齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010060143.7 (22)申请日 2020.01.19 (71)申请人 长江大学 地址 434023 湖北省荆州市南环路1号 (72)发明人 杨玉洁 (74)专利代理机构 武汉智嘉联合知识产权代理 事务所(普通合伙) 42231 代理人 江慧 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 一种齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株 再生的方法 (57)摘要 本发明公开了一种齿叶冬青体细胞胚胎间 接发生和植株再生的方法， 包括： 将齿叶冬青的。

2、 幼胚接种至1/4MS+00 .1mg/L6-BA+0 .5 1.5mg/L2， 4-D培养基上培养， 获得胚性愈伤组 织； 将胚性愈伤组织转至WPM+1mg/LZT或1 2mg/L2-ip+0.54mg/L2， 4-D+3060g/L蔗糖+ 67g/L琼脂+480520mg/L谷氨酰胺培养基上 增殖培养； 转至WPM+1.0mg/LZT或12mg/L2-ip +0.54mg/L2， 4-D+6090g/L蔗糖+57mg/ LABA+67g/L琼脂+480520mg/L谷氨酰胺培养 基上培养获得体细胞胚后继续培养。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 111134018 A 2020.。

3、05.12 CN 111134018 A 1.一种齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法， 其特征在于， 所述方法包括： 步骤1、 采集齿叶冬青的未成熟种子， 清洗消毒后， 剥出幼胚作为外植体备用； 步骤2、 将所得幼胚接种至愈伤组织诱导培养基上培养， 获得胚性愈伤组织， 所述愈伤 组织诱导培养基的配方为： 1/4MS+00.1mg/L6-BA+0.51.5mg/L2， 4-D； 步骤3、 将所得胚性愈伤组织转移至增殖培养基上增殖培养， 所述增殖培养基的配方 为： WPM+1mg/L ZT或者12mg/L2-ip+0.54mg/L 2， 4-D+3060g/L蔗糖+67g/L琼脂+ 480。

4、520mg/L谷氨酰胺； 步骤4、 增值培养后转移至体胚诱导培养基暗培养获得体细胞胚， 所述体胚诱导培养基 的配方为： WPM+1.0mg/L ZT或者12mg/L2-ip+0.54mg/L2， 4-D+6090g/L蔗糖+57mg/ LABA+67g/L琼脂+480520mg/L谷氨酰胺培养基上； 步骤5、 将所得的体细胞胚转移至MS培养基上萌发培养一段时间后， 转移至光照条件下 培养一段时间形成生根的完整植株； 步骤6、 将所得生根的完整植株移栽至栽培基质中培养。 2.如权利要求1所述的齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法， 其特征在于， 所述步骤1中清洗消毒的具体步骤为： 将冬青的。

5、未成熟种子用流水冲洗1030min， 转移至 超净工作台上用无菌水润洗； 种子的表面消毒先用75的酒精浸泡530min， 再用8次氯 酸钠浸泡1030min， 最后用无菌水冲洗5-6次， 放入无菌水中待用。 3.如权利要求1所述的齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法， 其特征在于， 所述步骤2中培养条件为： 培养的温度为251， 光照强度为1000-3000Lx， 光照时间为16 18h/d。 4.如权利要求1所述的齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法， 其特征在于， 所述步骤2中愈伤组织诱导培养基的配方为： 1/4MS+00.1mg/L6-BA+1.0mg/L 2， 4-D。 5。

6、.如权利要求1所述的齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法， 其特征在于， 所述步骤3中增殖培养基的配方为： 1.0mg/L ZT/2-ip+2.0mg/L2， 4-D+30g/L蔗糖+6.5g/L琼 脂+500mg/L谷氨酰胺。 6.如权利要求1所述的齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法， 其特征在于， 所述步骤3中增殖培养的条件为： 培养的温度为251， 光照强度为1000-3000Lx， 光照时 间为1618h/d。 7.如权利要求1所述的齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法， 其特征在于， 所述步骤4中体胚诱导培养基的配方为： WPM+1.0mg/L ZT/2-ip+2。

7、.0mg/L2， 4-D+60g/L蔗糖+ 6mg/LABA+6.5g/L琼脂+500mg/L谷氨酰胺。 8.如权利要求1所述的齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法， 其特征在于， 所述步骤4中体胚诱导培养的条件为： 培养的温度为251， 光照强度为1000-3000Lx， 光 照时间为1618h/d。 9.如权利要求1所述的齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法， 其特征在于， 所述步骤5中MS培养基上萌发1216d后转移至光照条件下培养2630d， 所述光照条件下 的光照强度为1000-3000Lx， 光照时间为1618h/d。 10.如权利要求1所述的齿叶冬青体细胞胚胎间接发生。

8、和植株再生的方法， 其特征在 于， 所述步骤6中移栽至栽培基质中置于温室苗床上喷雾系统下生长。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111134018 A 2 一种齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法 技术领域 0001 本发明涉及组培技术领域， 特别涉及一种齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再 生的方法。 背景技术 0002 齿叶冬青是多枝常绿灌木， 高可达5米； 叶片革质， 倒卵形， 椭圆形或长圆状椭圆 形， 雄花1-7朵排成聚伞花序， 花4基数， 白色； 花萼盘状， 花瓣4， 阔椭圆形， 花冠直径约6毫 米， 花瓣卵形， 子房卵球形， 果球形， 成熟后黑色； 内果皮革质。 花期5-6月。

9、， 果期8-10月。 生于 海拔700-2100米的丘陵， 山地杂木林或灌木丛中。 分布于中国、 日本和朝鲜。 常栽培作庭园 观赏树种， 欧美各地亦有栽培。 齿叶冬青果实属植物种子， 发芽十分困难， 由于坚硬的种皮 和未成熟合子胚的双重休眠， 使其具有隔年发芽的特性。 齿叶冬青常规育种需要2-3年才能 获得幼苗。 0003 目前， 国内外有关以子叶、 下胚轴、 叶片、 芽(嫩芽和休眠芽)等为外植体， 通过器官 发生途径获得了试管苗， 但普遍存在着但普遍存在着外植体褐变严重、 愈伤组织诱导率低、 繁殖系数低、 体细胞胚诱导难等一系列技术问题， 阻碍了齿叶冬青工厂化育苗和优良无性 系在生产上的大规。

10、模应用。 发明内容 0004 本发明的目的在于克服现有技术之缺陷， 提供了一种齿叶冬青体细胞胚胎间接发 生和植株再生的方法， 以齿叶冬青幼苗幼胚作为外植体， 通过体细胞胚胎间接发生方式成 功获得植株再生快繁体系， 齿叶冬青愈伤组织诱导率与体细胞胚诱导率均较高且褐化率 低、 繁殖系数高。 0005 本发明是这样实现的： 0006 本发明的目的在于提供一种齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法， 所 述方法包括： 0007 步骤1、 采集齿叶冬青的未成熟种子， 清洗消毒后， 剥出幼胚作为外植体备用； 0008 步骤2、 将所得幼胚接种至愈伤组织诱导培养基上培养， 获得胚性愈伤组织， 所述 愈伤。

11、组织诱导培养基的配方为： 1/4MS+00.1mg/L6-BA+0.51.5mg/L 2， 4-D； 0009 步骤3、 将所得胚性愈伤组织转移至增殖培养基上增殖培养， 所述增殖培养基的配 方为： WPM+1mg/L ZT或者12mg/L2-ip+0.54mg/L 2， 4-D+3060g/L蔗糖+67g/L琼脂+ 480520mg/L谷氨酰胺； 0010 步骤4、 增值培养后转移至体胚诱导培养基暗培养获得体细胞胚， 所述体胚诱导培 养基的配方为： WPM+1.0mg/L ZT或者12mg/L2-ip+0.54mg/L 2， 4-D+6090g/L蔗糖+5 7mg/L ABA+67g/L琼脂+。

12、480520mg/L谷氨酰胺培养基上； 0011 步骤5、 将所得的体细胞胚转移至MS培养基上萌发培养一段时间后， 转移至光照条 件下培养一段时间形成生根的完整植株； 说明书 1/6 页 3 CN 111134018 A 3 0012 步骤6、 将所得生根的完整植株移栽至栽培基质中培养。 0013 优选地， 所述步骤1中清洗消毒的具体步骤为： 将冬青的未成熟种子用流水冲洗10 30min， 转移至超净工作台上用无菌水润洗； 种子的表面消毒先用75的酒精浸泡5 30min， 再用8次氯酸钠浸泡1030min， 最后用无菌水冲洗5-6次， 放入无菌水中待用。 0014 优选地， 所述步骤2中培养条。

13、件为： 培养的温度为251， 光照强度为1000- 3000Lx， 光照时间为1618h/d。 0015 优选地， 所述步骤2中愈伤组织诱导培养基的配方为： 1/4MS+00.1mg/L6-BA+ 1.0mg/L 2， 4-D。 0016 优选地， 所述步骤3中增殖培养基的配方为： 1.0mg/L ZT/2-ip+2.0mg/L2， 4-D+ 30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+500mg/L谷氨酰胺。 0017 优选地， 所述步骤4中体胚诱导培养基的配方为： WPM+1.0mg/L ZT/2-ip+2.0mg/ L2， 4-D+60g/L蔗糖+6mg/LABA+6.5g/L琼脂+500mg/L。

14、谷氨酰胺。 0018 优选地， 所述步骤5中MS培养基上萌发1216d后转移至光照条件下培养2630d， 所述光照条件下的光照强度为1000-3000Lx， 光照时间为1618h/d。 0019 优选地， 所述步骤6中移栽至栽培基质中置于温室苗床上喷雾系统下生长。 0020 本发明具有以下有益效果： 0021 本发明提供的一种齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法， 以齿叶冬青 幼苗幼胚作为外植体， 通过体细胞胚胎间接发生方式成功获得植株再生快繁体系， 齿叶冬 青的愈伤组织诱导率高达100， 褐化率低至2.94， 增殖系数高达3.7， 体细胞胚诱导率高达 74.07。 附图说明 0022 。

15、图1为本发明实施例提供的一种齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法 中获得体细胞胚图片， 其中图A和B为为体细胞胚图片， 图C为体细胞胚苗图片。 具体实施方式 0023 实施例1 0024 本实施例提供的一种齿叶冬青体细胞胚胎间接发生和植株再生的方法， 包括： 0025 (1)将冬青的未成熟种子用流水冲洗20min， 去除表面污垢。 转移至超净工作台上， 放入无菌烧杯中， 用无菌水润洗1次。 种子的表面消毒先用75的酒精浸泡5min， 再用8次 氯酸钠浸泡15min， 最后用无菌水冲洗5-6次， 放入无菌水中待用； 剥出幼胚作为外植体备 用； 0026 (2)将幼胚接种至1/4MS+1.0。

16、mg/L2， 4-D或者1/4MS+0.01mg/L6-BA+1.0mg/L2， 4-D 培养基上诱导愈伤组织； 0027 (3)将胚性愈伤组织转移至增殖培养基WPM+1.0mg/L ZT/2-ip+2.0mg/L2， 4-D+ 30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂+500mg/L谷氨酰胺培养基上增殖； 0028 (4)将胚性愈伤组织转移至体胚诱导培养基WPM+WPM+1.0mg/L ZT/2-ip+2.0mg/ L2， 4-D+60g/L蔗糖+6mg/LABA+6.5g/L琼脂+500mg/L谷氨酰胺培养基上暗培养8周后， 获得 体细胞胚； 说明书 2/6 页 4 CN 111134018 A 。

17、4 0029 (5)将体细胞胚转移至不含任何植物生长调节剂的MS培养基上萌发， 2周后转移至 光照条件下培养4周； 0030 (6)清洗幼苗并移栽至栽培基质中置于温室苗床上喷雾系统下生长， 移栽存活率 达90左右。 0031 实施例2-实施例12 0032 实施例2-实施例12中仅步骤2愈伤组织诱导培养基中的6-BA以及2， 4-D的浓度改 变， 其他均同实施例1， 具体见表1。 0033 实施例13-实施例14 0034 实施例13-实施例14中将步骤3中的增殖培养基的细胞分裂素ZT改为2-ip， 其他均 同实施例1， 具体见表2。 0035 实施例15-实施例16 0036 实施例15-实。

18、施例16中将步骤3中的增殖培养基的蔗糖浓度改变外， 其他均同实施 例1， 具体见表3。 0037 实施例17-实施例19 0038 实施例17-实施例19将步骤3中的增殖培养基的2， 4-D浓度改变外， 其他均同实施 例1， 具体见表5。 0039 实施例20-实施例21 0040 实施例20-实施例21将步骤4中的体胚诱导培养基的ABA浓度改变外， 其他均同实 施例1， 具体见表6。 0041 实施例22-实施例23 0042 实施例22-实施例23将步骤4中的体胚诱导培养基的蔗糖浓度改变外， 其他均同实 施例1， 具体见表7。 0043 对比例1-对比例15 0044 对比例1-对比例15。

19、中仅步骤2愈伤组织诱导培养基中的6-BA以及2， 4-D的浓度改 变， 其他均同实施例1， 具体见表1。 0045 对比例16-对比例28 0046 对比例16-对比例28中将步骤3中的增殖培养基的细胞分裂素ZT改为其他细胞分 裂素， 其他均同实施例1， 具体见表2。 0047 对比例29-对比例30 0048 对比例29-对比例30中将步骤3中的增殖培养基的蔗糖浓度改变外， 其他均同实施 例1， 具体见表3。 0049 对比例31-对比例33 0050 对比例31-对比例33中将步骤3中的增殖培养基的基本培养基改变外， 其他均同实 施例1， 具体见表4。 0051 对比例34 0052 该对。

20、比例34中将步骤3中的增殖培养基的2， 4-D浓度改变外， 其他均同实施例1， 具 体见表5。 0053 对比例35-对比例37 0054 对比例35-对比例37将步骤4中的体胚诱导培养基的ABA浓度改变外， 其他均同实 说明书 3/6 页 5 CN 111134018 A 5 施例1， 具体见表6。 0055 对比例38 0056 对比例38将步骤4中的体胚诱导培养基的蔗糖浓度改变外， 其他均同实施例1， 具 体见表7。 0057 实验例1胚性愈伤组织的诱导 0058 统计实施例1-12、 以及对比例1-15中发芽率以及愈伤组织诱导率结果如表1所示。 0059 表1 0060 0061 00。

21、62 由表1可知， 00.1mg/L6-BA+0.51.5mg/L 2， 4-D时愈伤组织诱导率均较高， 其 中实施例1和实施例2的愈伤组织诱导率达到了100。 0063 实验例2胚性愈伤组织的增殖 0064 一、 统计实施例1、 实施例13-14、 以及对比例16-28中不同细胞分裂素对齿叶冬青 褐化率和增殖系数的影响， 结果如表2所示。 0065 表2 说明书 4/6 页 6 CN 111134018 A 6 0066 0067 由表2可知， 与对比例16-28相比， 实施例1、 以及实施例13-14的褐化率低、 增殖系 数较高。 表明细胞分裂素优选1mg/L ZT或者12mg/L 2-i。

22、p。 0068 二、 统计实施例1、 实施例15-16以及对比例29-30中不同蔗糖浓度对齿叶冬青褐化 率和增殖系数的影响， 结果如表3所示。 0069 表3 0070 0071 由表3可知， 与对比例29-30相比， 实施例1、 以及实施例15-16的褐化率低、 增殖系 数较高。 表明蔗糖浓度优选为3060g/L。 0072 三、 统计实施例1、 以及对比例31-33中不同基本培养基对齿叶冬青褐化率和增殖 系数的影响， 结果如表4所示。 0073 表4 0074 0075 由表4可知， 与对比例31-33相比， 实施例16的褐化率低、 增殖系数较高。 表明基本 培养基优选为WPM。 0076。

23、 四、 统计实施例1、 实施例18-19以及对比例34中不同2， 4-D浓度对齿叶冬青褐化率 和增殖系数的影响， 结果如表5所示。 说明书 5/6 页 7 CN 111134018 A 7 0077 表5 0078 0079 由表5可知， 与对比例34相比， 实施例1、 实施例17-19的褐化率低、 增殖系数较高。 表明2， 4-D的浓度优选为0.54mg/L， 其中2mg/L时褐化率最低， 增殖系数最高。 0080 实验例3体细胞胚的诱导 0081 一、 统计实施例1、 实施例20-21、 以及对比例35-37中不同浓度的ABA对齿叶冬青幼 胚体细胞胚胎发生的影响， 结果如表6所示。 008。

24、2 表6 0083 0084 由表6可知， 与对比例35-36相比， 实施例1、 实施例20-21的体胚诱导率较高。 表明 ABA的浓度优选为57mg/L， 其中6mg/L时体胚诱导率最高。 0085 二、 统计实施例1、 实施例22-23、 以及对比例38中不同浓度的蔗糖对齿叶冬青幼胚 体细胞胚胎发生的影响， 结果如表7所示。 0086 表7 0087 0088 由表7可知， 与对比例38相比， 实施例1、 实施例22-23的体胚诱导率较高。 表明蔗糖 的浓度优选为5090g/L， 其中60g/L时体胚诱导率最高。 0089 所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和 原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包括在本发明的保护范围之内。 说明书 6/6 页 8 CN 111134018 A 8 图1 说明书附图 1/1 页 9 CN 111134018 A 9 。