听神经病谱系障碍相关的OTOF基因突变检测试剂盒.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010007507.5 (22)申请日 2020.01.04 (71)申请人 中国人民解放军第四军医大学 地址 710032 陕西省西安市新城区长乐西 路169号 (72)发明人 查定军王淑娟陈俊梁鹏飞 李琼李薇安晓刚 (74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任 公司 61200 代理人 范巍 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 听神经病谱系障碍相关的OTOF基因突变检 测试剂盒 (。

2、57)摘要 本发明公开了一种听神经病谱系障碍相关 的OTOF基因突变检测试剂盒， 试剂盒包括从待测 样品中提取DNA的试剂、 用于扩增样本DNA的PCR 反应试剂、 对PCR扩增产物进行测序的试剂； 所述 扩增样本DNA的PCR反应试剂包括PCR引物。 使用 本发明所述试剂盒检测患者中是否存在OTOF基 因c.4236delC缺失突变， 从而诊断听神经病谱系 障碍发生的原因。 该试剂盒将有利于临床上开展 听神经病谱系障碍患者的OTOF突变筛查工作， 为 听神经病谱系障碍患者的诊断提供依据。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图2页 CN 111139293 A 2020.05.12 C。

3、N 111139293 A 1.一种用于检测OTOF基因c.4236delC突变的试剂盒， 其特征在于： 该试剂盒包括用于 扩增DNA片段的PCR反应试剂， 所述PCR反应试剂包括PCR引物， 该PCR引物扩增的目标片段包 含OTOF基因CDS区第4236位所对应的碱基。 2.根据权利要求1所述一种用于检测OTOF基因c.4236delC突变的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒还包括用于从待测个体中提取PCR扩增所需的模板DNA的试剂。 3.根据权利要求1所述一种用于检测OTOF基因c.4236delC突变的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒还包括用于对PCR扩增的目标片段进行测序的试剂。 4。

4、.根据权利要求1所述一种用于检测OTOF基因c.4236delC突变的试剂盒， 其特征在于： 所述PCR引物选自以下三对引物P1、 P2、 P3中的一对： 引物对P1的序列为： OTOF-F-1:5 -AGACCCTTCTAGGGTGTGTGG-3 ； OTOF-R-1:5 -CTGCTGAGTCATGGGAGAGTC-3 ； 引物对P2的序列为： OTOF-F-2:5 -CTTCCTGCTCTGCTCATTTCT-3 ； OTOF-R-2:5 -GTGGCATTCAAAATAGCTAACA-3 ； 引物对P3的序列为： OTOF-F-3:5 -CTCTGCTCATTTCTGCTCCAC-3 。

5、； OTOF-R-3:5 -GGGTCAGGGTGTAGGTTTGC-3 。 5.一种检测OTOF基因c.4236delC突变的方法， 其特征在于： 包括以下步骤： 1)采集待测个体的血液、 体液或组织， 然后提取DNA； 2)以步骤1)提取的DNA为模板， 以PCR引物进行PCR反应， 得到PCR反应产物； 从PCR反应 产物中分离PCR反应扩增的目标片段， 并根据该目标片段中对应于OTOF基因CDS区第4236位 的碱基进行分型鉴定。 6.根据权利要求5所述一种检测OTOF基因c.4236delC突变的方法， 其特征在于： 所述分 型鉴定采用对所述目标片段进行直接测序的方法， 通过将测序结。

6、果与参考序列进行比对， 确定待测个体对应于OTOF基因CDS区第4236位的基因型或等位基因类型。 7.根据权利要求5所述一种检测OTOF基因c.4236delC突变的方法， 其特征在于： 根据比 对确定的基因型包括野生纯合型W/W、 突变杂合型W/D或突变纯合型D/D， 其中D表示缺失。 8.一种如权利要求1所述的试剂盒在听神经病谱系障碍病因学分析中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111139293 A 2 听神经病谱系障碍相关的OTOF基因突变检测试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及基因检测领域， 具体涉及在诊断听神经病/听神经病谱系障碍中应用 的OTOF基因突变c.4236。

7、delC(p.E1414Sfs*108)分型检测试剂盒。 背景技术 0002 听神经病(auditory neuropathy,AN)是耳蜗内毛细胞、 听神经突触或听神经功能 不良所导致的听力障碍。 它是导致婴幼儿和青少年语言交流障碍的重要疾病， 在每年新发 的听力损失患儿中约占8， 其发病与遗传因素密切相关。 0003 听神经病依据发病部位分为两型： 型听神经病为突触后型； 型听神经病为突触 及突触前型。 人工耳蜗植入对于双耳重度感音神经性耳聋患者是最好的治疗选择， 但仅对 型听神经病有效。 听神经病诊断依靠听力学及影像学检查， 但依据听力学检查结果无法 进行分型， 目前致病基因型是分型的主。

8、要依据。 与型听神经病谱系障碍相关的基因主要 是OTOF基因。 0004 OTOF(otoferlin)基因是第一个克隆的与非综合征型听神经病相关的基因， 位于 2p23的DFNB9基因座内。 OTOF基因DNA序列全长101496bp， 共有4种长短不同的转录本变异 体。 其中最长的亚型包含48个外显子， 编码氨基酸长度为1997aa的蛋白质Otoferlin。 Yasunaga等对多个常染色体隐性非综合征型语前聋家系进行候选基因研究， 发现三个家系 共21名患病成员的OTOF基因都在第18个外显子发生无义突变， 提前生成终止密码子并形成 截短蛋白， 致使其编码的Otoferlin蛋白不完整。

9、。 在内耳中， Otoferlin蛋白在成熟的耳蜗中 只表达于内毛细胞， 且大多表达于内毛细胞基底外侧部。 该蛋白是一种钙离子感受器， 基因 突变可导致内毛细胞活动区囊泡的胞吐作用被抑制， 神经递质释放减少， 进而引起神经冲 动的减少； 此外， 神经递质可能对突触后神经纤维有营养作用， 如营养作用的减弱可导致突 触后膜产生退行性病变， 或许可以解释听神经病谱系障碍(ANSD)患者渐进性听力损失的特 点。 0005 根据文献报道OTOF基因突变在世界范围内广泛存在于SNHL人群中， 同时也是ANSD 患者的主要致病突变。 OTOF基因是目前研究最为广泛和深入的ANSD相关基因。 根据文献统 计汉。

10、族ANSD患者中约5.5的散发病例可将病因归于OTOF基因的突变。 不同地区和种族 ANSD人群的突变谱还不完善， 目前已知的OTOF基因突变类型有100余种， 绝大多数为无义突 变、 截短突变或移码突变。 0006 综合国内外文献报道的治疗经验， 相比传统助听器和药物治疗， 人工耳蜗植入的 干预效果更为确切， 但差异很大， 具体到个体患者的选择仍需谨慎。 以往研究认为可参考以 下几个方面预测植入后的效果： 1、 术前MRI如发现中枢系统病变， 可能预示术后效果不佳， 尤其是有蜗神经缺失或形态异常时； 2、 基因突变类型与术后疗效的关系还不确定， 现有研 究结果可作为参考， 通常认为OTOF突。

11、变引起突触前病变导致的ANSD术后效果较好， 推测是 人工耳蜗提供的直接电刺激绕过了病变部位， 而轴突损伤导致突触后病变和涉及听神经全 程的病变(如遗传性共济失调症和耳聋-肌张力不全症-视神经元病)引起的ANSD术后效果 说明书 1/9 页 3 CN 111139293 A 3 较差。 所以明确听神经病/听神经病谱系障碍致病基因， 对患者进行分型并评估人工耳蜗的 植入效果具有重要意义。 目前尚未见到关于OTOF基因突变c.4236delC(p.E1414Sfs*108)的 报道。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种听神经病谱系障碍相关的OTOF基因突变检测试剂盒。 0008 为达到上。

12、述目的， 本发明采用了以下技术方案： 0009 一种用于检测OTOF基因c.4236delC(p.E1414Sfs*108)突变的试剂盒， 该试剂盒包 括用于扩增DNA片段的PCR反应试剂， 所述PCR反应试剂包括PCR引物， 该PCR引物扩增的目标 片段包含人OTOF基因CDS区第4236位(NM_194248.3， chr2:26690093)所对应的碱基。 0010 优选的， 所述试剂盒还包括用于从待测个体中提取PCR扩增所需的模板DNA的试 剂。 0011 优选的， 所述试剂盒还包括用于对PCR扩增的目标片段进行测序的试剂。 0012 优选的， 所述PCR引物选自以下三对引物P1、 P。

13、2、 P3中的一对： 0013 引物对P1的序列为： 0014 OTOF-F-1:5 -AGACCCTTCTAGGGTGTGTGG-3 ； 0015 OTOF-R-1:5 -CTGCTGAGTCATGGGAGAGTC-3 ； 0016 引物对P2的序列为： 0017 OTOF-F-2:5 -CTTCCTGCTCTGCTCATTTCT-3 ； 0018 OTOF-R-2:5 -GTGGCATTCAAAATAGCTAACA-3 ； 0019 引物对P3的序列为： 0020 OTOF-F-3:5 -CTCTGCTCATTTCTGCTCCAC-3 ； 0021 OTOF-R-3:5 -GGGTCAGG。

14、GTGTAGGTTTGC-3 。 0022 利用上述试剂盒检测OTOF基因c.4236delC(p.E1414Sfs*108)突变的方法， 包括以 下步骤： 0023 1)采集待测个体的血液、 体液或组织， 然后提取DNA； 0024 2)以步骤1)提取的DNA为模板， 以上述PCR引物进行PCR反应， 得到PCR反应产物； 从 PCR反应产物中分离PCR反应扩增的目标片段， 并根据该目标片段中对应于人OTOF基因CDS 区第4236位(NM_194248.3， chr2:26690093)的碱基缺失情况进行分型鉴定。 0025 优选的， 所述分型鉴定采用对所述目标片段进行直接测序的方法， 通。

15、过将测序结 果与参考序列(NC_000002.11(26680071.26781566)进行比对， 确定待测个体对应于人 OTOF基因CDS区第4236位(NM_194248.3， chr2:26690093)的基因型或等位基因类型。 0026 优选的， 根据比对确定的基因型包括野生纯合型W/W、 突变杂合型W/D或突变纯合 型D/D， 其中W： 野生型等位基因； D： 缺失。 0027 上述试剂盒在听神经病谱系障碍病因学分析中的应用。 使用该试剂盒并通过检测 来自于待测样本(患者的OTOF基因片段)中对应于人OTOF基因CDS区第4236位(NM_ 194248.3， chr2:266900。

16、93)是否存在c.4236delC(p.E1414Sfs*108)缺失突变， 从而判断该 患者听神经病谱系障碍发生的遗传性原因。 其中， OTOF基因发生c.4236delC(p.E1414Sfs* 108)突变， 使氨基酸序列自649位发生移码改变， 并使氨基酸的编码提前终止于第660位的 说明书 2/9 页 4 CN 111139293 A 4 氨基酸(p.E1414Sfs*108)， 形成Otoferlin的截短肽链， 丧失其功能， 不成熟的表达产物诱 导启动体内调节机制， 使变异的mRNA降解。 0028 本发明的有益效果体现在： 0029 本发明所提出的试剂盒可用于快速地检测OTOF。

17、基因特定突变位点， 通过检测来自 患者的DNA样本中是否存在OTOF基因c.4236delC(p.E1414Sfs*108)突变， 可以判断该患者 听神经病谱系障碍发生原因， 进而为临床诊断提供依据。 0030 本发明所提出的试剂盒在用于听神经病谱系障碍的诊断时： 1)本发明将为在听神 经病谱系障碍患者中开展易感基因筛查提供方便确实的方法； 2)通过产前诊断筛查， 明确 胎儿是否携带c.4236delC(p.E1414Sfs*108)突变， 降低聋儿的出生率， 为社会和家庭减轻 负担； 3)将有利于为不同类型听神经病谱系障碍患者确定个体化治疗方案， 避免人工耳蜗 植入无效而造成的不必要的经济损。

18、失。 附图说明 0031 图1为OTOF基因编码区核苷酸与氨基酸的对照(NM_194248.3； NP_919224.1)： 突变 位点位于OTOF基因第4236位碱基， 由于移码突变， 并造成了截短蛋白， 在此用方框圈起来的 是起始的几个发生变异的氨基酸(反向的)。 0032 图2为PCR反应过程示意图： 示出了反应温度和时间， 其中 表示每个循环降低0.5 。 0033 图3为PCR产物电泳定量的琼脂糖凝胶电泳图谱： 示出了定量Marker的片段位置， 扩增的目标序列为381bp。 0034 图4A为OTOF基因测序结果图： 示出了杂合突变序列(患者序列)， 箭头表示缺失的 位置。 003。

19、5 图4B为OTOF基因测序结果图： 示出了野生型序列， 箭头表示缺失的位置。 具体实施方式 0036 下面结合附图和实施例对本发明作详细说明， 以下实施例用于解释本发明， 而非 对本发明保护范围的限制。 0037 本发明通过全外显子二代测序的方法， 从一个近亲家系中查找致病基因位点。 在 对200例非综合征型听神经病谱系障碍患者和100例听力正常且无家族史的对照进行筛查 中， 在一例听神经病谱系障碍患者OTOF的基因中发现c.4236delC(p.E1414Sfs*108)纯合突 变， OTOF基因突变与听神经病谱系障碍表型共分离。 OTOF基因突变相关的听神经病/听神经 病谱系障碍以常染色。

20、体隐性遗传的方式传递。 目前报道的与听神经病/听神经病谱系障碍 相关的突变有117种， 尚无c.4236delC这一缺失突变的报道。 0038 参见图1， 上述突变(c .4236delC)使位于OTOF基因CDS区的第4236位(NM_ 194248.3， chr2:26690093)碱基缺失， 使得氨基酸编码自第1414位发生移码， 在第1521位的 氨基酸密码子变为终止密码子， 突变发生后基因表达产物由正常的1997个氨基酸长度的肽 链变成了1521个氨基酸。 截短的氨基酸肽链启动体内调节机制， 使变异的mRNA降解。 0039 检测上述突变(c.4236delC)可采用多种检测突变的方。

21、法来进行， 例如PCR(聚合酶 链反应)-测序法、 采用标记的OTOF基因DNA探针杂交法、 用限制性片段长度多态性方法或序 说明书 3/9 页 5 CN 111139293 A 5 列特异性引物的方法等。 其中， 采用PCR扩增-直接测序法来检测样本， 包括下述步骤： 0040 1)采集待测个体的样本， 例如血液， 提取基因组DNA； 0041 2)以该DNA为模板， 以针对OTOF基因CDS区第4236位碱基(NM_194248.3， chr2: 26690093)设计的PCR引物进行PCR反应， 得到PCR扩增产物； 0042 3)将得到的PCR扩增产物进行目标片段测序分析， 将测序所得。

22、到的序列与OTOF基 因参考序列(NC_000002.11(26680071.26781566)进行比较， 确定待测个体OTOF基因是否 存在c.4236delC突变； 0043 4)根据以上结果判断待测个体是否为OTOF基因突变c.4236delC导致的听神经病 谱系障碍。 0044 在上述步骤2)中使用的PCR引物可以依据已知的引物核苷酸序列设计： 通常为15 30个碱基， GC含量为4550左右， 在适当的温度下与末端特异性结合。 引物可以利用现 有的计算机程序设计。 0045 上述步骤2)所得到的PCR反应产物若使用杂交探针来检测， 所用的杂交探针可以 是与正常的OTOF核苷酸序列杂交。

23、， 或与突变的核苷酸序列杂交， 或与它们的互补序列杂交 的探针。 这些探针可以用放射性同位素、 发色物质或荧光物质标记， 尤其是可利用等位基因 特异探针。 0046 根据检测方法的不同， 用于检测OTOF基因c.4236delC突变的试剂盒中， 除了包括 PCR反应试剂， 还包括检测PCR扩增产物的试剂， 其具体选自测序检测试剂、 限制性长度多态 性检测试剂、 序列特异性引物检测试剂、 探针杂交检测试剂。 0047 试剂盒容器内装有用以检测OTOF基因c.4236delC突变的试剂成分， 与之同时提供 的还有经政府药物管理机构审核的、 有关药品或生物制品的制造、 使用及销售信息。 对于 PCR。

24、反应试剂， 例如， 可含有扩增引物、 dNTPs、 用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液等。 0048 实例1 0049 通过聋病门诊及资源收集网络收集各种感音神经性耳聋患者， 包括听神经病谱系 障碍患者， 建立资源库。 在患者自愿的前提下， 签署知情同意书后， 留取血样， 并建立门诊病 历资料库， 详细记录患者病情、 家系中的发病情况以及联系方式。 然后， 应用蛋白酶降解的 方法提取基因组DNA， 定量后入库， -20保存， 每份DNA样品均详细对应于登记的患者临床 资料。 然后， 应用引物设计软件Primer5设计引物(扩增目标区域为OTOF基因的第33号外显 子， 参考序列： NC_0。

25、00002.11(26680071.26781566)， 扩增目标片段大小为381bp)， 以基因 组DNA为模板， BIORAD My Cycle热循环仪上进行PCR扩增。 测序引物与PCR扩增引物相同， 正 反向测序， 应用ABI公司3730DNA测序仪。 序列测序结果与GenBank中的序列(NC_000002.11 (26680071.26781566)比较， 确定OTOF c.4236delC突变， 具体如下： 0050 (一)待测血样提取与OTOF基因编码区的PCR扩增 0051 1、 待测对象血样DNA的制备 0052 1.1研究对象 0053 对200例散发听神经病耳聋患者和1。

26、00名无家族史的听力正常对照按照下述方法 进行OTOF基因的筛查。 0054 散发听神经病耳聋受试者采集自在西京医院(陕西省西安市)耳鼻咽喉头颈外科 门诊做耳聋基因筛查的耳聋患者。 听力正常对照是无耳聋家族史的听力正常受试者， 对所 说明书 4/9 页 6 CN 111139293 A 6 有参加者详细调查其病史以及家族史， 并对其进行体格检查， 耳科检查包括耳镜检查、 听力 学评估。 在签署知情同意书以后每人采集血样510mL， 采集时间是2009年10月。 0055 1.2基因组DNA提取 0056 1.2.1实验前准备及重要注意事项 0057 (1)向蛋白酶K中加入制定用量的Protei。

27、nase K Storage Buffer使其溶解， -20 保存。 配制好的Proteinase K(蛋白酶K)勿长时间室温存放， 避免反复冻融， 以免影响其活 性。 0058 (2)所有离心操作均在室温下完成。 0059 (3)血样样品的储存： 已加入抗凝剂的血液样品可在28储存最多10天， 对于某 些实验例如Southern杂交等， 需要得到完整全长的基因组DNA， 请将血液样品在28储存 不超过3天， 此时基因组DNA的降解程度较轻。 0060 1.2.2操作步骤 0061 1)低速离心至血样分层， 用移液枪去除上层血清， 注意不要吸取或损坏中间层的 黄膜层。 0062 2)将全部血细。

28、胞转移至5mL离心管中， 加入红细胞裂解液至总体积为4mL， 上下颠 倒混匀20次至沉淀充分分散。 0063 3)6500g离心10min， 弃去上清。 0064 4)加入3mL Buffer FG1， 涡漩振荡15s， 使沉淀充分分散。 0065 5)6500g离心10min， 弃去上清， 将离心管倒扣在干净的吸水纸上， 吸干水分。 0066 6)配制DNA提取液与蛋白酶K的混合液， 混合比例为DNA提取液:蛋白酶K100:1， 混合后涡漩振荡15s充分混匀， 按需配制， 现配现用。 0067 7)向样品中加入配制好的DNA提取液与蛋白酶K的混合液1mL， 立即充分涡漩振荡 1min， 直至。

29、溶液无团块。 0068 8)将样品置于65水浴锅中温育15min， 其间颠倒混匀3次， 至样品颜色从红色变 成淡绿色， 说明蛋白完全消化。 0069 9)向样品中加入2mL异丙醇， 颠倒混匀10次至可见白色絮状沉淀。 0070 10)取干净无菌的1.5mL离心管， 做好标记， 加入500 L预冷的75乙醇。 0071 11)用干净无菌的1mL移液器tip头挑取步骤9)中的白色絮状沉淀转移至步骤10) 中准备好的75乙醇中， 颠倒混匀10次， 缓慢倒掉上清， 注意不要倒掉白色絮状沉淀。 0072 11)再次加入500 L预冷的75乙醇， 颠倒混匀10次， 缓慢倒掉上清， 吸干。 0073 12)。

30、打开管盖， 室温干燥15min， 至所有液体完全挥发。 0074 13)加入380 L DNA溶解液， 置于65水浴/金属浴中温育2h， 同时进行振荡使DNA 充分溶解。 0075 14)分光光度计定量及检测纯度。 0076 15)-20保存DNA。 0077 2、 OTOF基因编码区的PCR扩增 0078 2.1引物序列 0079 使用Primer5引物设计软件， 参考序列基因NC_000002.11(26680071.26781566)， 序列合成后用于此检测， 设计完成时间为2019年5月： 说明书 5/9 页 7 CN 111139293 A 7 0080 上游引物OTOF-F-1:5。

31、 -AGACCCTTCTAGGGTGTGTGG-3 ； 0081 下游引物OTOF-R-1:5 -CTGCTGAGTCATGGGAGAGTC-3 。 0082 使用该引物进行PCR扩增所获得的片段大小为381bp。 0083 2.2PCR反应体系的建立(表1) 0084 表1.OTOF基因的PCR反应体系 0085 0086 其中， PCR扩增使用天根公司PCR Mix。 0087 反应条件： PCR反应在BIORAD My Cycle热循环仪上进行， 反应过程(包括温度和时 间)如图2所示。 0088 PCR产物电泳流程： 0089 1)配胶(1琼脂糖)： 称取0.4g琼脂糖， 悬浮于40m。

32、LTAE中(500mL锥形瓶)。 0090 2)溶胶： 微波炉中高火加热至沸， 持续沸腾数分钟， 注意不要沸出， 其间取出混匀。 0091 3)凉胶： 待胶完全溶解， 从微波炉中取出， 凉至60左右， 加入1滴EB(约10 L， 10mg/mL)， 摇匀。 0092 4)铺胶： 平板两端用胶布封严， 把250mL胶液全部倒入平板， 插入梳尺。 0093 5)上胶： 将平板放入已盛有电泳液(0.5TAE， 液面距胶面1至2mm)的电泳槽中， 拔 下梳尺。 0094 6)加样： 用移液器按规定格式加样， 最后加入MarkerDL2000。 0095 7)走胶： 盖上电泳槽盖， 检查正负级， 开启电。

33、泳仪， 调节电泳电压。 0096 8)定量： 当溴酚蓝走离加样孔1.5至2cm处， 关闭电泳仪， 小心取胶， 放入摄相仪照 相。 经过电泳后， 有6条带可见， MarkerDL2000(TaKaRa)片段长度分别是2000bp、 1000bp、 750bp、 500bp、 250bp、 100bp， DL2000的总浓度是300ng/5 L。 电泳时取5 L DL2000， 因此每条 带的含量为50ng。 PCR产物电泳时取5 L(PCR产物)进行电泳。 根据PCR产物电泳后的灰度值 与DL2000的灰度值的比较判断PCR产物的大小及含量(参见图3)。 0097 (二)OTOF基因编码区PCR。

34、扩增产物的纯化和定量 0098 PCR扩增产物的纯化(96孔板法)： 0099 1)PCR扩增产物电泳结束后， 在长波365nm紫外透射仪下， 用手术刀切下目的条带， 切取的胶块质量应小于3g， 将其放入对应的板孔号中。 0100 2)4000rpm离心1min， 加入500ul溶胶液， 盖上封口膜， 65水浴15min， 定时。 0101 3)检查每孔胶块是否完全溶解， 若没有完全溶解再次65水浴3min， 揭开封口膜， 用连续加液器每孔加入10 L混匀的磁珠， 盖上硅胶垫， 漩涡震荡30s， 转入水平震荡仪600 800rpm震荡5min。 说明书 6/9 页 8 CN 111139293。

35、 A 8 0102 4)将96孔板卡入磁力架中， 磁吸30s， 将磁力架和样品正反轻微颠倒3次， 再次静置 磁吸1min。 0103 5)弃废液， 吸水纸上轻磕， 用501200 L 8道电动移液器向每孔移入500 L洗液， 盖上硅胶垫漩涡震荡30s， 将96孔板卡入磁力架中， 磁吸30s， 将磁力架和样品正反轻微颠倒 3次， 再次静置磁吸1min。 0104 6)弃废液， 吸水纸上轻磕， 用50-1200 L 8道电动移液器向每孔移取500 L 70乙 醇盖上硅胶垫漩涡震荡30s， 将96孔板卡入磁力架中， 磁吸30s， 将磁力架和样品正反轻微颠 倒3次， 再次静置磁吸1min。 0105 。

36、7)弃废液， 吸水纸上轻磕， 倒离心至600rpm水平震荡5min。 0106 8)离心至1000rpm， 将96孔板卡入磁力架中， 磁吸1min。 0107 9)2 L样品+6 L 1.4X溴酚蓝混合后点入0.8的鉴定胶中， 按照A01-H01的竖向顺 序横向点入， 中间空出2孔， 分别加入1 L、 2 L量的DL2000， 300V电泳11min。 0108 10)将鉴定胶放入凝胶成像仪中采集图像， 图像必须保证marker条带清晰。 0109 11)对照纯化前后胶图， 根据PCR定量标准在PCR记录表上标注每孔扩增产物纯化 后所得测序模板的浓度并稀释至指定浓度， 对回收后电泳无条带的样品。

37、按照4 L样品+5 L 1.4X溴酚蓝再次电泳鉴定。 0110 12)将稀释后上述模板离心2min， 离心至4000rpm， 标记Lims系统模板状态， 确认提 交前需要再次核对上述模板状态， 确认无误后将上述模板4冰箱保存。 0111 (三)纯化的OTOF基因编码区PCR扩增产物的直接测序 0112 1、 PCR产物DNA模板的纯度与用量要求见表2。 0113 DNA纯度： OD260/OD2801.62.0。 0114 DNA浓度： PCR产物10ng/ L。 0115 表2.DNA用量 0116 PCR产物长度(bp)测序反应加入模板量(ng) 10020013 200500310 50。

38、01000520 100020001040 200040100 0117 2、 测序反应 0118 1)测序反应所需试剂应为新鲜配制， 需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使 用。 测序反应所需的器材(如96孔板、 tip头等)同样应为洁净无菌的。 0119 2)为了保证测序样本及反应试剂的新鲜， 加样时应在冰上操作。 0120 3)目前的反应体系为5 L， 各种试剂加入量如表3所示。 0121 表3.OTOF基因PCR扩增产物的测序反应体系 说明书 7/9 页 9 CN 111139293 A 9 0122 0123 其中， BDT为美国应用生物系统公司(ABI)生产的用于测序反应的荧光染料。。

39、 5GC buffer是美国应用生物系统公司(ABI)生产的用于测序反应的缓冲液。 0124 4)样品放于PCR仪(热循环仪)上， 所作反应的过程见表4。 0125 表4.OTOF基因PCR扩增产物的测序反应过程 0126 0127 5)反应完的样品要及时从PCR仪(热循环仪)上取下， 短时间内要进行纯化的样品 放置于4冰箱中， 超过一天以上才能纯化的样品放置于-20冰箱冷冻。 0128 3、 测序反应物的纯化和测序 0129 1)向每孔中加入20 L 80乙醇， 4000rpm离心30min； 将样品板放在折好的纸巾 上， 在离心机中倒甩， 倒甩时速率不能超过1000rpm； 0130 2)。

40、在每孔中加入30 L 70乙醇， 4000rpm离心10min， 倒甩； 0131 3)重复步骤2)再两次； 0132 4)将样品板放于干净的抽屉中， 避光干燥30min； 0133 5)加入5 L甲酰胺， 封膜， 离心后置于-20冰箱中； 0134 6)上机前95变性5min， 放置冰上2min， 离心后上ABI 3730测序仪。 0135 测序结果如图4A、 图4B所示。 200例患者中， 1例听神经病谱系障碍患者的OTOF基因 检测发现为c.4236delC与另一个明确致病位点c.907delAG组成的复合杂合突变。 对100名 听力正常者的筛查中未发现c.4236delC突变者。 01。

41、36 (四)检测耳聋相关基因OTOF突变位点(c.4236delC)试剂盒及其应用 0137 1、 试剂盒的组成 0138 (1)扩增用引物： 0139 上游引物： 0140 OTOF-F-1:5 -AGACCCTTCTAGGGTGTGTGG-3 ； 说明书 8/9 页 10 CN 111139293 A 10 0141 下游引物： 0142 OTOF-R-1:5 -CTGCTGAGTCATGGGAGAGTC-3 ； 0143 (2)PCR扩增用PCR Mix 2 0144 (4)dNTP 2.5mM 0145 (5)Big-Dye mix(美国应用生物系统公司(ABI)生产) 0146 2、。

42、 使用方法 0147 1)PCR扩增 0148 用软件Primer 5.0对OTOF基因的编码区设计PCR引物， 反应条件见图2。 0149 2)PCR产物纯化 0150 PCR产物电泳， 凝胶纯化及电泳定量。 0151 3)测序反应及验证 0152 以PCR引物作为测序引物进行测序反应， 在BIORAD My Cycle热循环仪上进行测序 反应。 反应结束后， 延伸产物上样于ABI 3730DNA序列分析仪。 将所得到的测序图谱进行分 析， 与正常序列(NC_000002.11(26680071.26781566)比较， 以确定突变是否存在。 0153 实例2 0154 扩增引物(设计完成时。

43、间2019年5月)如下， 其他同实例1(扩增目标区域为OTOF基 因的第33号外显子， 参考序列： NC_000002.11(26680071.26781566)： 0155 上游引物OTOF-F-2:5 -CTTCCTGCTCTGCTCATTTCT-3 ； 0156 下游引物OTOF-R-2:5 -GTGGCATTCAAAATAGCTAACA-3 。 0157 实例3 0158 扩增引物(设计完成时间2019年5月)如下， 其他同实例1(扩增目标区域为OTOF基 因的第33号外显子， 参考序列： NC_000002.11(26680071.26781566)： 0159 OTOF-F-3:5。

44、 -CTCTGCTCATTTCTGCTCCAC-3 ； 0160 OTOF-R-3:5 -GGGTCAGGGTGTAGGTTTGC-3 。 说明书 9/9 页 11 CN 111139293 A 11 中国人民解放军第四军医大学 听神经病谱系障碍相关的OTOF基因突变检测试剂盒 6 1 21 DNA 人工合成 1 agacccttct agggtgtgtg g 21 2 21 DNA 人工合成 2 ctgctgagtc atgggagagt c 21 3 21 DNA 人工合成 3 cttcctgctc tgctcatttc t 21 4 22 DNA 人工合成 4 gtggcattca aaatagctaa ca 22 5 21 DNA 人工合成 5 ctctgctcat ttctgctcca c 21 6 20 DNA 人工合成 6 序列表 1/2 页 12 CN 111139293 A 12 gggtcagggt gtaggtttgc 20 序列表 2/2 页 13 CN 111139293 A 13 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 14 CN 111139293 A 14 图4A 图4B 说明书附图 2/2 页 15 CN 111139293 A 15 。