红麻HcCLA1基因VIGS沉默体系.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010073455.1 (22)申请日 2020.01.22 (71)申请人 福建农林大学 地址 350002 福建省福州市仓山区上下店 路15号 (72)发明人 张立武张力岚徐益祁建民 张列梅徐建堂 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 饶文君蔡学俊 (51)Int.Cl. C12N 15/54(2006.01) C12N 9/10(2006.01) C12N 15/83(2006.01) A01H 5/00(2018.01) A01H。

2、 6/60(2018.01) (54)发明名称 一种红麻HcCLA1基因VIGS沉默体系 (57)摘要 本发明属于植物基因工程技术领域， 公开了 一种红麻HcCLA1基因VIGS沉默体系。 通过构建含 有HcCLA1基因特异性片段的pTRV2病毒沉默表达 载体质粒， 农杆菌介导法转化红麻， 诱导红麻内 源HcCLA1发生沉默， 有效降低了红麻HcCLA1基因 的表达水平， 导致白化表型。 本发明方法建立了 TRV-VIGS沉默红麻内源基因从而鉴定基因功能 的体系， 具有快速， 高通量， 易于操作的优势， 为 开展红麻基因功能研究提供了新途径。 权利要求书1页 说明书4页 序列表4页 附图3页 。

3、CN 111118044 A 2020.05.08 CN 111118044 A 1.一种红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1， 其特征在于： 所述1-脱氧木酮 糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的全长基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 2.一种用于沉默红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的HcCLA1基因特异性片 段， 其特征在于： 所述HcCLA1基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。 3.一种红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的VIGS病毒载体， 其特征在于： 利 用gateway重组克隆技术将HcCLA1基因特异。

4、性片段连接至VIGS病毒骨架载体pTRV2中， 构建 获得重组病毒载体pTRV2-HcCLA1。 4.一种红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的VIGS沉默体系， 其特征在于， 所 述VIGS沉默体系的构建方法包括以下步骤： （1） 利用冻融法将重组病毒载体pTRV2-HcCLA1转化至农杆菌GV3101； （2） 将转化后的阳性农杆菌菌液与pTRV1菌液按菌液体积比1:1混合制成混合菌液； （3） 将种子浸泡于步骤 （2） 的混合菌液中， 24浸种24 h； （4） 将浸泡后的种子点在清水浇透的土壤中， 于24/20 ， 14 h/10 h， 光/暗周期生 长， 观察红麻真叶的。

5、表型， 并检测叶片中HcCLA1的表达情况， 即构建得到红麻1-脱氧木酮 糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的沉默体系。 5.如权利要求2所述的HcCLA1基因特异性片段在沉默红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成 酶基因HcCLA1中的应用。 6.如权利要求3所述的一种红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的VIGS病毒 载体在沉默红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1中的应用。 7.如权利要求4所述的一种红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的VIGS沉默 体系在沉默红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN。

6、 111118044 A 2 一种红麻HcCLA1基因VIGS沉默体系 技术领域 0001 本发明属于植物基因工程技术领域， 具体涉及一种红麻HcCLA1基因VIGS沉默体 系。 背景技术 0002 病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)属于转录后基因 沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。 其中由烟草脆裂病毒 (tobacco rattle virus, TRV)诱导的基因沉默(TRV- VIGS), 以其持续时间长、 沉默效率高, 寄主 植物病毒症状轻, 不会掩盖沉默表型, 且在各种组。

7、织均可产生基因沉默等优点, 成为目 前应用广泛的一类基因沉默体系。 TRV-VIGS已在番茄、 烟草、 辣椒、 拟南芥等植物上成功应 用。 0003 在不同的植物中建立VIGS体系， 可选用1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因 （cloroplasto alterados，CLA1） 基因作为报告基因。 植物CLA1(cloroplastos alterados 1)基因参与叶绿体发育过程， 进化中高度保守，CLA1基因突变体有明显的白化表型, 是易 于识别的标记性状。 本发明构建了携带HcCLA1干扰片段的烟草脆裂病毒重组载体， 通过农 杆菌成功侵染红麻， 建立红麻高效VIGS体系,为红麻功能。

8、基因组学研究提供技术支撑。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种红麻HcCLA1基因VIGS沉默体系。 该方法成功建立红麻 HcCLA1基因的VIGS沉默体系， 实现简单、 高效、 低成本鉴定红麻HcCLA1基因功能。 0005 为实现上述目的， 本发明采用以下技术方案： 一种红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1， 该基因的全长基因的核苷酸序列 如SEQ ID NO.1所示。 0006 一种用于沉默红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的HcCLA1基因特异性 片段， 所述HcCLA1基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示. 一种红麻1-脱氧木。

9、酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的VIGS病毒载体， 利用gateway重组 克隆技术将HcCLA1基因特异性片段连接至VIGS病毒骨架载体pTRV2中， 构建获得重组病毒 载体pTRV2-HcCLA1。 0007 一种红麻HcCLA11基因VIGS沉默体系， 其构建方法包括以下步骤： （1） 通过冻融法将重组病毒载体pTRV2-HcCLA11转化到农杆菌GV3101感受态细胞， PCR 鉴定阳性； （2） 将转化后的阳性农杆菌菌液与pTRV1菌液按菌液按体积比1:1混合制成混合菌液； （3） 将红麻种子在步骤 （2） 的混合菌液中24， 浸泡24 h； （4） 将步骤 （3） 浸泡后的种。

10、子点在清水浇透的土壤中， 于24 /20 ， 14 h/10 h光/暗 周期生长， 观察新长出的红麻真叶的表型变化， 并检测叶片中HcCLA11的表达情况， 即构建 得到红麻HcCLA11基因序列沉默体系。 说明书 1/4 页 3 CN 111118044 A 3 0008 上述HcCLA1基因特异性片段在沉默红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1 中的应用。 0009 上述一种红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的VIGS病毒载体在沉默红 麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1中的应用。 0010 上述一种红麻HcCLA11基因的VIGS沉默体系沉默红麻1。

11、-脱氧木酮糖-5-磷酸合成 酶基因HcCLA1中的应用。 0011 上述红麻1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1， 全长基因序列的获得： 在TAIR 网站 （https:/www.arabidopsis.org/） 获得拟南芥AtCLA1（AT4G15560） 基因蛋白质序列。 然后， 在NCBI网站 （https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/, Sequence Read Archive (SRA) 登 录号 PRJNA596386） ， 利用红麻优良品种福红952的参考基因组 （Zhang et al., 2020, Plant Biotechnology Jou。

12、rnal, DOI: 10.1111/pbi.13341） ， 通过 BLASTP查找红麻同源 基因， 获得1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的全长基因序列， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 0012 上述HcCLA1基因特异性片段的克隆： 以1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1 的全长基因序列为模板， 设计用于扩增HcCLA1基因CDS结构域上的250bp特异性片段的引物 HcCLA1-F和HcCLA1-R； 其核苷酸序列分别为： HcCLA1-F： SEQ ID NO.2： 5 -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATTATGT。

13、CTTCAATGCT CCTAGAG-3 HcCLA1-R：SEQ ID NO.3： 5 -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCACAACATTATTCCTTTCA CCTTTC-3 取红麻福红952的幼嫩叶片， 在研钵中用液氮冷冻并研磨成粉状， 然后用OMEGA试剂盒 操作步骤提取RNA， -80冻存备用。 取出-80冻存的RNA， 按照TaKaRa反转录试剂盒操作步 骤合成cDNA第一链， 于-20保存。 以cDNA为模板， 利用特异性引物HcCLA1-F和HcCLA1-R， PCR扩增HcCLA1基因特异性片段， 其大小为250bp ， 核苷酸序列如SEQ ID 。

14、NO.4所示。 0013 本发明的有益效果： 1 本发明首次构建红麻HcCLA1基因VIGS沉默体系， 获得了具有能够使红麻HcCLA1基因 沉默的体系。 0014 2 本发明通过， 并采用烟草脆裂病毒构建红麻HcCLA1基因沉默体系， 能够在红麻 植株内进行系统扩散传播。 0015 3 本发明所述沉默体系能够有效降低红麻HcCLA1基因的表达水平， 叶绿素被漂 白。 附图说明 0016 图1本发明实施例1中构建的重组病毒载体pTRV2-HcCLA1农杆菌菌液PCR的琼脂糖 凝胶电泳图。 M: DNA ladder DL2000; 1-8: 农杆菌克隆。 0017 图2本发明实施例1中沉默载体。

15、侵染红麻幼苗后出现的新叶白化表型形状。 0018 图3本发明实施例2中采用实时荧光定量PCR （qRT-PCR） 检测红麻HcCLA1的沉默效 果。 CK： 空载体pTRV2侵染的红麻幼苗；HcCLA1： 重组病毒载体pTRV2-HcCLA1侵染的红麻幼 苗。 说明书 2/4 页 4 CN 111118044 A 4 0019 图4 质粒pTRV2-HcCLA1结构图。 本发明采用gateway cloning的方法构建载体质 粒pTRV2-HcCLA1。 其中， ccdB为致死基因， Cm为目标基因HcCLA1。 具体实施方式 0020 在本发明中所使用的术语， 除非有另外说明， 一般具有本。

16、领域普通技术人员通常 理解的含义。 0021 下面结合具体的制备实施例和应用实施例， 并参照数据进一步详细地描述本发 明。 应理解， 这些实施例只是为了举例说明本发明， 而非以任何方式限制本发明的范围。 0022 在以下的实施例中， 未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用到的引物， 均在首次出现时标明， 其后所用相同引物， 均以首次标明的内容相同。 0023 实施例1构建重组病毒载体pTRV2-HcCLA1 （1）HcCLA1全长基因序列的获得 首先， 在TAIR网站 （https:/www.arabidopsis.org/） 获得拟南芥AtCLA1（AT4G15560） 。

17、基因蛋白质序列。 然后， 在NCBI网站 （https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/, Sequence Read Archive (SRA) 登录号 PRJNA596386） ， 利用红麻优良品种福红952的参考基因组 （Zhang et al., 2020, Plant Biotechnology Journal, DOI: 10.1111/pbi.13341） ， 通过 BLASTP查找红麻同源基因， 获得1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的全长基因序列， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 0024 （2）HcCLA1基因特异性片段的克隆 以1-脱氧。

18、木酮糖-5-磷酸合成酶基因HcCLA1的全长基因序列为模板， 设计用于扩增 HcCLA1基因CDS结构域上的250bp特异性片段的引物HcCLA1-F和HcCLA1-R； 其核苷酸序列分 别为： HcCLA1-F： SEQ ID NO.2： 5 -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATTATGTCTTCAATGCT CCTAGAG-3 HcCLA1-R：SEQ ID NO.3： 5 -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCACAACATTATTCCTTTCA CCTTTC-3 取红麻福红952的幼嫩叶片， 在研钵中用液氮冷冻并研磨成粉状， 然后。

19、用OMEGA试剂盒 操作步骤提取RNA， -80冻存备用。 取出-80冻存的RNA， 按照TaKaRa反转录试剂盒操作步 骤合成cDNA第一链， 于-20保存。 以cDNA为模板， 利用特异性引物HcCLA1-F和HcCLA1-R， PCR扩增HcCLA1基因特异性片段。 0025 PCR反应体系为： cDNA模板2 L、 上下游引物(10 M)各1.5 L、 dNTP(2mM)5 L、 10 KOD PCR buffer 5 L、 MgSO4(25mM)2 L、 KOD Plus 1 L， 补ddH2O至50 L。 扩增条件为： 94变 性3min、 5530s、 682min 32个循环、。

20、 72延伸10min。 得到HcCLA1共250bp的特异性序列 （SEQ ID NO.4） ， 送公司进行测序分析， 确保该特异性片段位于HcCLA1的基因结构域上。 该 片段沉默后，HcCLA1基因的功能丧失。 0026 （3） 载体构建及VIGS侵染 采用Gateway技术构建载体。 其操作步骤如下： 将该HcCLA1特异性片段 （SEQ ID NO.4） 、 载体pDONR207和BP酶按体系混匀后， 置于25 的PCR仪中进行过夜连接。 再将得到的连接产物热激转化到DB3.1感受态细胞中， 然后涂布 说明书 3/4 页 5 CN 111118044 A 5 在含有庆大霉素 （50 g。

21、/mL） 的LB平板上， 37过夜培养， 挑取阳性单克隆扩大培养。 提取质 粒pDONR207-HcCLA1后， 用pDONR207的通用引物pDONR207-F （SEQ ID NO.5） 和pDONR207-R PCR （SEQ ID NO.6） 扩增检测。 再将质粒pDONR207-HcCLA1、载体pTRV2和LR酶按体系混匀后， 置于25的PCR仪中进行过夜连接。 再将得到的连接产物热激转化到TOP10感受态细胞中， 然后涂布在含有卡那霉素的 （50 g/mL） LB平板上， 37过夜培养， 挑取阳性单克隆扩大培 养。 提取质粒pTRV2-HcCLA1， 用HcCLA1-F和HcCL。

22、A1-R进行PCR扩增检测， 测序验证序列为 HcCLA1的特异性片段SEQ ID NO.4。 将质粒pTRV2-HcCLA1（结构图见图4） 通过冻融法转入 GV3101感受态细胞中， 经过含有50 g mL-1卡那霉素、 50 g mL-1庆大霉素和50 g mL-1利 福平的筛选， 获得含目标基因片段HcCLA1特异性片段的农杆菌菌株。 0027 参考Velsquez等的制备方法。 以pTRV1质粒、 pTRV2 质粒和pTRV2-HcCLA1质粒分 别转化农杆菌GV3101。 挑取新鲜培养的含pTRV1质粒、 pTRV2 质粒和pTRV2-HcCLA1质粒的农 杆菌GV3101转化子单。

23、菌落 （图1） ， 分别接种到1 mLLB液体培养基(Kan, 50 g mL-1; Gen, 50 g mL-1;Rif, 50 g mL-1)中， 28 180 转 min-1 培养24 h; 然后转入150 mL LB 液 体培养基 (Kan, 50 g mL1; Gen, 50 g mL1;Rif, 50 g mL1)中， 28180 转 min-1 培养12 h； 28 5000rpm 离心10 min 收集菌体细胞， 以适当体积的重悬液(10 mmol L-1 MgCl2, 10 mmol L-1 MES 以及200 mol L-1 乙酰丁香酮) 重悬至终浓度为1.5(OD600)。

24、； 将 重悬液于室温下静置3 h， 将携带有pTRV1载体的农杆菌GV3101菌液分别与携带pTRV2的农 杆菌GV3101菌液和携带pTRV2-HcCLA1质粒的农杆菌GV3101菌液的重悬液按体积比1 1 混 匀制成2种混合菌液， 用于侵染红麻种子。 红麻种子在混合菌液中24， 侵泡24h， 将红麻种 子实验材料置于24/20 ， 光/暗周期14 h/10 h 的条件下生长。 0028 实施例2 HcLMI1在红麻中的表达分析 （1） 侵染后红麻HcLMI1基因表达量测定 待被pTRV: CLA1侵染的种子长出的苗， 叶片表型为白色时 （图2） ， 取被pTRV: CLA1侵染 的叶片， 。

25、用RNA试剂盒提取叶片总RNA， 以Actin为内参基因， 通过RT-PCR检测被沉默后目标 基因的表达量。 所用引物为：HcCLA1-RT-F (SEQ ID NO.7); HcCLA1-RT-R (SEQ ID NO.8)； Actin-RT-F (SEQ ID NO.9)； Actin-RT-R (SEQ ID NO.10)。HcCLA1基因表达量测定结果见 图3， 图3结果表明： 与对照CK相比， 受到含有pTRV2-HcCLA1载体农杆菌侵染的红麻叶片中 HcCLA1基因表达量显著降低。 说明书 4/4 页 6 CN 111118044 A 6 SEQUENCE LISTING 福建。

26、农林大学 一种红麻HcCLA1基因VIGS沉默体系 10 10 PatentIn version 3.3 1 4004 DNA 人工序列 1 ttgactcaaa ggtttgcaac tcagtcctcc acttaccatt tgagaaataa acagtgccaa 60 aaacagtggc acagtcaata accaattttg tttataaatc tacatttcat tggttccacc 120 atctctcatt cttgcactca cttggtgggg atactttatt ttttttctgg gttcttctca 180 ttttgagctc ttggccaat。

27、a attttataaa aatacttcat tgttctttgt agattgttta 240 gtattttcta gccatggctc tttgtgcatg ttcatttcct gccattgtta gctgctgtgc 300 tgctgcttca gaacctcaaa agtccactcc ttttgcttcc catttgcttg gtggttcaga 360 tctgggtttc cacccattgc ttaagctcaa tcaggttcat atgaagaata aaacagcaga 420 aaaaaaaaaa ctgggttttg ttttttttgg ggggtta。

28、gat tttaaagtta ttatctgttt 480 gaataaagtt tagttttaag aaagggatag cctacgaaaa attctctctt tttttggctt 540 tctttctttc tttctcattt tctataatct agtatttgtt ttgtgttttc ttttgacttg 600 gatacaatta agtctttgat tccagtttaa aaatatgtat aaattgaaaa aaagggttgt 660 tgtttttttt gttttgattt gtttaaggtg aagaaaaggc catgtggggt ttatg。

29、catca 720 ctatcagaag gagctgagta ttactcctca agaccagcaa cgccgctctt ggacactata 780 aactatccaa ttcatatgaa aaatctctct gtaaaggtat agaaacatta gaaaagaaca 840 tgtttttttt ttgttgtaat ttattatgag atgttcatct cttttatcat atatgtatgt 900 atgagaactt ttcatgcagg aactgaaaca actagctgat gaactgcggt ctgatgtgat 960 tttcaacgtt。

30、 tcaaaaactg gtggtcactt ggggtcaagc cttggcgtgg ttgaacttac 1020 tgtggctctt cattatgtct tcaatgctcc tagagacaag atattatggg atgttggaca 1080 tcaggttcgg cttggttcta gttttgcttg gtttcctttt attttcttat gtgaattggc 1140 cctaatttgt tatagtaact catttggttt gtagtcttac cctcataaaa tcttgactgg 1200 gagaagagat aagatgcata ccat。

31、gaggca aactaatgga ttggccggat tcacgaaacg 1260 agctgagagc gaatatgatt gctttgggac tggtcacagt tcaaccacaa tctctgctgg 1320 cttgggtatt agtctggtct tcttgcattc attttgcata tatgttttag gttagaaagt 1380 tgaaatagat aaatattatc gaaccatcat cgagttcttt gatgttgctt ttagaaccgg 1440 gttggtttgt atggctaatc taaaccttgt tcatctgct。

32、a acatgtgatt tttgcttaat 1500 atgggatgaa gttttagttt tcgatatggt ggaattttat ttttgattct gttctgcaaa 1560 tcgagttcca cttgcccttt ggagttttaa ttgtctcatg ttttgggtgg tcaggaatgg 1620 序列表 1/4 页 7 CN 111118044 A 7 ctgtgggaag ggatctgaaa ggtgaaagga ataatgttgt tgctgtcata ggcgatggtg 1680 caatgaccgc gggacaagct tacgaag。

33、caa tgaataatgc cggatacctg gattccgata 1740 tgattgttat tcttaatgac aataaacaag tttctctgcc aactgccaat cttgatggac 1800 ctataccgcc cgtgggagct ttgagcagtg ctctcagtag gctgcaatcg aacaggcctc 1860 ttagagaact aagagaggtt gctaaggtaa atagaaagga acagagccgg agacgctaat 1920 ataattttgc ccgccaacta aaattaactt gaactgagtt t。

34、ggttttatt gcagggagtt 1980 accaagcaaa tcggtgggcc catgcatgaa ctggctgcaa aagttgatga gtatgctcgt 2040 gggatgataa gtggttccgg ttcaacactt tttgaagaac ttggactgta ttatattgga 2100 cctgttgatg gccacaacat cgatgattta gtttctattc tcaaagaggt taagactact 2160 aaaacaacgg gtcctgtcct gatccatgtt gtcaccgaga aaggccgggg ttatcc。

35、atat 2220 gcagagagag ctgatgacaa gtaccatggt aacatgcaca ataagccata tttagaagag 2280 atgtcatttt gtatgattta attcactgac ctcgatttat gaacttagtt tagggaacaa 2340 aagagaataa attatgtctg gctttctttt cacaggagtg gtgaagttcg atccggcaac 2400 tggaaagcaa ttcaaaggca gttctgttac ccagtcttac actacatatt ttgctgaggc 2460 tttgat。

36、tgca gaagccgagg ccgacaaaaa tatcgttgcc atccatgctg caatgggagg 2520 tggaactgga ttaaacctct tcctccgccg tttcccacaa agatgttttg atgttgggat 2580 tgccgaacaa catgccgtaa cctttgctgc aggtttggcc tgtgaaggct tgaaaccttt 2640 ttgtgcaatc tactcatcat tcatgcaaag ggcttatgac caggtaagct accaaagtta 2700 ccattgtttt tacgatctgt 。

37、aaaagattaa tattctgtgt atgttaaaca tctgcatttc 2760 aaattcataa cgaatgtgtc gatttgctgc aacaggttgt acatgatgtt gacctgcaga 2820 agctgcctgt aagatttgct atggatagag ctggccttgt tggtgcagat ggtccaacac 2880 attgtggggc tttcgatgtc actttcatgg catgcctccc caacatggtc gtaatggctc 2940 cttctgatga ggctgagctt tttcatatgg ttgcc。

38、acagc tgcagccata gatgaccgtc 3000 ctagctgttt tcgttacccg agaggaaatg ggatcggagt tcagttgccg ccagggaaca 3060 aaggtgttcc tcttgaggtg actttcgatc aaatatgtgc atattcctat tcgtaaagaa 3120 acaaagacta aatgaaacat accaacaact taatccaaaa tgcgtacaat gtccttacag 3180 atcggcaaag gtagggtact gatagaagga gaaagagtgg cactattagg。

39、 ttatggatct 3240 gcagttcaaa gctgcttagc agccgcctcg ttattggaat cctacggctt acagctgact 3300 gttgcggacg cacgattttg taaaccattg gatcactccc tcatccggga gctggcaaaa 3360 tcacatgaag ttctgatcac agtcgaagaa ggatcgatcg gtggcttcgg ttctcatgtg 3420 gcacagttcc tagctcttga tggtcttctt gatggcaaag taaaggtatg cgaatccaaa 3480。

40、 atcgcagact tgaatgtcca taattggaag ctgatataac cgtagaacaa tttgtttctt 3540 tgcattaata tttttcccca atttgcagtg gaggccagtg gttcttcccg atcgatacat 3600 cgaccatggc tcacccgccg accagttggc cgaagctggt ctgacaccat cgcacattgc 3660 agcaacagtg ttcaatgtgc ttggacaaaa aagagaggct cttgggatca tgtcgtcgag 3720 aaactgaaga aatt。

41、cttcag ctaaactttc attttatgta caaaaatttt catttcaaat 3780 gaatggtagt tagtttaaac atatatatgt atatttatga tcaaaattta tatctaaaca 3840 atgatacagt tttaccataa atatttacag ttttcactct tctaacagat gtaaaatact 3900 ggcagaaaga tctttgaggc ctttaatttc aaaattgagc aaataagtcc atttcagaga 3960 序列表 2/4 页 8 CN 111118044 A 8 aa。

42、atagaacc agtccagtcc tgtcattttt gaaagcaaac aatc 4004 2 55 DNA 人工序列 2 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cattatgtct tcaatgctcc tagag 55 3 54 DNA 人工序列 3 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc acaacattat tcctttcacc tttc 54 4 250 DNA 人工序列 4 attatgtctt caatgctcct agagacaaga tattatggga tgttggacat cagtcttacc 60 ctc。

43、ataaaat cttgactggg agaagagata agatgcatac catgaggcaa actaatggat 120 tggccggatt cacgaaacga gctgagagcg aatatgattg ctttgggact ggtcacagtt 180 caaccacaat ctctgctggc ttgggaatgg ctgtgggaag ggatctgaaa ggtgaaagga 240 ataatgttgt 250 5 25 DNA 人工序列 5 tcgcgttaac gctagcatgg atctc 25 6 24 DNA 人工序列 6 gtaacatcag agat。

44、tttgag acac 24 7 26 DNA 人工序列 序列表 3/4 页 9 CN 111118044 A 9 7 tgctcctaga gacaagatat tatggg 26 8 26 DNA 人工序列 8 caacattatt cctttcacct ttcaga 26 9 20 DNA 人工序列 9 ttgcagaccg tatgagcaag 20 10 20 DNA 人工序列 10 atcctccgat ccagacactg 20 序列表 4/4 页 10 CN 111118044 A 10 图1 图2 说明书附图 1/3 页 11 CN 111118044 A 11 图3 说明书附图 2/3 页 12 CN 111118044 A 12 图4 说明书附图 3/3 页 13 CN 111118044 A 13 。