Anaerostipes sp B2131菌及其在炎症性肠病中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010033957.1 (22)申请日 2020.01.13 (83)生物保藏信息 CGMCC NO. 1.5295 2019.10.08 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 孙德森许正平盛静浩白荣盘 (74)专利代理机构 杭州中成专利事务所有限公 司 33212 代理人 金祺 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A61K 35/741(2015.01) A61P 1/00(2006.。

2、01) A23L 33/135(2016.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 Anaerostipes sp B2131菌及其在炎症性肠 病中的应用 (57)摘要 本发明公开了一种Anaerostipessp.B2131 菌， 其保藏号为CGMCCNO.1.5295。 本发明还同时 公开了上述Anaerostipessp.B2131菌在制备预 防和/或治疗炎症性肠病的药物中的应用。 本发 明的肠道分离细菌可作为益生菌制剂， 应用于药 物组合物、 食品、 保健品及食品添加剂等产品， 用 于调节肠道菌群稳态， 预防及治疗炎症性肠病等 肠道疾病的发生。 权利要求书1页 说。

3、明书9页 序列表1页 附图3页 CN 111117925 A 2020.05.08 CN 111117925 A 1.Anaerostipes sp.B2131菌， 其特征在于： 该Anaerostipes sp.B2131菌的保藏号为 CGMCC NO.1.5295。 2.如权利要求1所述的Anaerostipes sp.B2131菌在制备预防和/或治疗炎症性肠病的 药物中的应用。 3.根据权利要求2所述的应 用， 其特征在于 ： 所述药物含有药学有效剂量的 Anaerostipes sp.B2131菌和药学上可接受的载体。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于： 所述药学有效剂量为1。

4、06-1010CFU。 5.根据权利要求3或4所述的应用， 其特征在于： 所述药学上可接受的载体为奶粉、 乳 糖、 环糊精、 麦芽糖、 葡萄糖、 甘油、 谷氨酸钠、 维生素C、 甘露糖、 半乳糖、 甘露聚醇或甲基纤 维素。 6.根据权利要求25任一所述的应用， 其特征在于： 所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎 或克罗恩病。 7.一种用于预防和/或治疗炎症性肠病的药物组合物， 其特征在于， 所述药物组合物含 有药学有效剂量的保藏号为CGMCC No.1.5295的Anaerostipes sp.B2131菌。 8.根据权利要求7所述的药物组合物， 其特征在于： 所述药学有效剂量为106-1010CFU。

5、。 9.用于预防和/或治疗炎症性肠病的食品/保健品/食品添加剂， 其特征在于， 所述食 品/保健品/食品添加剂中含有保藏号为CGMCC No.1.5295的Anaerostipes sp.B2131菌。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111117925 A 2 Anaerostipes sp B2131菌及其在炎症性肠病中的应用 技术领域 0001 本发明属于微生物的技术领域， 具体涉及一种Anaerostipes sp.菌在预防和/或 治疗炎症性肠病中的应用。 背景技术 0002 炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease， IBD)是一类以消化道慢性炎症为特 征的。

6、疾病， 主要包括溃疡性结肠炎亚型(Ulcerative Colitis， UC)和克罗恩病亚型(Crohn s Disease， CD)。 IBD的临床表现主要为持续腹泻、 腹痛、 直肠出血/便血、 体重减轻等， 严重 影响患者的生活质量， 且易复发， 被认为是一种终身性疾病。 截止2016年， UC和CD在欧美国 家的发病率超过0.3(发病人口/国家人口)， 其中UC的发病率在挪威最高， 达0.505， 而 德国CD的发病率以0.322居全球最高。 目前， 发达国家的IBD发病率已处于平台期， 尚无明 显改善趋势。 自1990年以来， 非洲、 亚洲和南美洲等新兴工业化国家的发病率以每年5-1。

7、0 的速度迅速上升。 随着人民饮食结构、 生活方式和生活环境的显著改变， 我国IBD的发病率 (现为1.8/10万人)呈持续快速增长的趋势， 已成为消化系统常见疾病。 0003 IBD发病机制认识已从最初的适应性免疫拓展到现今的天然免疫， 鉴定了一批参 与发病过程的免疫细胞及其分泌的炎症介质和细胞因子， 并逐渐认识到肠道菌群紊乱、 天 然免疫系统失调以及它们之间相互作用的异常在IBD发生发展中扮演重要的角色。 IBD的发 病过程可归纳为： 由于遗传易感性和/或外界环境刺激使得肠道菌群发生紊乱和正常肠黏 膜屏障功能失调， 大量肠腔内微生物及其代谢产物通过破损的屏障进入肠壁内， 激活了肠 道天然免。

8、疫系统， 导致急性炎症； 如果机体的自身免疫系统功能失调， 就不能及时控制住急 性炎症和免疫反应对正常细胞的损伤， 炎症就会朝着慢性化方向发展， 导致诸如纤维化、 非 典型增生乃至肿瘤的发生发展。 0004 人体肠道是一个多元化和充满活力的微生态系统， 最新研究结果显示人体肠道菌 群有1000种以上， 总数量多达约41013个微生物， 与人体细胞数量相当。 虽然肠道菌群种类 和数量繁多， 但是约占据肠道菌群98的优势菌来自拟杆菌门、 厚壁菌门、 变形菌门和放线 菌门。 近年来， 肠道菌群在IBD发生发展中的作用越来越受到重视。 研究发现， 与健康人群肠 道菌群相比， IBD患者肠道菌群发生了显。

9、著变化， 其物种多样性显著低于健康人群， 其中共 生厌氧菌厚壁菌门和拟杆菌门的多样性显著下降， 而变形菌门则显著升高。 菌群组成分析 显示， IBD患者粪便中的毛螺菌科(Lachnospiraceae)含量显著减少； 而短双歧杆菌 (Bifidobacterium breve)、 共生梭菌(Clostridium symbiosum)在UC患者显著富集， 梭形 梭菌(Clostridiumclostridioforme)、 大肠杆菌(Escherichia coli)等12种菌在CD患者中 特异性增多。 同时， 在西班牙IBD患者队列研究中发现粪杆菌属(Faecalibacterium)、 消。

10、化 链球菌(Peptostreptococcaceae)等6种微生物在CD患者粪便中显著减少， 而梭杆菌属 (Fusobacterium)、 埃希氏菌属(Escherichia)则显著升高。 综上， 大量临床资料表明IBD患 者肠道菌群严重失调。 0005 基于肠道菌群失调和腔内抗原刺激是IBD发病和复发的重要原因， 近10年来益生 说明书 1/9 页 3 CN 111117925 A 3 菌被广泛使用以改善肠道微环境， 恢复机体正常菌群、 降低炎症反应， 以达到控制肠道炎症 及维持缓解的目的， 例如， 美沙拉嗪联合双歧杆菌在临床IBD治疗中已获得良好效果。 开发 不同功能的益生菌被认为是今后。

11、预防和治疗IBD的重要途径。 Anaerostipes菌是厚壁菌门 梭菌纲梭菌目毛螺菌科的一个属， 已有研究表明毛螺菌科的一些菌种具有缓解肠炎的作 用， 而IBD病人中毛螺菌科丰度通常显著低于正常人。 但截止目前， 临床上仍缺乏用于治疗 IBD的毛螺菌科菌种， 因此寻找和开发毛螺菌菌株有重要意义。 0006 2016800915239的发明 粪厌氧棒杆菌(Anaerostipes caccae)及其应用 提供了 粪厌氧棒杆菌(Anaerostipes caccae)在治疗和/或预防炎症相关疾病的用途， 还提供了一 种用于治疗和/或预防炎症相关疾病的组合物， 包括药品、 饮料、 食品， 或动物饲。

12、料组合物 等， 以及改善哺乳动物肠道病变、 减缓哺乳动物体重的下降、 和/或降低哺乳动物的疾病活 动指数(DAI)的方法。 发明内容 0007 本发明要解决的技术问题是提供一种Anaerostipes sp.菌及其在预防和/或治疗 炎症性肠病中的应用。 0008 即， 本发明提供一种肠道分离细菌可作为益生菌制剂， 应用于药物组合物、 食品、 保健品及食品添加剂等产品， 用于调节肠道菌群稳态， 预防及治疗炎症性肠病等肠道疾病 的发生。 0009 为了解决上述技术问题， 本发明提供Anaerostipes sp.B2131菌， 该Anaerostipes sp.B2131菌的保藏号为CGMCC N。

13、O.1.5295。 0010 本发明还同时提供了上述Anaerostipes sp.B2131菌在制备预防和/或治疗炎症 性肠病的药物中的应用。 0011 作为本发明应用的改进： 所述药物含有药学有效剂量的Anaerostipes sp.B2131 菌和药学上可接受的载体。 0012 作为本发明应用的进一步改进： 所述药学有效剂量为106-1010CFU。 0013 作为本发明的应用的进一步改进： 所述药学上可接受的载体为奶粉、 乳糖、 环糊 精、 麦芽糖、 葡萄糖、 甘油、 谷氨酸钠、 维生素C、 甘露糖、 半乳糖、 甘露聚醇或甲基纤维素。 0014 作为本发明的应用的进一步改进： 所述炎症。

14、性肠病为溃疡性结肠炎或克罗恩病。 0015 本发明还同时提供了一种用于预防和/或治疗炎症性肠病的药物组合物， 所述药 物组合物含有药学有效剂量的保藏号为CGMCC No.1.5295的Anaerostipes sp.B2131菌。 0016 作为本发明的药物组合物的改进： 所述药学有效剂量为106-1010CFU。 0017 本发明还同时提供了一种用于预防和/或治疗炎症性肠病的食品/保健品/食品添 加剂， 所述食品/保健品/食品添加剂中含有保藏号为CGMCC No.1.5295的Anaerostipes sp.B2131菌。 0018 本发明从粪便中分离获得Anaerostipes sp.B2。

15、131， 其保藏信息如下： 保藏名称为 Anaerostipes sp.， 保藏单位： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏地 址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏编号： CGMCC NO.1.5295， 保藏时间2019年10月08 日。 0019 Anaerostipes sp.B2131的16S rDNA部分序列比对结果及扫描电镜观察的菌体形 说明书 2/9 页 4 CN 111117925 A 4 态， 如图1所述。 0020 菌株Anaerostipes sp.B2131能调节肠道菌群稳态， 预防及治疗炎症性肠病等肠 道疾病。 即， 具有可抑制肠道有害菌的生长，。

16、 调节肠道菌群的功能。 0021 本发明还提供了检测Anaerostipes sp.B2131菌的定量PCR方法。 0022 本发明检测发现IBD病人中Anaerostipes sp.B2131菌含量显著下降。 0023 本发明证明了Anaerostipes sp.B2131菌在预防和/或治疗炎症性肠病具有良好 效果。 0024 本发明经由活体内及体外的相关实验证实， Anaerostipes sp.B2131菌可以抑制 肠道有害菌生长， 改善肠道菌群， 对炎症性肠病， 包括溃疡性结肠炎或克罗恩病， 具有优异 的抵抗力且无毒副作用， 可持久且有效地应用于制备预防和/或治疗炎症性肠病的药物、 药。

17、 物组合物、 食品、 保健品或食品添加剂， 这些药物、 药物组合物、 食品、 保健品或食品添加剂 可用于预防和治疗炎症性肠病， 具有重大应用价值。 0025 本发明Anaerostipes sp.B2131菌区别于Anaerostipes caccae菌。 首先， 本发明 具有实验依据， 即利用Anaerostipes sp.B2131菌特异性PCR引物和荧光定量PCR技术检测 粪便， 结果显示IBD病人该菌含量显著降低正常对照组。 本发明Anaerostipes sp.B2131菌 与Anaerostipes caccae的16S rDNA序列相似度仅为95(相似度达到97才认为是同一 物种。

18、)， 说明2个菌是同一属不同种的菌， 因此他们的生物学特性和功能存在差异。 研究结果 显示， Anaerostipessp.B2131菌具有调节肠道菌群的作用， 例如其能显著抑制肠道有害的 变形菌门。 从治疗肠炎的效果看， Anaerostipes sp.B2131减少体重降低幅度达到10左 右， 肠道长度比对照组增长约1.3cm， HE切片也显示肠道上皮更加完整， 显著降低了IL-6等 炎性因子的表达， 可见其改善肠炎的程度也优于Anaerostipes caccae菌。 附图说明 0026 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 0027 图1为Anaerostipes sp。

19、.B2131菌的鉴定结果； 其中， 0028 (A)为Anaerostipes sp.B2131菌的部分16S rDNA序列比对结果； 0029 (B)为该菌的系统分类结果； 0030 (C)为扫描电镜下观察的菌体形态图。 0031 图2为Anaerostipes sp.B2131菌在健康对照及IBD病人粪便菌群中的丰度检测。 0032 图3为Anaerostipes sp.B2131菌可以抑制肠道有害菌 -变形菌的生长。 0033 图4为口服Anaerostipes sp.B2131菌可以减轻小鼠DSS诱导肠炎表型； 其中， 0034 (A)为BHI处理组、 BHI-DSS处理组和Anaer。

20、ostipes sp.B2131-DSS处理组小鼠在 DSS诱导肠炎期间体重变化曲线； 0035 (B)为三组小鼠在DSS诱导肠炎期间的疾病活动指数； 0036 (C)为三组小鼠DSS诱导肠炎第9天小鼠结直肠的长度(肠道越短表示肠炎越严 重)； 0037 (D)为三组小鼠远端结肠H&E染色显示肠道上皮破坏情况； 0038 (E)为三组小鼠结肠组织中炎症因子IL-1 、 IL-6和IL-17A的表达情况。 说明书 3/9 页 5 CN 111117925 A 5 具体实施方式 0039 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此： 具体实施方式 0040 004。

21、1 试剂、 材料与设备 0042 0043 0044 实施例1、 Anaerostipes sp.B2131菌的分离、 培养与鉴定 0045 (1)条件培养基准备 0046 预脱氧液体BHI培养基(含5牛血清和0.1半胱氨酸)： 称取脑心浸液(BD公司) 37g于容量为1L的锥形瓶， 加入1g半胱氨酸和双蒸水定容至1000ml， 搅拌溶解， 然后用高压 灭菌锅121灭菌15min； 灭菌完成后， 将培养基放入厌氧培养箱， 冷却至40-50左右， 加入 50ml胎牛血清并震荡均匀， 得预脱氧液体BHI培养基， 然后分装至50ml离心管。 0047 预脱氧固体BHI培养基(含5牛血清， 0.1半胱。

22、氨酸和1mg/L的氨曲南)： 称取脑 心浸液(BD公司)37g于容量为1L的锥形瓶， 加入1g半胱氨酸、 15g琼脂粉和双蒸水定容至 1000ml， 搅拌溶解， 然后用高压灭菌锅121灭菌15min； 灭菌完成后， 将培养基放入厌氧培 养箱， 冷却至40-50左右， 加入50ml胎牛血清及1mg氨曲南并震荡均匀， 得预脱氧固体BHI 培养基； 然后进行倒平板操作， 每个10cm直径的培养皿中加入20-25ml的得预脱氧固体BHI 培养基， 自然冷却使其凝固。 0048 (2)样品收集和细菌培养 0049 首先， 取0.1g新鲜的健康小鼠粪便于1.5ml离心管中， 并迅速转移到厌氧培养箱 内， 。

23、加入1ml预脱氧液体BHI培养基， 用无菌移液器吸头搅拌成匀浆； 然后将菌液悬浊液按照 说明书 4/9 页 6 CN 111117925 A 6 1/10的比例梯度稀释5次(用预脱氧液体BHI培养基作为溶剂进行稀释)， 取100 L涂布于预 先脱氧的BHI固体平板(预脱氧固体BHI培养基)， 放入厌氧盒中， 37培养72h； 挑取单克隆 接种到新的BHI固体平板上传代培养。 0050 (3)菌种鉴定 0051 用小移液器吸头挑取一个菌落于1.5ml离心管汇中， 加入20 L双蒸水， 沸水浴 5min。 然后用16S rDNA通用引物进行菌落PCR。 0052 使用的引物序列为： 0053 00。

24、54 0055 PCR反应体系为： 0056 0057 反应程序为： 0058 0059 将获得的PCR产物送至生物公司测序， 得到长为1011bp的序列， 如图1A所示。 然后 将序列在NCBI或者RDP数据库进行比对， 得到物种分类信息， 确认其为Anaerostipes属菌 种， 如图1B所示。 0060 将所得的Anaerostipes sp.B2131菌进行保藏， 保藏信息如下： 保藏名称为 说明书 5/9 页 7 CN 111117925 A 7 Anaerostipes sp.， 保藏单位： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏地 址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3。

25、号， 保藏编号： CGMCC NO.1.5295， 保藏时间2019年10月08 日。 0061 (4)扫描电镜观察菌种形态 0062 首先， 在厌氧培养箱内挑选一接种环的菌落到10ml预脱氧BHI液体培养基中， 然后 放置于37厌氧培养箱内， 静置厌氧培养过夜使菌液浑浊； 然后， 取细菌样品1 .5ml， 4000rpm离心5min， 弃上清， 用PBS缓冲液洗涤1次； 再用新鲜配制的体积浓度2.5戊二醛 (PH7.4的PBS缓冲液配制)重悬样品， 放置于4固定过夜； 固定完成后， 4000rpm离心5min 收集细胞， 弃去戊二醛固定液， 用PBS缓冲液洗涤样品3次， 每次15min， 接。

26、着加入100 L 1 (质量)锇酸溶液室温固定样品1h； 然后4000rpm离心5min收集细胞， 弃去锇酸固定液， 用 PBS缓冲液洗涤样品3次， 每次15min； 再分别用30、 50、 70、 80、 90、 95、 100乙 醇对样品进行梯度脱水(每一浓度15min)； 最后， 对样品进行临界点干燥(冷冻电镜制样的 常规操作步骤)， 并用扫描电子显微镜观察样品。 扫描电镜下观察的菌体形态图如图1C所 示。 0063 综上， 从健康小鼠粪便中分离得到单克隆菌株， 经过16S rDNA序列比对鉴定该菌 为细菌界， 厚壁菌门， 梭菌纲， 梭菌目， 毛螺菌科， Anaerostipes属的菌种。

27、； 扫描电镜图片显 示Anaerostipes sp.B2131为的形态为长杆菌， 无鞭毛， 细胞壁光滑。 0064 实施例2、 Anaerostipes sp.菌含量在IBD病人及健康对照中的丰度检测 0065 (1)粪便菌群DNA提取 0066 IBD患者粪便样品由浙江大学附属邵逸夫医院炎症性肠病中心住院患者提供， 样 品收集后及时冻存于-20冰箱， 2天内用干冰冷冻运输至实验室的-80冰箱保存。 健康人 粪便样品由体检健康人提供， 5小时内取回实验室冻存于-80冰箱。 提取粪便DNA时， 从-80 取出样品， 在未解冻状况下， 用药匙取100-150mg粪便于1.5ml离心管； 然后， 。

28、采用粪便菌 群DNA提取试剂盒(Qiagen)提取粪便菌群总DNA， 再用Nanodrop 2000紫外微量分光光度计 及琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度、 纯度和质量， 质检合格后进行后续操作。 0067 (2)定量PCR法检测样品中Anaerostipes sp.菌的含量 0068 将上述粪便菌群DNA稀释成10ng/ul， 然后在384孔板加样， 并用罗氏480II系统进 行定量检测。 0069 引物序列为： 0070 0071 PCR反应体系为： 0072 说明书 6/9 页 8 CN 111117925 A 8 0073 0074 反应程序为： 0075 0076 所有样品均有3个平行，。

29、 以Universal bacteria为内参， 采用2- Ct法计算各样品 Anaerostipes sp.菌的相对丰度。 0077 所得结果如图2所述， 根据图2， 可得知以下结论： 肠道菌群失调与IBD的发生发展 有着密切的联系， IBD病人肠道中Anaerostipes sp.菌含量显著低于健康人群。 0078 实施例3、 Anaerostipes sp.B2131菌培养及丁酸产生能力检测： 0079 (1)Anaerostipes sp.B2131菌培养(厌氧培养) 0080 将保藏编号： CGMCC NO.1.5295的Anaerostipes sp.B2131菌于预先脱氧的液体 。

30、BHI培养基中37厌氧培养(培养时间约为48小时)， 直至菌落长至直径1-2mm， 然后用吸头 挑取1个菌落到15ml预先脱氧的液体BHI培养基中， 37静置厌氧培养48小时， 得到 Anaerostipes sp.B2131菌液， 其密度约为5x108CFU/mL。 0081 (2)Anaerostipes sp.B2131菌丁酸产生能力检测 0082 取Anaerostipes sp.B2131菌液1ml进行12000r/min离心5min， 取上清， 用双蒸水 稀释1000倍， 并用盐酸溶液将pH调节至2-3， 旋涡震荡混匀； 再12000rpm离心10分钟， 将上清 小心收集到色谱瓶内。

31、； 同时， 配制10 g/mL、 50 g/mL、 100 g/mL、 200 g/mL、 500 g/mL和1000 g/mL的标准丁酸溶液。 然后， 采用安捷伦6890N型气相色谱仪搭配气相色谱柱DB-624UI对样 品进行分析： 取1 L样品于进样孔， 初始柱温为100， 载气为高纯氮气， 流量为1.1mL/min， 保持3分钟； 然后以每分钟10的速度升温至200， 保持3min； 最后， 根据标准丁酸溶液曲 线下面积绘制标准曲线， 基于样品丁酸的曲线下面积计算菌液中丁酸的浓度。 测得在预先 脱氧的BHI培养基条件下， Anaerostipes sp.B2131菌48小时产丁酸量为41。

32、.3mmol/L。 0083 实施例4、 Anaerostipes sp.B2131菌抑制肠道有害菌 -变形菌生长 0084 (1)准备WT小鼠 0085 首先从上海斯莱克公司购买14只8周龄的野生型BL/C56小鼠， 饲养于浙江大学实 验动物中心SPF屏障系统内， 适应一周后将小鼠随机分成BHI溶剂对照组和Anaerostipes 说明书 7/9 页 9 CN 111117925 A 9 sp.B2131菌处理组， 每组7只小鼠。 0086 (2)Anaerostipes sp.B2131菌肠道定植。 0087 取实施例3培养所得的Anaerostipes sp.B2131菌液， 然后400。

33、0rpm离心5min收集 菌体， 再将细菌重悬于预脱氧液体BHI培养基中， 终浓度约109CFU/ml。 按照每只小鼠200 L Anaeroostipes sp.B2131的剂量灌胃处理WT小鼠， 隔天进行处理， 持续处理2周， 同时对照 组仅灌胃预脱氧液体BHI培养基。 0088 (3)定量检测Anaerostipes sp.B2131菌丰度及 -变形菌的丰度。 灌胃处理完成后 的第7天， 收集小鼠粪便， 按照上述实施例2所述方法提取粪便菌群DNA并进行定量qPCR检 测。 0089 所得结果如图3所述， 根据图3， 可得知以下结论： Anaerostipes sp.B2131菌可以 调节。

34、肠道菌群， 比如显著性降低肠道有害菌 变形菌纲的丰度。 0090 实施例5、 Anaerostipes sp.B2131菌可以减轻小鼠DSS诱导肠炎表型 0091 (1)准备WT小鼠 0092 从上海斯莱克公司购买30只8周龄的野生型BL/C57小鼠， 饲养于浙江大学实验动 物中心SPF屏障系统内， 适应一周后将小鼠随机分成3组， 分别为BHI对照组、 BHI-DSS组和 Anaeroostipes sp.B2131-DSS组。 0093 (2)Anaerostipes B2131菌肠道定植； 0094 取实施例3培养所得的Anaerostipes sp.B2131菌液， 然后4000rpm离。

35、心5min收集 菌体， 再将细菌重悬于预脱氧液体BHI培养基中， 终浓度约109CFU/ml。 按照每只小鼠200 L Anaeroostipes sp.B2131的剂量灌胃处理WT小鼠， 隔天重复处理， 持续2周， 同时BHI和BHI- DSS组仅进行预脱氧液体BHI培养基灌胃处理。 2周的灌胃处理结束后， 小鼠即可进行诱导肠 炎实验。 0095 (3)建立小鼠DSS诱导肠炎模型 0096 将BHI-DSS组和Anaerostipes sp.B2131-DSS组小鼠饮水换成2.5(质量)DSS 水溶液， 处理7天后换成正常饮水至实验结束。 即， DSS诱导肠炎的第1-7天， BHI-DSS组。

36、和 Anaeroostipes sp.B2131-DSS组小鼠饮用2.5DSS水溶液， 第8-9天饮用普通饮用水； 而 BHI对照组在此9天始终饮用普通饮用水。 0097 诱导肠炎的第1-9天记录体重变化、 粪便干稀度、 便血情况。 体重评分： 0， 无体重下 降； 1， 下降1-5； 2， 下降6-10； 3， 下降11-20； 4， 下降超过20； 粪便评分： 0， 固态大便； 1， 固态大便， 易变形； 2， 不成形大便； 3， 液体状大便； 便血评分： 0， 隐血检测阴性； 1， 隐血检 测阳性； 2粪便中有可见血； 3， 严重便血。 疾病活动指数(disease active ind。

37、ex,DAI)为体 重、 大便、 便血评分的平均数。 体重变化的对比如图4A所示， 疾病活动指数的对比如图4B所 示。 0098 根据该图可得知： BHI-DSS组和Anaeroostipes sp.B2131-DSS组小鼠饮用DSS后均 出现体重减轻， 疾病活动指数升高的肠炎表型， 说明DSS肠炎诱导是成功的。 进一步比较， Anaeroostipes sp.B2131-DSS小鼠体重减轻幅度显著少于BHI-DSS组； 同时Anaeroostipes sp.B2131-DSS小鼠疾病活动指数显著低于BHI-DSS组， 说明Anaeroostipes sp.B2131菌灌 胃小鼠肠炎症状较BH。

38、I-DSS组有显著改善。 0099 (4)DSS处理第9天， 颈椎脱臼法处死小鼠， 取出小鼠结肠部分， 测量其长度， 所得结 说明书 8/9 页 10 CN 111117925 A 10 果如图4C所示。 取远端结肠组织1cm左右肠断进行福尔马林固定， 并后续进行HE染色和组织 形态学分析， 所得结果如图4D所示。 同时取1cm左右肠断提取RNA， 用荧光定量PCR方法检测 其炎症因子表达情况， 所得结果如图4E所示。 0100 根据图4C， 可得知： DSS诱导肠炎模型中， Anaeroostipes sp.B2131DSS小鼠肠道 长度为(4 .3cm0 .5)显著长于BHI-DSS小鼠 。

39、(5 .6cm0 .8) ； 根据图4D， 可得知 Anaeroostipes sp.B2131DSS小鼠肠道上皮细胞仍可以看到较完整的隐窝结构， 而BHI- DSS小鼠肠道上皮则完全被破坏， 无完整的隐窝结构。 根据图4E， 可得知： Anaeroostipes sp.B2131DSS小鼠炎症因子IL-1 、 IL-6和IL-17A的表达都显著低于BHI-DSS组。 此图说明 组织形态学和炎症因子指标都反映出Anaeroostipes sp.B2131DSS小鼠肠炎发病显著降 低。 0101 对比例、 将2016800915239的发明 粪厌氧棒杆菌(Anaerostipes caccae)。

40、及其应 用 中的粪厌氧棒杆菌(Anaerostipes caccae)， 按照本发明的上述方法进行检测， 所得结 果与本发明的对比如下： 0102 首先， Anaeroostipes sp.B2131 48小时产生有益短链脂肪酸丁酸的能力高于 Anaerostipes caccae， 约高10左右； 0103 其次， Anaeroostipes sp.B2131具有调节改善肠道菌群的功能， 而Anaerostipes caccae并没有数据显示具有此功能； 0104 最后， 从保护肠炎的效果看， Anaerostipes sp.B2131改善肠炎程度显著优于 Anaerostipes cacc。

41、ae， 具体表现为， DSS诱导肠炎第7天时， Anaerostipes sp.B2131-DSS组 体重下降比BHI-DSS组少9.1(而根据Anaerostipes caccae AF04-45处理组体重改善数 据计算， (AF05-45组第7天体重-模型组第7天体重)/AF04-45组第1天体重)结果仅为 6.8)， 肠道的长度增长1.45cm(而Anaerostipes caccae AF04-45组与模型组肠道差异为 1.19cm)， 另外肠道上皮的完整程度更好， 且炎症因子的表达显著降低。 0105 最后， 还需要注意的是， 以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。 显然， 本发 。

42、明不限于以上实施例， 还可以有许多变形。 本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形， 均应认为是本发明的保护范围。 说明书 9/9 页 11 CN 111117925 A 11 序列表 浙江大学 Anaerostipes sp B2131菌及其在炎症性肠病中的应用 1 SIPOSequenceListing 1.0 1 1011 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 1 tgggtcactg acttcgggcg ttactgactc ccatggtgtg acgggcggtg tgtacaagac 60 ccgggaacgt attcaccg。

43、cg acattctgat tcgcgattac tagcgattcc agcttcatgt 120 agtcgagttg cagactacaa tccgaactga gacgttattt ttgggatttg ctcactctca 180 cgaggctgct tccctctgtt tacgccattg tagcacgtgt gtagccctgg tcataagggg 240 catgatgatt tgacgtcgtc cccaccttcc tccaggttat ccctggcagt ctctctagag 300 tgcccacctn atatgctggc tactaaagat aggggt。

44、tgcg ctcgttgcgg gacttaaccc 360 aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc tgtcactcct gtcccgaagg 420 aaaggtccgg ttaaggaccg gtcagaagga tgtcaagacc aggtaaggtt cttcgcgttg 480 cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggtcc ccgtcaattc ctttgagttt 540 cattcttgcg aacgtactcc ccaggtggaa tacttactgc gttggctgcg gcac。

45、cgaagc 600 ctctacggcc ccgacaccta gtattcatcg tttacggcgt ggactaccag ggtatctaat 660 cctgtttgct ccccacgctt tcgtgcctca gtgtcagttt cagtccagta agccgccttc 720 gccactgatg ttcctcctaa tatctacgca tttcaccgct acactaggaa ttccgcttac 780 ctctcctgca ctccagtctg acagtttcaa aagcagtccc agagttaagc cctgggtttt 840 cacttctga。

46、c ttgccatacc acctacgcac cctttacacc cagtaattcc ggataacgct 900 tgccccctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag ccggggcttc ttagtcaggt 960 accgtcattt tcttccctgc tgatagagct ttacataccg agatacttct t 1011 序列表 1/1 页 12 CN 111117925 A 12 图1 说明书附图 1/3 页 13 CN 111117925 A 13 图2 图3 说明书附图 2/3 页 14 CN 111117925 A 14 图4 说明书附图 3/3 页 15 CN 111117925 A 15 。