记基因NPT的重组质 。

13、粒， 所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 1所示， 具体为： cccgggacaaag agtaaagaagaacaatggcatcttctatgctgtcttctgcgactatggttgcgtctccggctcaggctactatggt ggcaccgttcaacggtctgaagtcctccgcggctttcccggctactcgtaaagcgaacaacgacattaccagcatt acctctaacggtggtcgtgtgaactgcatgaacaacccgtctctgctgaaccatgcggtggaaaccatggcggtgg gttccaaatcctt。

14、cgcgaccgcgtctaagctgttcgatgcaaagacccgtcgttctgtgctgatgctgtatgcatg 说明书 2/9 页 4 CN 111118059 A 4 gtgccgccattgtgacgacgttatcgacgaccagactctgggcttccaggcacgtcagccggcgctgcagactccg gaacagcgtctgatgcagctggagatgaagactcgccaggcttatgcaggctctcagatgcacgaaccggcgttcg ctgctttccaggaagttgcgatggcgcatgatatcgctccggcatacgcgttt。

15、gatcatctggaaggcttcgctat ggacgtgcgcgaggcgcagtactcccagctggacgataccctgcgctactgctaccacgttgctggtgttgtgggc ctgatgatggcacagatcatgggtgttcgtgataacgcgaccctggatcgcgcatgtgacctgggtctggcattcc agctgactaacattgcgcgtgacattgttgacgatgcgcacgcaggccgttgttatctgccggcgtcttggctgga acacgaaggcctgaacaaagaaaactacgctgcaccggaaaaccg。

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17、cgctgtctagacagctgctgaactttgatctgctgaaac tggctggtgacgtggagtctaaccctggtccgatggcgtcctctatgctgtcttctgctactatggtggcatctcc ggctcaggcaactatggtggcaccgtttaacggtctgaagtcttccgcagctttcccggcaactcgcaaggcaaac aacgatattactagcattacttccaacggtggccgtgttaactgcatgctgagcaagctgcagtctattagcgtta aggctcgccgtgtggagctggctcgtgac。

18、attacccgtccgaaagtttgtctgcacgcgcagcgttgtagcctggt gcgtctgcgtgtggcggctccgcagactgaagaggcactgggtaccgttcaggctgcaggtgcgggcgacgaacac tccgctgatgtggctctgcagcagctggatcgtgcgattgcagaacgtcgtgcgcgtcgcaaacgcgaacagctga gctatcaggcagcggctatcgctgcttctattggtgtgtccggtattgcgatcttcgcgacctatctgcgtttcgc tatgcacatgactgtgggtgg。

19、tgcggttccgtggggcgaagttgcgggtactctgctgctggttgttggtggcgct ctgggcatggagatgtatgcgcgttatgcgcacaaagcgatctggcacgagtccccgctgggttggctgctgcaca aaagccatcacaccccgcgtaccggtccgttcgaggctaacgatctgtttgcaatcatcaacggcctgccggcgat gctgctgtgcaccttcggcttctggctgccgaacgtgctgggcgcggcttgtttcggcgcaggtctgggtatcact ctgtacggcatgg。

20、cgtacatgttcgtgcatgatggtctggttcatcgtcgtttcccgactggcccgatcgcgggtc tgccgtatatgaaacgcctgactgttgctcatcagctgcatcattctggcaaatatggcggtgcgccgtggggtat gttcctgggtccgcaggaactgcagcatattccgggtgcggctgaggaagtggaacgtctggtgctggaactggac tggtccaaacgtcagctgctgaacttcgatctgctgaaactggcgggtgacgtggaatctaaccctggtccgatgg ctagc。

21、tctatgctgtcctccgctaccatggttgcgtccccggcacaggcgactatggtggctccgttcaacggcct gaaatctagcgctgcatttccggcgactcgtaaggcgaacaacgacatcacttctatcaccagcaacggcggtcgc gttaactgtatgggtccgggtatccagccgaccagcgcgcgtccgtgttctcgtactaaacactctcgttttgcac tgctggcggcagcactgaccgctcgtcgtgtgaaacagttcaccaagcagtttcgttctcgccgcatggcagag。

22、ga cattctgaagctgtggcagcgtcagtatcatctgccgcgtgaagattctgacaagcgtaccctgcgtgagcgcgtt catctgtatcgtccgccgcgtagcgacctgggcggcatcgcggttgcggttaccgttattgctctgtgggcaaccc tgtttgtttatggcctgtggttcgttaagctgccgtgggcgctgaaagttggtgagaccgctacttcttgggcgac catcgcagcggttttcttctctctggaattcctgtacactggtctgttcatcaccactcacgatgc。

23、gatgcacggt actatcgcactgcgtaaccgtcgtctgaacgattttctgggtcagctggcaatttccctgtacgcgtggtttgact attctgtgctgcaccgtaaacattgggaacatcataaccataccggcgaaccgcgtgttgacccggacttccatcg tggcaacccgaacctggcagtgtggttcgcgcagtttatggtgagctacatgactctgtcccagtttctgaagatc gcggtttggtccaacctgctgctgctggcgggtgcgccgctggcaaaccagctgctgt。

24、ttatgaccgcagcaccga tcctgtctgcgttccgcctgttctattacggcacttatgttccgcaccatccggagaagggccatactggcgcgat 说明书 3/9 页 5 CN 111118059 A 5 gccgtggcaggtttcccgcacttcttccgcatcccgcctgcagtcctttctgacttgctatcatttcgacctgcac tgggagcatcatcgttggccgtatgctccgtggtgggagctgccgaaatgccgtcagatcgcacgtggcgcagctc tggctcagctgctgaacttcg。

25、atctgctgaagctggcaggcgacgttgaatccaaccctgggcccatggcttcttc tgcatttgcttttccttcttacataataaccaaaggaggactttcaactgattcttgtaaatcaacttctttgtct tcttctagatctttggttacagatcttccatcaccatgtctgaaacccaacaacaattcccattcaaacagaagag caaaagtgtgtgcttcacttgcagagaagggtgaatattattcaaacagaccaccaactccattacttgacactat taactacccaatc。

26、cacatgaaaaatctttctgtcaaggaactgaaacaactttctgatgagctgagatcagacgtg atctttaatgtgtcgaaaaccggtggacatttggggtcaagtcttggtgttgtggagcttactgtggctcttcatt acattttcaatactccacaagacaagattctttgggatgttggtcatcagtcttatcctcataagattcttactgg gagaagaggaaagatgcctacaatgaggcaaaccaatggtctctctggtttcaccaaacgaggagagagtgaacat gattg。

27、ctttggtactggacacagctcaaccacaatatctgctggtttaggaatggcggtaggaagggatttgaagg ggaagaacaacaatgtggttgctgtgattggtgatggtgcgatgacggcaggacaggcttatgaagccatgaacaa cgccggatatctagactctgatatgattgtgattcttaatgacaacaagcaagtctcattacctacagctactttg gatggaccaagtccacctgttggtgcattgagcagtgctcttagtcggttacagtctaacccggctctcagaga。

28、gt tgagagaagtcgcaaagggtatgacaaagcaaataggcggaccaatgcatcagttggcggctaaggtagatgtgta tgctcgaggaatgataagcggtactggatcgtcactgtttgaagaactcggtctttactatattggtccagttgat gggcacaacatagatgatttggtagccattcttaaagaagttaagagtaccagaaccacaggacctgtacttattc atgtggtgacggagaaaggtcgtggttatccttacgcggagagagctgatgacaaataccatggtg。

29、ttgtgaaatt tgatccagcaacgggtagacagttcaaaactactaatgagactcaatcttacacaacttactttgcggaggcatta gtcgcagaagcagaggtagacaaagatgtggttgcgattcatgcagccatgggaggtggaaccgggttaaatctct ttcaacgtcgcttcccaacaagatgtttcgatgtaggaatagcggaacaacacgcagttacttttgctgcgggttt agcctgtgaaggccttaaacccttctgtgcaatctattcgtctttcatgcagcgtgct。

30、tatgaccaggttgtccat gatgttgatttgcaaaaattaccggtgagatttgcaatggatagagctggactcgttggagctgatggtccgacac attgtggagctttcgatgtgacatttatggcttgtcttcctaacatgatagtgatggctccatcagatgaagcaga tctctttaacatggttgcaactgctgttgcgattgatgatcgtccttcttgtttccgttaccctagaggtaacggt attggagttgcattacctcccggaaacaaaggtgttccaattgagattgg。

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32、tgcctgatcgatacattgatcacggtgcaccagc tgatcaactagctgaagctggactcatgccatctcacatcgcagcaaccgcacttaacttaatcggtgcaccaagg gaagctctgttttgagagctc； 所述重组质粒以pBI121作为原始质粒； 所述重组质粒中删除了筛 选标记基因NPT； 所述重组质粒优选的以Napin启动子作为启动子。 0026 筛选标记基因NPT是一种抗性标记基因， 用于作为筛选标记， 获得获得成功转化 的细胞。 pBI121上含有筛选标记基因NPT。 本发明通过删除pBI121上的筛选标记基因NPT ， 能。

33、够消除重组质粒在用于植物育种过程中存在的对食品和生态环境的潜在危害。 0027 本发明所述虾青素合成酶融合基因包括将虾青素合成途径中的三个关键酶基因 以及促进有色体分化与类胡萝卜素储藏的Orange(来自花椰菜)基因， 其中三个关键酶基因 分别是来自莱茵衣藻的 -胡萝卜素酮化酶(CrBKT)和来自雨生红球藻的羟化酶(HpBHY)基 说明书 4/9 页 6 CN 111118059 A 6 因、 八氢番茄红素合成酶(CrtB)基因。 本发明将四个关键酶基因用2A短肽序列连接， 能够简 化重组质粒(表达载体)的构建， 并实现各基因的协同表达。 0028 本发明中， 所述虾青素合成酶融合基因包括用于。

34、启动三个与虾青素等类胡萝卜素 合成相关(CrtB， CrBKT， HpBHY， 简称BBB)和一个促进类胡萝卜素合成(Orange)的基因。 BBB 的三个基因的5 端ATG前均融合有拟南芥RBCS2的叶绿体导肽序列(TP)， 各基因间通过2A序 列链接使四个基因的表达在同一阅读框但翻译时形成各自编码的肽。 本发明对所述重组质 粒的构建方法没有特殊限制， 采用本领域常规方法即可。 本发明具体实施过程中， 虾青素合 成酶融合基因通过全合成后克隆于pBI121， 优选的利用Napin启动子控制表达形成重组质 粒。 0029 本发明提供了一种包括上述方案所述重组质粒的重组菌； 所述重组菌的原始菌优 。

35、选的包括农杆菌。 0030 本发明提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在亚麻荠育种中的应用。 0031 本发明提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在提高亚麻荠种子中类胡 萝卜素的含量中的应用； 所述类胡萝卜素包括虾青素； 优选的， 所述类胡萝卜素还包括新黄 质、 酮式叶黄素、 虾青素、 叶黄素、 酯化叶黄素、 叶绿素、 隐黄质、 海胆酮、 番茄红素、 -胡萝卜 素和/或 -胡萝卜素。 0032 本发明提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在提高亚麻荠种子总抗氧 化能力中的应用。 0033 优选的， 所述应用包括以下步骤： 将所述重组质粒或者重组菌导入亚麻荠植株， 培 育， 得到亚麻荠。

36、种子， 从亚麻荠种子中选择颜色为红色的种子， 得到目标亚麻荠种子； 所述 导入的方法包括农杆菌花序浸染法。 所述红色优选为暗红色； 由于类胡萝卜素为红色、 黄 色、 橘红色色素， 它在植物器官中合成后会改变植物器官的颜色， 收获的T0代种子能够通过 肉眼观察颜色鉴别转化成功种子。 转化成功的种子由于类胡萝卜素的积累而呈现暗红色， 未转化成功的种子为淡黄色， 两者颜色相差较大， 可以通过肉眼直接鉴定转化是否成功， 简 单快捷。 0034 下面将结合本发明中的实施例， 对本发明中的技术方案进行清楚、 完整地描述。 显 然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明。

37、中的实 施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属 于本发明保护的范围。 0035 实施例1 0036 一、 材料和方法 0037 1、 材料 0038 亚麻荠(Camelina sativa(L.)种质材料SC-N16， (参见 【苑丽霞， 郝敬云， 赵奎， 等.2EMS诱变亚麻荠获得2S贮藏蛋白缺失突变体.华北农学报， 2016， 31(3):11-17】 )， 由山 西农业大学作物遗传育种重点实验室提供。 将亚麻荠种子播种于直径9cm的育苗盆中， 1粒/ 盆； 盆中基质为腐殖质： 泥炭土： 珍珠岩5： 4： 1(体积比)； 温室温度为1622， 光。

38、源为自 然光， 相对湿度为60。 待植株生长至10cm时进行摘心处理， 以促进侧枝的生长和发育。 植 株生长约70d时进入花期准备转化， 转化前一天将植株浇透水。 共对20株(盆)植株进行处 理， 5株(盆)不处理作为对照。 说明书 5/9 页 7 CN 111118059 A 7 0039 2、 方法 0040 2.1植物表达载体的构建 0041 植物表达载体pBI121-Napin-BBBO由昆明擎科生物科技有限公司合成。 将pBI121 用Nhe 和Cla 双酶切后回收， 用T4 Ploymerase酶补平， 再用T4 DNA ligase连接后转化大 肠杆菌DH5 ， 挑取菌落37， 。

39、220rmp摇菌， 菌液提取即为pBI121(-NPT)质粒。 将pBI121- Napin-BBBO和pBI121(-NPT)质粒分别用Hind和Sac 双酶切后回收， T4 DNA ligase酶 连接后转化大肠杆菌DH5 ， 菌液提取质粒后双酶切进行鉴定， 鉴定正确后将pBI121(-NPT )-Napin-BBBO图谱参见图1(简写为： N-BBBO(-NPT)通过电转法转化农杆菌菌株 LBA4404， 获得的菌株保存于-80冰箱用于转化亚麻荠。 电转法仪采用仪器Bio-Rad Gene P lserX cellTM， 电转条件为： 2.5KV， 电容25 F， 电阻400。 0042。

40、 2.2农杆菌Floral Dip转化亚麻荠 0043 取-80保存的含有重组质粒的农杆菌N-BBBO(-NPT)， 在含有50mg/L链霉素和 50mg/L卡那霉素的LB固体培养上划线， 28下培养约36h。 从平板上挑取单菌落接种于3ml 含有上述抗生素的LB液体培养基中， 28条件下， 220rpm/min振荡培养过夜。 吸取2ml农杆 菌菌液加入250ml含有上述相应抗生素的LB液体培养基中， 28条件下， 220rpm/min振荡培 养至OD600为0.81.0， 5000rpm/min离心10min收集菌体， 用等体积渗透培养基(1/2MS， 5 蔗糖， 0.05Silwet L-。

41、77， PH5.7)悬浮菌体。 转化时将种植亚麻荠植株的盆用保鲜膜包 裹， 植株倒立于真空桶中， 花序部分浸入渗透培养基中。 盖上真空桶盖， 抽真空于80Kpa时开 始计时， 5min后将植株取出平放于铺了保鲜膜的地面并盖上黑色塑料袋。 24h后将植株放置 于温室培养， 一星期后按照以上方法重复浸染一次后将植株置于温室常规培养直至果荚成 熟， 收取成熟种子标记为T0代， 用于后续实验。 0044 3、 转基因植株的鉴定 0045 3.1 T0代种子颜色鉴定 0046 由于类胡萝卜素为红色、 黄色、 橘红色色素， 它在植物器官中合成后会改变植物器 官的颜色。 收获的T0代种子通过肉眼观察种子颜色。

42、鉴别转化成功种子， 并计算转化率。 0047 3.2转化子分子鉴定 0048 为了进一步验证， 将初期筛选到的红色T0代种子进行萌发， 种植于温室并收获T1 代种子， 对收获的红色T1代种子进行萌发即为T2植株， 提取T2代植株DNA， 用CRBKT引物扩增 进行鉴定。 0049 3.3类胡萝卜素测定方法 0050 3.3.1提取方法： 准确称量亚麻荠种子(0.20.3g)于2.0mg EP管中， 每个样品设 置3个重复， 加入2mm钢珠2颗， 200 l丙酮溶液， 置于快速研磨仪中(频率65Hz， 99s)研磨5次， 再加500 l丙酮溶液， 放置于超声波清洗器超声洗脱30min。 高速离心。

43、(14800rmp/min， 10min)取上清， 用0.22 m滤器过滤后上样测定。 0051 3.2.2 UHPLC方法： 仪器： AgilentTechnologies 1290Infinity； 色谱柱： ZORBAX Eclipse(3.050mm 1.8-Micron， Agilent， USA)； 流速： 1ml/min； 进样量： 5 l； 流动相程序： 01.0min： 水： 20， 乙腈： 60， 异丙醇： 5， 甲醇： 15； 1.0-2.0min： 水： 0， 乙腈： 80， 异丙醇： 5， 甲醇： 15； 2.0-8.0min： 水： 0， 乙腈： 80， 异丙醇： 。

44、5， 甲醇： 15； 0052 3.3.3类胡萝卜素定量： 采用外标法对样品中的类胡萝卜素含量进行定量。 说明书 6/9 页 8 CN 111118059 A 8 0053 3.4种子总抗氧化能力测定 0054 用苏州格锐思生物科技有限公司总抗氧化能力试剂盒进行种子总抗氧化能力的 测定。 0055 二、 结果与分析 0056 1、 转基因植株的鉴定 0057 1)植株、 种子和种子色素提取液鉴定 0058 T0转化成功幼苗和野生型幼苗实物图参见图2， 其中A为T0转化成功幼苗， B为野生 型幼苗； 0059 T1代种子和野生型种子实物图参见图3， 其中A为T1代种子， B为野生型种子； 006。

45、0 T1代种子色素提取液和野生型种子色素提取液实物图参见图4， 其中A为T1代种子 色素提取液； B为野生型种子色素提取液。 0061 类胡萝卜素在亚麻荠种子中积累， T0代转化成功种子与未转化种子在颜色上有明 显差异， 转化成功的种子呈现明显的暗红色， 而未转化成功的种子呈现淡黄色。 10株(盆)共 收获种子1125粒， 其中红色种子(转化成功)1粒， 转化率为1/1125。 0062 2)转化子N-BBBO(-NPTII)分子鉴定 0063 为了进一步验证， 将初期筛选到的红色T0代种子进行萌发并种植于温室， 提取T2 代植株叶片DNA， 用CRBKT引物进行扩增。 0064 正向引物核苷。

46、酸序列如SEQ ID NO： 2所示， 具体为： 5-GAACCTGGCAGTGTGGTTC-3； 0065 反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO： 3所示， 具体为： 5-AAAGGACTGCAGGCGGGATG- 3。 PCR扩增结果见图5， 由图5可以看出， CRBKT基因在转化子中表达。 0066 3)种子类胡萝卜素含量分析 0067 转化子种子UHPLC色谱图参见图6， 其中1.新黄质， 2.酮式叶黄素， 3.虾青素， 4.酮 式叶黄素， 5.叶黄素， 6.酯化叶黄素， 7.叶绿素， 8.隐黄质， 9.海胆酮， 10.番茄红素， 11. -胡 萝卜素， 12. -胡萝卜素； 野生型。

47、种子UHPLC色谱图参见图7， 其中5.叶黄素； 总类胡萝卜素含 量表参见表1。 由图6、 图7和表1可以看出， 野生型种子中仅含有叶黄素， 含量为16.08 g/ gDW， 而转化子N-BBBO(-NPTII)种子中含有12种已确定类胡萝卜 素， 包含新黄质 (Neoxanthin)、 酮式叶黄素(ketolutein)、 虾青素(Astaxanthin)、 叶黄素(lutein)、 酯化叶 黄素(Ester-ketolutein)、 叶绿素(ChlorophyII)、 隐黄质( -Cryptoxanthin)、 海胆酮 (Echinenone)、 番茄红素(lycopene)、 -胡萝卜 。

48、素(-carotene)、 -胡萝卜 素(- carotene)， 总类胡萝卜素含量为913.54 g/gDW， 是野生型的56倍， 虾青素含量也由0增加至 42.72 g/gDW。 0068 表1:转化子N-BBBO(-NPT)与野生型类胡萝卜素含量比较 说明书 7/9 页 9 CN 111118059 A 9 0069 0070 *表示在p0.05水平上的显著性差异， 数据表示为平均值标准误， n3。 0071 4)种子总抗氧化能力分析 0072 转化子种子和野生型种子总抗氧化能力分析结果参见图8(*表示在p0.05水平 上的显著性差异， 数据表示为平均值标准误， n3)， 由图8可以看出。

49、， N-BBBO-(NPT)转 化子种子总抗氧化能力为8.22 mol/g， 野生型为3.02 mol/g， 转化子种子总抗氧化能力明 显高于野生型。 高含量的总类胡萝卜素， 尤其是虾青素的积累明显提高了种子总抗氧化能 力。 0073 由上述内容可以看出， 本发明将虾青素合成途径中的三个关键酶基因， 来自莱茵 衣藻的 -胡萝卜素酮化酶(CrBKT)、 来自雨生红球藻的羟化酶(HpBHY)基因、 来自菠萝泛菌 的八氢番茄红素合成酶(CrtB)基因， 以及促进有色体分化与类胡萝卜素储藏的Orange(来 自花椰菜)基因在油料作物亚麻荠中表达。 同时为了简化表达载体的构建和实现各基因在 亚麻荠种子中。

50、的协同表达将四个关键酶基因用手足口病2A自切割肽段连接， 在种子特异性 启动子NAPIN控制下通过农杆菌花序浸染法导入油料作物亚麻荠。 在前期实验中我们发现 转化成功的种子由于类胡萝卜素的积累而呈现暗红色， 未转化成功的种子为淡黄色， 两者 颜色相差较大， 用肉眼就可以分辨， 因此在构建载体时删除了筛选标记基因(-NPT)。 该方 法简单快捷且安全。 10株(盆)共收获种子1125粒， 其中红色种子(转化成功)1粒， 转化率为 1/1125。 用促进合成、 降低产物降解等策略获得了能在种子中合成并高含量积累虾青素， 同 时又无选择标记基因的安全的、 高品质亚麻荠株系。 其总类胡萝卜素含量为91。