袋鼠、豚鼠与褐家鼠多重PCR检测试剂盒及方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010074289.7 (22)申请日 2020.01.22 (71)申请人 北华大学 地址 132013 吉林省吉林市丰满区滨江东 路3999号北华大学 (72)发明人 李明成段思琪 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 一种袋鼠、 豚鼠与褐家鼠多重PCR检测试剂 盒及方法 (57)摘要 本发明涉及食品检测技术领域， 是一种袋鼠 肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉多重PCR检测试剂盒， 其特 点是，。

2、 它包含： 动物组织线粒体DNA提取体系和鉴 定反应体系(同阳性对照反应体系、 阴性对照液 反应体系)。 鉴定反应总体系为50L， 其中含有 反应缓冲液5L， dNTP2-5L， MgCl23L， Taq DNA聚合酶1-5L， 袋鼠引物2.25L、 豚鼠引物3 L和褐家鼠引物2L， 待检样本DNA2-6L， 余 为双蒸馏水； 袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉多重PCR 鉴定方法是利用细胞色素b具有的种属特异性设 计三种特异寡核苷酸引物、 确定反应程序和结果 判定等步骤， 能够同时区别三种鼠肉的特异性； 具有快速、 检测结果可靠等优点。 权利要求书2页 说明书6页 附图2页 CN 111118176。

3、 A 2020.05.08 CN 111118176 A 1.一种袋鼠、 豚鼠与褐家鼠多重PCR检测试剂盒， 其特征是， 它包含： (1)线粒体DNA提取体系 P1溶液50mL， P2溶液50mL， P3溶液20mL,P4溶液50mL， P5溶液50mL， P6溶液100mL； (2)袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉阳性对照品 紫外灯下切下袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉特异性DNA片段， 进行凝胶回收； 测定其浓度， 转化大肠杆菌后涂板过夜培养； 蓝白筛选后转入LB液体培养基于37恒温气浴振荡器中培 养过夜； 质粒小提， 测定其DNA浓度。 选取浓度超过100ng/ L的样本交由生工生物工程(上 海)股。

4、份有限公司测序分析。 分析测序结果， 并将提取的质粒经PCR鉴定后稀释一定浓度作 为试剂盒的阳性对照品。 (3)多重PCR反应体系 鉴定反应体系(1管)3mL； 三重阳性对照反应体系(1管)1mL； 灭菌蒸馏水1管， 1mL。 (a)鉴定反应体系： 总体系为50 L， 其中含有反应缓冲液(10)5 L， dNTP(2.5mmolL -1)2-5 L， MgCl2(2.5mmolL-1)3 L， Taq DNA聚合酶1-5 L， 袋鼠引物(10 molL-1)2.25 L、 豚鼠引物(10 molL-1)3 L和褐家鼠引物(10 molL-1)2 L， 待检样本DNA(50ngL-1)2-6 L。

5、， 余为双蒸馏水； (b)阳性对照反应体系： 在鉴定反应体系管中吸取44 L， 袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉阳 性质粒各2 L。 (c)阴性对照液反应体系： 在鉴定反应体系管中吸取44 L， 灭菌双蒸水6 L。 2.一种袋鼠、 豚鼠与褐家鼠多重PCR鉴定方法， 其特征是， 它包含下述步骤： (1)袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉三对线粒体DNA特异寡核苷酸引物 在GenBank中下载种属基因序列， 再应用NCBI Primer-BLAST在线引物设计软件设计， 具体引物序列如下： 引物1(袋鼠Macropus， GenBank:EF368023.1， 扩增长度186bp) Forward primer。

6、： 5 AACCGTCATAGCAACAG 3 Reverse primer： 5 AAGTGGAAGGCGAAA 3 引物2(豚鼠Cavia， GenBank:DQ017044.1， 扩增长度219bp) Forward primer： 5 CTACGCAATCCTCCGCTCTA3 Reverse primer： 5 ATGGTGATGTAGGGGTGCTC3 引物3(褐家鼠Rattus norvegicus， GenBank:LC147011.1， 扩增长度572bp) Forward primer： 5 TGTGGGACGAGGACTA3 Reverse primer： 5 GTTTG。

7、TTGGGAATGGA3 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 (2)多重PCR反应条件 分别将鉴定反应体系、 阳性对照反应体系和阴性对照反应体系的总体系50 L加入反应 管中， 置于PCR反应仪中按下列程序进行:94预变性5min， 9430s， 退火5830s， 72 45s， 30个循环， 72延伸7min,4； (3)结果判定 反应产物使用1.5琼脂糖凝胶， 在DYY-型水平电泳仪上电泳， 85mV电泳1h， 分子量 100bp的DNA Marker作参照， 凝胶成像分析系统观察和分析得出结果。 凝胶电泳图谱中， 袋 权利要求书 1/2 页 2 CN 111118176 A 2 。

8、鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉在100-600bp处， 在与阳性对照品袋鼠肉(186bp)、 豚鼠肉(219bp)、 褐家鼠肉(572bp)凝胶电泳图谱相应位置上出现DNA条带， 空白对照无条带， 判定为含有相 应肉类成分。 3.如权利要求1所述的袋鼠、 豚鼠与褐家鼠多重PCR检测试剂盒或权利要求2所述的袋 鼠、 豚鼠与褐家鼠多重PCR鉴定方法， 其特征是， 所述方法或试剂盒中的袋鼠肉包含进口超 市购买袋鼠肉和澳大利亚邮寄袋鼠肉； 豚鼠肉均为人工养殖豚鼠。 4.如权利要求2所述的袋鼠、 豚鼠与褐家鼠多重PCR鉴定方法， 其特征是， 结果鉴定是利 用比较样品PCR扩增片段DNA大小与DNA标准分子量的。

9、相同， 根据出现判定标准完全一致对 袋鼠、 豚鼠与褐家鼠样品进行真伪鉴定。 5.权利要求1所述的袋鼠、 豚鼠与褐家鼠多重PCR检测试剂盒或权利要求2所述的袋鼠、 豚鼠与褐家鼠多重PCR鉴定方法在袋鼠、 豚鼠与褐家鼠样品的真伪鉴定中的应用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111118176 A 3 一种袋鼠、 豚鼠与褐家鼠多重PCR检测试剂盒及方法 技术领域 0001 本发明涉及多重PCR技术在肉制品检测领域的应用， 更具体地说， 是一种袋鼠、 豚 鼠与褐家鼠DNA快速鉴定试剂盒及检测方法。 背景技术 0002 人类很早就以鼠肉为食， 唐朝时期， 岭南獠民喜飨蜜唧，“即鼠胎未瞬， 通身赤蠕 。

10、者” ， 北宋苏轼在岭南及海南岛也吃过鼠肉， 有诗云：“朝盘见蜜唧， 夜枕闻鸺鹠。 ” 在中国部 分地区存在食用鼠肉现象， 多为豚鼠、 竹鼠、 袋鼠。 而褐家鼠是坚决不允许出现在人类餐桌 上的。 2013年中国江苏出现特大褐家鼠肉假冒羊肉案件， 不法商贩为节约成本购入未经检 验检疫的褐家鼠肉， 利用明胶、 胭脂红等添加剂将其伪造成牛、 羊肉， 以肉卷、 肉串、 肉丸、 火 腿肠等形式销售至各地农贸市场。 对于鼠肉食用者来说， 鼠肉的来源以及安全性十分重要， 食用受毒药污染的鼠肉有可能致命。 0003 袋鼠是澳大利亚最具特色的肉类食材， 食用袋鼠的习俗大约可以追溯到4万年前 的澳洲土著。 袋鼠肉。

11、营养价值高， 有丰富的高质量蛋白， 低脂肪， 低饱和脂肪酸， 并含有对心 脏有利的多元不饱和脂肪酸(omega-3)， 另外袋鼠肉富含铁、 锌、 维生素B6和维生素B12。 不 含有胆固醇， 不含抗生素和化学物质， 食用不仅对身体不会有副作用， 还能增强体质。 据统 计， 2017年澳大利亚袋鼠数量即已超过5000万只， 是澳大利亚人口总数的两倍多。 澳大利亚 政府希望可以通过食用袋鼠肉减少袋鼠的数量， 可是每年袋鼠繁殖的速度远超于宰割速 度； 一些民众和学者呼吁， 建议大家多吃袋鼠肉， 并把目光投向了中国。 早在2016年5月10 日， 首批袋鼠肉样品就被送到中国以供 “试吃” 。 因为袋鼠。

12、肉价格便宜， 其纹理看起来和普通 的牛肉、 猪肉没有区别， 很多餐馆也盯上了这种新鲜又廉价的肉类， 即用袋鼠肉制成的 “牛 排” 。 0004 豚鼠肉是一种高蛋白， 低脂肪， 微量元素含量丰富的肉类。 豚鼠鲜肉中蛋白质含量 虽不是很高， 但组成蛋白质的主要氨基酸种类齐全， 人体容易缺乏的蛋氨酸、 胧氨酸、 苯丙 氨酸、 酪氨酸， 在豚鼠肉中的含量较高， 组成人体重要的氨基酸-赖氨酸在豚鼠肉中的含量 较高。 天冬氨酸和谷氨酸两种鲜味氨基酸占总氨基酸的比例为29， 相比其它肉类很突出， 鲜味氨基酸含量越高， 味道越鲜美； 脂肪含量比猪、 鸡、 乌龙鲫和羊均低， 在提高摄入蛋白质 的同时， 降低了脂。

13、肪的摄入； 豚鼠微量元素丰富特别是钙、 铁等， 还含有微量的硒元素。 从以 上几个方面来看,豚鼠肉品质较好。 豚鼠肉制成肉食品后， 口感特别， 不同于一般家禽、 家 畜。 并且营养高， 脂肪低， 微量元素丰富， 豚鼠肉作为一种特殊风味肉食品,有一定的开发价 值和开发前景。 0005 目前肉制品市场上褐家鼠肉作为掺假肉事件频发。 褐家鼠为中国广大农区、 城镇 和工矿企业的最主要害鼠。 部分野外褐家鼠是食用鼠药毒死的， 食用者存在中毒的风险； 此 外， 褐家鼠易传播流行性出血热、 鼠疫、 恙虫病、 钩端螺旋体病、 血吸虫病、 弓形虫病、 斑疹伤 寒、 Q热、 蜱媒回归热等多种疾病， 因此褐家鼠肉是。

14、绝不允许被摆上餐桌的。 随着食用袋鼠 肉、 豚鼠肉文化日益普及， 有必要建立一种方法鉴别可食用的袋鼠肉、 豚鼠肉与不可食用的 说明书 1/6 页 4 CN 111118176 A 4 褐家鼠肉。 0006 国内外常用的检测掺假肉的方法有感官鉴定技术、 光谱色谱分析、 酶联免疫吸附 技术、 常规PCR， 实时荧光定量PCR和数字PCR等。 感官鉴定技术需要检验人员对各物种的细 微形态有较强的认识； 近红外光谱主要对肉类中的含氢基团进行检测， 其缺点是需大量样 品建立与分析模型， 且检测精度不高； 色谱分析仅适用于新鲜和冷冻肉类； 在肉类加工过程 中， 蛋白质易变性而使酶联免疫反应失效， 所以酶联。

15、免疫吸附技术只适合于未加工过的肉 制品； 电子鼻和电子舌在硬件结构和识别算法上仍存在仿生性差的缺点； 目前对于动物源 成分检测的国家标准和行业标准主要采用PCR法。 实时荧光定量PCR和数字PCR能够同时进 行特异性识别和量化， 提供更精确和可靠的定量数据。 但应用的仪器、 试剂价格昂贵， 且耗 时长， 对检测技术人员要求高， 操作难度大， 不适宜快速批量检测使用。 0007 线粒体DNA基因组在动物物种鉴定方面比核基因以及核糖体12S和16S基因更具优 势， 线粒体DNA作为唯一的核外遗传信息载体， 具有独立复制、 进化速度快、 不受核基因影响 等特点， 被广泛用于动物的种属鉴别研究中。 在。

16、线粒体13个编码蛋白的基因中， Cyt b基因 拥有合适的进化速率和长度， 在Gene Bank数据库中拥有最多的基因数据， 在动物属间、 种 间存在多样性， 被广泛用于物种间的鉴别工作。 因此， 本研究选择各物种Cyt b基因设计特 异性引物， 建立多重PCR反应体系， 完成对袋鼠、 豚鼠、 褐家鼠三个物种的特异性鉴别。 0008 利用多重PCR技术， 在同一个PCR反应管中加入多对特异性引物， 同时对多个目的 基因进行扩增分析， 节省检测时间和检测成本， 为临床或食品安全检测提供更多更准确的 信息， 具有高效性、 系统性、 经济简便性等优点。 发明内容 0009 本发明的目的是在建立袋鼠肉。

17、、 豚鼠肉与褐家鼠肉线粒体DNA的基因组文库基础 上， 采用生物信息学技术对三种鼠肉线粒体DNA基因组进行筛选， 设计可有效地区分的特异 性DNA序列， 利用多重PCR技术在一个反应体系中加入三对特异性引物， 针对三个模板可扩 增三个具有差异的目的片段。 提供一种能够准确鉴别三种鼠肉的特异性分子标志， 使用方 便的袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉多重PCR检测试剂盒， 具有节省时间、 降低成本和提高效率 的特点， 并提供简便、 快速、 检测结果可靠的鉴定方法。 0010 本发明的目的是由以下技术方案来实现的： 0011 袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉多重PCR检测试剂盒， 它包含： 0012 1.线粒体。

18、DNA提取体系 0013 P1溶液50mL， P2溶液50mL， P3溶液20mL,P4溶液50mL， P5溶液50mL， P6溶液100mL； 0014 2.袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉三对线粒体DNA特异寡核苷酸引物 0015 在GenBank中下载种属基因序列， 再应用NCBI Primer-BLAST在线引物设计软件设 计， 具体引物序列如下： 0016 引物1(袋鼠Macropus， GenBank:EF368023.1， 扩增长度186bp) 0017 Forward primer： 5 AACCGTCATAGCAACAG 3 0018 Reverse primer： 5 AAGTG。

19、GAAGGCGAAA 3 0019 引物2(豚鼠Cavia， GenBank:DQ017044.1， 扩增长度219bp) 0020 Forward primer： 5 CTACGCAATCCTCCGCTCTA3 说明书 2/6 页 5 CN 111118176 A 5 0021 Reverse primer： 5 ATGGTGATGTAGGGGTGCTC3 0022 引物3(褐家鼠Rattus norvegicus， GenBank:LC147011.1， 扩增长度572bp) 0023 Forward primer： 5 TGTGGGACGAGGACTA3 0024 Reverse pri。

20、mer： 5 GTTTGTTGGGAATGGA3 0025 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 0026 3.袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉阳性对照品 0027 紫外灯下切下袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉特异性DNA片段， 进行凝胶回收； 测定其 浓度， 转化大肠杆菌后涂板过夜培养； 蓝白筛选后转入LB液体培养基于37恒温气浴振荡 器中培养过夜； 质粒小提， 测定其DNA浓度。 选取浓度超过100ng/ L的样本交由生工生物工 程(上海)股份有限公司测序分析。 分析测序结果， 并将提取的质粒经PCR鉴定后稀释一定浓 度作为试剂盒的阳性对照品。 0028 4.多重PCR反应体系 0029 鉴定反。

21、应体系(1管)3mL； 三重阳性对照反应体系(1管)1mL； 灭菌蒸馏水1管， 1mL。 0030 (a)鉴定反应体系： 总体系为50L， 其中含有反应缓冲液(10)5L， dNTP (2.5mmolL-1)2-5 L， MgCl2(2.5mmolL-1)3 L， Taq DNA聚合酶1-5 L， 袋鼠引物(10 mol L-1)2.25 L、 豚鼠引物(10 molL-1)3 L和褐家鼠引物(10 molL-1)2 L， 待检样本DNA (50ngL-1)2-6 L， 余为双蒸馏水； 0031 (b)阳性对照反应体系： 在鉴定反应体系管中吸取44 L， 袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠 肉阳性质粒各。

22、2 L。 0032 (c)阴性对照液反应体系： 在鉴定反应体系管中吸取44 L， 灭菌双蒸水6 L。 0033 5.多重PCR反应条件 0034 分别将鉴定反应体系、 阳性对照反应体系和阴性对照反应体系的总体系50 L加入 反应管中， 置于PCR反应仪中按下列程序进行:94预变性5min， 9430s， 退火5830s， 72 45s， 30个循环， 72延伸7min,4； 0035 6.结果判定 0036 反应产物使用1.5琼脂糖凝胶， 在DYY-型水平电泳仪上电泳， 85mV电泳1h， 分 子量100bp的DNA Marker作参照， 凝胶成像分析系统观察和分析得出结果。 凝胶电泳图谱 中。

23、， 袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉在100-600bp处， 在与阳性对照品袋鼠肉(186bp)、 豚鼠肉 (219bp)、 褐家鼠肉(572bp)凝胶电泳图谱相应位置上出现DNA条带， 空白对照无条带， 判定 为含有相应肉类成分。 0037 袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉多重PCR检测试剂盒快速鉴定方法， 它包含以下步骤： 0038 1.供试品DNA提取 0039 (1)取肉样剪碎约0.05g， 置离心管中。 加P1溶液500 L， P2溶液30 L， P3溶液15 L混 匀， 置于56水浴振荡1h。 0040 (2)加入P4溶液500 L， 混匀5-10min后， 离心10000r/min5min。。

24、 0041 (3)取上清液加入等体积P5溶液， -20放置1h。 0042 (4)取出离心10000r/min5min， 弃上清液。 0043 (5)沉淀加入P6溶液(70冰冻乙醇溶液)500 L， 混匀后， 离心11000r/min5min， 弃上清(重复1次)。 说明书 3/6 页 6 CN 111118176 A 6 0044 (6)沉淀后室温晾干， 分别加入双蒸水100 L溶解DNA， 混匀， 作为供试品DNA溶液。 0045 2.PCR反应的建立 0046 (1)鉴定反应体系： 总体系为50L， 其中含有反应缓冲液(10)5L， dNTP (2.5mmolL-1)2-5 L， MgC。

25、l2(2.5mmolL-1)3 L， Taq DNA聚合酶1-5 L， 袋鼠引物(10 mol L-1)2.25 L、 豚鼠引物(10 molL-1)3 L和褐家鼠引物(10 molL-1)2 L， 待检样本DNA (50ngL-1)2-6 L， 余为双蒸馏水； 0047 (2)阳性对照反应体系： 在鉴定反应体系管中吸取44 L， 袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠 肉阳性质粒各2 L。 0048 (3)阴性对照液反应体系： 在鉴定反应体系管中吸取44 L， 灭菌双蒸水6 L。 0049 将反应管置PCR仪。 PCR反应参数： 94预变性5min， 9430s， 退火5830s， 72 45s， 30个。

26、循环， 72延伸7min， 4。 0050 3.电泳检测 0051 琼脂糖凝胶电泳法， 胶浓度为1.5， 胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed。 供试品、 阳 性对照和空白对照PCR反应液的上样量分别为10-15 L， DNA分子量标记上样量为4 L(0.5 g/ l)。 电泳结束后， 取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。 供试品凝胶电泳图谱 中， 在与阳性对照凝胶电泳图谱相应的位置上， 应有一条DNA条带， 阴性对照无条带。 0052 4.结果判定 0053 反应产物使用1.5琼脂糖凝胶， 在DYY-型水平电泳仪上电泳， 85mV电泳1h， 分 子量100bp的DNA Marker作参照。

27、， 凝胶成像分析系统观察和分析得出结果。 凝胶电泳图谱 中， 袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉在100-600bp处， 在与阳性对照品袋鼠肉(186bp)、 豚鼠肉 (219bp)、 褐家鼠肉(572bp)凝胶电泳图谱相应位置上出现DNA条带， 阴性对照无条带， 判定 为含有相应肉类成分。 参照图1。 0054 本发明的袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉多重PCR检测试剂盒是利用袋鼠、 豚鼠与褐家 鼠细胞色素b具有的种属特异性， 能够准确同时区别袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉的特异性； 鉴定方法具有简便、 快速、 检测结果可靠等优点。 附图说明 0055 图1为试剂盒检测袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉引物特异性结果。

28、示意图。 0056 其中:M:标准分子量(100bp ladder marker)； 1： 阳性对照品(袋鼠肉+豚鼠肉+褐 家鼠肉)； 2： 养殖豚鼠肉结果； 3： 进口超市购买袋鼠肉结果； 4： 澳大利亚邮寄袋鼠肉结果5： 褐家鼠肉结果； 6： 牛肉结果； 7： 羊肉结果； 8： 猪肉结果； 9： 鸡肉结果； 10： 鸭肉结果； 11： 阴性 对照品。 0057 图2实施例一检测鲜袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉鉴定结果示意图。 0058 其中:M： 标准分子量(100bp ladder marker)； 1： 阳性对照品(袋鼠肉+豚鼠肉+褐 家鼠肉)； 2： 养殖豚鼠肉结果； 3： 进口超市购买。

29、袋鼠肉结果； 4： 澳大利亚邮寄袋鼠肉结果； 5： 褐家鼠肉结果； 6： 褐家鼠肉+进口超市购买袋鼠肉+豚鼠肉结果； 7： 褐家鼠肉+澳大利亚邮寄 袋鼠肉+豚鼠肉结果； 8： 褐家鼠肉+袋鼠肉结果； 9： 褐家鼠肉+豚鼠肉结果； 10： 袋鼠肉+豚鼠 肉结果； 11： 牛肉结果； 12： 羊肉结果； 13： 阴性对照品。 0059 图3实施例二检测烘培后的袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉制品鉴定结果示意图。 说明书 4/6 页 7 CN 111118176 A 7 0060 其中:M： 标准分子量(100bp ladder marker)； 1： 褐家鼠肉+袋鼠肉结果； 2： 褐家鼠 肉+豚鼠肉结果。

30、； 3： 袋鼠肉+豚鼠肉结果； 4： 褐家鼠肉+澳大利亚邮寄袋鼠肉+豚鼠肉结果； 5： 阳性对照品(袋鼠肉+豚鼠肉+褐家鼠肉)； 6： 牛肉结果； 7： 羊肉结果； 8： 褐家鼠肉结果； 9： 澳 大利亚邮寄袋鼠肉结果； 10： 进口超市购买袋鼠肉结果； 11： 养殖豚鼠肉结果； 12： 阴性对照 品。 具体实施方式： 0061 下面利用实施例一对本发明作进一步描述。 0062 材料为进口超市购买袋鼠肉、 澳大利亚邮寄袋鼠肉、 养殖豚鼠肉、 野生褐家鼠肉 (长春市食品药品检验中心提供)、 市售牛肉、 市售羊肉(市售样本均为吉林市大润发超市购 买)。 0063 1.供试品DNA提取 0064 (。

31、1)取肉样剪碎约0.05g， 置离心管中。 加P1溶液500 L， P2溶液30 L， P3溶液15 L混 匀， 置于56水浴振荡1h。 0065 (2)加入P4溶液500 L， 混匀5-10min后， 离心10000r/min5min。 0066 (3)取上清液加入等体积P5溶液， -20放置1h。 0067 (4)取出离心10000r/min5min， 弃上清液。 0068 (5)沉淀加入P6溶液(70冰冻乙醇溶液)500 L， 混匀后， 离心11000r/min5min， 弃上清(重复1次)。 0069 (6)沉淀后室温晾干， 分别加入双蒸水100 L溶解DNA， 混匀， 作为供试品DN。

32、A溶液。 0070 2.PCR反应的建立 0071 (1)鉴定反应体系： 总体系为50L， 其中含有反应缓冲液(10)5L， dNTP (2.5mmolL-1)2-5 L， MgCl2(2.5mmolL-1)3 L， Taq DNA聚合酶1-5 L， 袋鼠引物(10 mol L-1)2.25 L、 豚鼠引物(10 molL-1)3 L和褐家鼠引物(10 molL-1)2 L， 待检样本DNA (50ngL-1)2-6 L， 余为双蒸馏水； 0072 (2)阳性对照反应体系： 在鉴定反应体系管中吸取44 L， 袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠 肉阳性质粒各2 L。 0073 (3)阴性对照液反应体系： 。

33、在鉴定反应体系管中吸取44 L， 灭菌双蒸水6 L。 0074 将反应管置PCR仪。 PCR反应参数： 94预变性5min， 9430s， 退火5830s， 72 45s， 30个循环， 72延伸7min， 4。 0075 3.电泳检测 0076 琼脂糖凝胶电泳法， 胶浓度为1.5， 胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed。 供试品、 阳 性对照和空白对照PCR反应液的上样量分别为10-15 L， DNA分子量标记上样量为4 L(0.5 g/ l)。 电泳结束后， 取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。 供试品凝胶电泳图谱 中， 在与阳性对照凝胶电泳图谱相应的位置上， 应有一条DNA条带， 阴。

34、性对照无条带。 0077 4.结果判定 0078 反应产物使用1.5琼脂糖凝胶， 在DYY-型水平电泳仪上电泳， 85mV电泳1h， 分 子量100bp的DNA Marker作参照， 凝胶成像分析系统观察和分析得出结果。 凝胶电泳图谱 中， 袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉在100-600bp处， 在与阳性对照品袋鼠肉(186bp)、 豚鼠肉 说明书 5/6 页 8 CN 111118176 A 8 (219bp)、 褐家鼠肉(572bp)凝胶电泳图谱相应位置上出现DNA条带， 阴性对照无条带， 判定 为含有相应肉类成分。 参照图2。 0079 实施例二 对烘培后的袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉制品进行。

35、鉴定 0080 材料为经100烤箱烘焙30min后的进口超市购买袋鼠肉、 澳大利亚邮寄袋鼠肉、 养殖豚鼠肉、 野生褐家鼠肉(长春市食品药品检验中心提供)、 市售牛肉、 市售羊肉(市售样 本均为吉林市大润发超市购买)。 0081 1.供试品DNA提取 0082 (7)取肉样剪碎约0.05g， 置离心管中。 加P1溶液500 L， P2溶液30 L， P3溶液15 L混 匀， 置于56水浴振荡1h。 0083 (8)加入P4溶液500 L， 混匀5-10min后， 离心10000r/min5min。 0084 (9)取上清液加入等体积P5溶液， -20放置1h。 0085 (10)取出离心1000。

36、0r/min5min， 弃上清液。 0086 (11)沉淀加入P6溶液(70冰冻乙醇溶液)500 L， 混匀后， 离心11000r/min 5min， 弃上清(重复1次)。 0087 (12)沉淀后室温晾干， 分别加入双蒸水100 L溶解DNA， 混匀， 作为供试品DNA溶液。 0088 2.PCR反应的建立 0089 (4)鉴定反应体系： 总体系为50L， 其中含有反应缓冲液(10)5L， dNTP (2.5mmolL-1)2-5 L， MgCl2(2.5mmolL-1)3 L， Taq DNA聚合酶1-5 L， 袋鼠引物(10 mol L-1)2.25 L、 豚鼠引物(10 molL-1)。

37、3 L和褐家鼠引物(10 molL-1)2 L， 待检样本DNA (50ngL-1)2-6 L， 余为双蒸馏水； 0090 (5)阳性对照反应体系： 在鉴定反应体系管中吸取44 L， 袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠 肉阳性质粒各2 L。 0091 (6)阴性对照液反应体系： 在鉴定反应体系管中吸取44 L， 灭菌双蒸水6 L。 0092 将反应管置PCR仪。 PCR反应参数： 94预变性5min， 9430s， 退火5830s， 72 45s， 30个循环， 72延伸7min， 4。 0093 3.电泳检测 0094 琼脂糖凝胶电泳法， 胶浓度为1.5， 胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed。 供试品。

38、、 阳 性对照和空白对照PCR反应液的上样量分别为10-15 L， DNA分子量标记上样量为4 L(0.5 g/ l)。 电泳结束后， 取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。 供试品凝胶电泳图谱 中， 在与阳性对照凝胶电泳图谱相应的位置上， 应有一条DNA条带， 阴性对照无条带。 0095 4.结果判定 0096 反应产物使用1.5琼脂糖凝胶， 在DYY-型水平电泳仪上电泳， 85mV电泳1h， 分 子量100bp的DNA Marker作参照， 凝胶成像分析系统观察和分析得出结果。 凝胶电泳图谱 中， 袋鼠肉、 豚鼠肉与褐家鼠肉在100-600bp处， 在与阳性对照品袋鼠肉(186bp)、 豚鼠肉 (219bp)、 褐家鼠肉(572bp)凝胶电泳图谱相应位置上出现DNA条带， 阴性对照无条带， 判定 为含有相应肉类成分。 参照图3。 说明书 6/6 页 9 CN 111118176 A 9 图1 图2 说明书附图 1/2 页 10 CN 111118176 A 10 图3 说明书附图 2/2 页 11 CN 111118176 A 11 。