用于红细胞的单个细胞标记的试剂盒及其检测方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010009183.9 (22)申请日 2020.01.06 (71)申请人 中国科学院生态环境研究中心 地址 100085 北京市海淀区双清路18号 (72)发明人 胡立刚刘念王丁一曲广波 何滨江桂斌 (74)专利代理机构 中科专利商标代理有限责任 公司 11021 代理人 宋明张莹 (51)Int.Cl. G01N 15/14(2006.01) G01N 1/30(2006.01) (54)发明名称 用于红细胞的单个细胞标记的试剂盒及其 检测方法 (57)摘要 本发明涉。

2、及一种用于质谱流式细胞术中标 记细胞的染色液、 包含所述染色液的试剂盒及检 测方法， 及一种红细胞定型液。 所述染色液中含 有锇酸， 所述试剂盒进一步包括细胞特异性金属 标记抗体。 通过与红细胞定型液合用， 本发明的 试剂盒特别适用于单个红细胞的标记检测， 可用 于多种元素在红细胞中单个细胞的分布测定。 权利要求书1页 说明书9页 附图5页 CN 111157433 A 2020.05.15 CN 111157433 A 1.用于质谱流式细胞术中细胞(例如红细胞或白细胞)标记的染色液， 其含有锇酸， 在 所述染色液的工作浓度下， 所述锇酸的浓度为10-510-4(w/v)， 优选为310-57。

3、 10-5(w/v)， 更优选为510-5710-5(w/v)。 2.试剂盒， 包含权利要求1所述的染色液， 其还进一步包含： 金属标记抗体， 优选为细胞 特异性金属标记抗体。 3.根据权利要求1或2所述的试剂盒， 其中： 当所述细胞为红细胞时， 所述试剂盒还包含 红细胞定型液， 所述红细胞定型液含有浓度为25(v/v)， 优选为23(v/v)的戊 二醛。 4.根据权利要求23中任一项所述的试剂盒， 其中， 所述细胞特异性金属标记抗体为 镧系元素标记抗体(优选为抗小鼠Ter119-镧系元素标记抗体、 抗人CD235ab-镧系元素标记 抗体、 抗小鼠CD45-镧系元素标记抗体或抗人CD45-镧系。

4、元素标记抗体中的一种或多种)， 任 选地， 在检测时， 共同使用的镧系元素标记抗体中的镧系元素彼此不相同。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其中， 所述镧系元素标记抗体中的镧系元素选自La (镧)， Ce(铈)， Pr(镨)， Nd(钕)， Pm(钷)， Sm(钐)， Eu(铕)， Gd(钆)， Tb(铽)， Dy(镝)， Ho(钬)， Er (铒)， Tm(铥)， Yb(镱)， Lu(镥)， 钪(Sc)， 钇(Y)， 优选为Sm(钐)、 Pr(镨)。 6.根据权利要求25中任一项所述的试剂盒， 其进一步包含染色用缓冲液， 所述染色 用缓冲液为包含0.51(w/v)的封闭蛋白(如牛血清白蛋白。

5、)且不含钙镁离子的缓冲液 (优选为pH范围为7.27.4的磷酸盐缓冲液， 更优选为PBS)。 7.根据权利要求26所述的试剂盒， 其进一步包含细胞洗液， 所述细胞洗液(优选为pH 范围为7.27.4的磷酸盐缓冲液， 更优选为PBS)中不含钙镁离子， 优选地， 不含该镁离子的 磷酸盐缓冲液浓度为0.0067M。 8.权利要求27中任一项所述的试剂盒在单个细胞的检测中的应用， 其中， 优选被检 测的细胞中包含红细胞。 9.浓度25(v/v)的戊二醛溶液在长期保存红细胞中的应用。 10.一种单个细胞元素检测的方法， 包括以下步骤： 利用浓度为25(v/v)， 优选为23(v/v)的戊二醛溶液处理细胞。

6、； 使用锇酸的浓度为10-510-4(w/v)， 优选为310-5710-5(w/v)， 更优选为5 10-5710-5(w/v)的染色液标记细胞(其中， 优选细胞的浓度为21064106个/ml)； 使用金属标记抗体(优选为细胞特异性金属标记抗体)标记细胞。 11.根据权利要求10所述的方法， 其进一步包括下述步骤中的一种或多种： 将所述金属标记抗体溶解于权利要求6中定义的染色缓冲液中； 使用权利要求6中定义的染色缓冲液洗涤细胞； 使用权利要求7中定义的细胞洗液洗涤细胞。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111157433 A 2 用于红细胞的单个细胞标记的试剂盒及其检测方法 技术领域 0。

7、001 本发明涉及一种用于质谱流式细胞术中细胞标记的染色液、 包含其的试剂盒及使 用所述试剂盒的检测方法。 所述染色液、 试剂盒及检测方法特别适用于无核细胞， 特别是红 细胞的单个细胞的多种元素分布测定。 背景技术 0002 质谱流式细胞术(cytometry by time-of-flight， CyTOF)是近几年发展非常迅速 的单细胞检测技术， 是基于质谱检测原理的流式细胞仪， 其采用金属元素铱(Ir)或铑(Rh) 标记细胞核， 用于单个细胞的筛选和鉴定； 采用非放射性的稀土元素作为抗体标签， 该方法 信号精确， 检测通道多， 稳定性高， 由于无需校正光谱的重叠干扰， 与传统质谱仪相比，。

8、 该方 法可以同时检测单个细胞中最多135种元素的信息， 为有效的研究手段。 0003 红细胞是血细胞的主要细胞类型， 不仅具有运输氧气和二氧化碳的功能， 也具有 免疫粘附、 免疫吞噬等功能， 在酸碱平衡中也起到一定缓冲作用， 对维持生命体的正常生理 活动非常重要。 0004 红细胞中的元素含量反映了元素的生物累积以及其在人体中的转移转化规律， 与 人体健康密切相关。 元素含量的分布在单个红细胞之间存在个体异质性， 部分红细胞元素 含量很高， 部分红细胞元素含量较低， 而元素含量与其功能以及健康效应有着密切联系。 分 析单个红细胞中元素含量对于研究其分布规律、 转移转化规律以及相关生理病理具有。

9、十分 重要的意义。 0005 目前， 红细胞中元素含量的检测局限于总量检测， 检测方法主要有紫外可见光分 光光度法(UV)、 原子吸收法(AAS)、 电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)、 电感耦合等离 子体质谱(ICP-MS)等。 因此， 存在只能分析红细胞的平均元素含量， 不能分析单个红细胞之 间元素含量的差异的问题。 0006 对红细胞进行单个细胞检测时， 主要存在的障碍是红细胞中不具备细胞核， 因此 不能被现有在质谱流式细胞仪中使用的金属元素铱(Ir)或铑(Rh)所标记； 另外， 红细胞的 一大特点是容易破裂， 其自身非常容易因为细胞内外渗透压改变而发生破裂， 因此很难保 证检。

10、测过程中细胞形态完整。 0007 并且， 在实践中常常根据样品收集条件、 试验设备的安排， 平行试验的排期等， 在 取血后第一时间进行质谱流式细胞仪的测定较为困难。 因此， 希望有一种能够将红细胞样 品保持形态完整而长期保存的试剂和方法。 0008 鉴于上述原因， 需要实现单个红细胞中的元素检测的新的技术支持， 以及可用于 科研、 商用的保持红细胞完整的长期保存剂。 发明内容 0009 本发明针对现有技术的不足， 提供了适用于无核细胞特别是红细胞的单个细胞元 素检测的染色液、 试剂盒及其检测方法。 所述试剂盒能够实现红细胞的体外长期保存， 并适 说明书 1/9 页 3 CN 111157433。

11、 A 3 用于针对红细胞的质谱流式细胞仪的单个细胞元素检测。 0010 锇酸为脂质反应性剂， 在使用透射电镜观察组织细胞时， 可以使用锇酸固定液很 好地染色细胞膜， 能够用于透射电子显微镜病理诊断样品的制备。 在这样的用途中， 使用的 锇酸浓度一般为2(w/w)， 有时也使用1(w/w)。 0011 在流式细胞术中， 元素锇的标记量与被标记的细胞的大小严格相关， 由此可利用 元素锇的信号区分完整单细胞与细胞碎片， 实现对单个细胞的检测。 发明人发现， 使用在工 作浓度下含有浓度为10-510-4(w/v)， 优选为310-5710-5(w/v)， 更优选为5 10-5710-5(w/v)的锇酸。

12、溶液作为染色液时， 能够在单个细胞水平的质谱流式细 胞术测定中对细胞样本尤其是红细胞得到良好的染色效果。 0012 质谱流式细胞术以在细胞中含量极低的镧系金属代替传统的荧光蛋白来标记抗 体。 在本文中， 有时将这样利用镧系元素标记的抗体简称为金属标记抗体， 其中， 与特定细 胞进行结合的金属标记抗体(以下称为细胞特异性金属标记抗体)能够与特定细胞特异性 结合， 从而实现特定细胞的筛选和鉴定， 例如， 红细胞特异性金属标记抗体可以鉴定红细 胞， 区分红细胞和其他细胞类型。 在检测时， 共同使用的镧系元素标记抗体中的镧系元素彼 此不相同， 则可以同时使用30甚至40多种抗体进行标记。 在本文中， 。

13、有时使用大写字母M代 表镧系元素。 0013 本发明的染色液通过与金属标记抗体组合使用， 可以良好地鉴别目的细胞并标记 单个细胞， 由此针对目的细胞实现单个细胞水平的检测。 需要说明的是， 本发明的细胞元素 检测的染色液也可以与本领域常用的其他细胞鉴别标记组合使用， 只要能够利用其区分完 整细胞与细胞碎片的功能， 而成功标记单个细胞水平即可。 0014 作为金属标记抗体， 本发明中使用了细胞特异性金属标记抗体， 特别是红细胞特 异性金属标记抗体， 所述红细胞特异性金属标记抗体包括但不限于： 抗小鼠Ter119-镧系元 素标记抗体、 抗人CD235ab-镧系元素标记抗体、 抗小鼠CD45-镧系元。

14、素标记抗体或抗人 CD45-镧系元素标记抗体中的至少一种。 0015 本发明使用的镧系元素可以为例如La(镧)， Ce(铈)， Pr(镨)， Nd(钕)， Pm(钷)， Sm (钐)， Eu(铕)， Gd(钆)， Tb(铽)， Dy(镝)， Ho(钬)， Er(铒)， Tm(铥)， Yb(镱)， Lu(镥)， 钪(Sc)， 钇 (Y)中的一种或多种， 需要注意的是， 在检测时， 需要使共同使用的镧系元素标记抗体中的 镧系元素彼此不相同。 0016 本发明还提供了一种可以将红细胞在体外优选为在低温， 更优选在-80下进行 长期保存的红细胞定型液， 其包含浓度为25(v/v)， 优选为23(v/v。

15、)， 特别优选 为2.5(v/v)的戊二醛溶液。 0017 本发明所述的 “体外长期保存” 是指： 在该保存结束后， 被保存的细胞能够以扫描 电子显微镜或本领域其他技术观察到完整的细胞形态， 能够用于进行下一步的细胞生化指 标等的测定的状态即可， 该细胞并不必须为活细胞。 0018 本发明所述的 “单个细胞检测” 包括同时、 或分批进行对细胞群体进行一种或多种 指标的检测， 从而得到关于所述细胞群体中的单个(单独)细胞的多种或一种元素含量、 生 化、 免疫及多种信息。 0019 具体而言， 本发明涉及以下内容： 0020 1.用于质谱流式细胞术中细胞(例如红细胞或白细胞)标记的染色液， 其含有。

16、锇 说明书 2/9 页 4 CN 111157433 A 4 酸， 在所述染色液的工作浓度下， 所述锇酸的浓度为10-510-4(w/v)， 优选为310-5 710-5(w/v)， 更优选为510-5710-5(w/v)。 0021 2.试剂盒， 包含项1所述的染色液， 其还进一步包含： 金属标记抗体， 优选为细胞特 异性金属标记抗体。 0022 3.根据项1或2所述的试剂盒， 其中： 当所述细胞为红细胞时， 所述试剂盒还包含红 细胞定型液， 所述红细胞定型液含有浓度为25(v/v)， 优选为23(v/v)的戊二 醛。 0023 4.根据项23中任一项所述的试剂盒， 其中， 所述细胞特异性金。

17、属标记抗体为镧 系元素标记抗体(优选为抗小鼠Ter119-镧系元素标记抗体、 抗人CD235ab-镧系元素标记抗 体、 抗小鼠CD45-镧系元素标记抗体或抗人CD45-镧系元素标记抗体中的一种或多种)， 任选 地， 在检测时， 共同使用的镧系元素标记抗体中的镧系元素彼此不相同。 0024 5.根据项4所述的试剂盒， 其中， 所述镧系元素标记抗体中的镧系元素选自La (镧)， Ce(铈)， Pr(镨)， Nd(钕)， Pm(钷)， Sm(钐)， Eu(铕)， Gd(钆)， Tb(铽)， Dy(镝)， Ho(钬)， Er (铒)， Tm(铥)， Yb(镱)， Lu(镥)， 钪(Sc)， 钇(Y)，。

18、 优选为Sm(钐)、 Pr(镨)。 0025 6.根据项25中任一项所述的试剂盒， 其进一步包含染色用缓冲液， 所述染色用 缓冲液为包含0.51(w/v)的封闭蛋白(如牛血清白蛋白)且不含钙镁离子的缓冲液 (优选为pH范围为7.27.4的磷酸盐缓冲液， 更优选为PBS)。 0026 7.根据项26所述的试剂盒， 其进一步包含细胞洗液， 所述细胞洗液(优选为pH范 围为7.27.4的磷酸盐缓冲液， 更优选为PBS)中不含钙镁离子， 优选地， 不含该镁离子的磷 酸盐缓冲液浓度为0.0067M。 0027 8.项27中任一项所述的试剂盒在单个细胞的检测中的应用， 其中， 优选被检测 的细胞中包含红细。

19、胞。 0028 9.浓度25(v/v)的戊二醛溶液在长期保存红细胞中的应用。 0029 10.一种单个细胞元素检测的方法， 包括以下步骤： 0030 利用浓度为25(v/v)， 优选为23(v/v)的戊二醛溶液处理细胞； 0031 使用锇酸的浓度为10-510-4(w/v)， 优选为310-5710-5(w/v)， 更优选为5 10-5710-5(w/v)的染色液标记细胞(其中， 优选细胞的浓度为21064106个/ml)； 0032 使用金属标记抗体(优选为细胞特异性金属标记抗体)标记细胞。 0033 11.根据项10所述的方法， 其进一步包括下述步骤中的一种或多种： 0034 将所述金属标。

20、记抗体溶解于项6中定义的染色缓冲液中； 0035 使用项6中定义的染色缓冲液洗涤细胞； 0036 使用项7中定义的细胞洗液洗涤细胞。 0037 本发明提供的染色液、 试剂盒及其检测方法特别适用于无核细胞特别是红细胞的 单个细胞元素检测， 通过作为染色液利用锇酸溶液， 作为红细胞定型液利用戊二醛溶液、 以 及利用红细胞特异性金属标记抗体， 能够实现红细胞的形态固定、 特异性筛选以及红细胞 细胞膜标记。 0038 需要说明的是， 虽然在细胞检测领域中经常用到四氧化锇溶液作为固定液， 但本 发明使用的溶液中的锇酸的浓度远低于用于进行细胞固定的四氧化锇的浓度， 两者不在一 个数量级上， 利用的锇的性质。

21、也并不相同。 说明书 3/9 页 5 CN 111157433 A 5 附图说明 0039 图1为使用本发明的红细胞定型液处理的红细胞完整性的图。 其中， 0040 图1a是分别使用戊二醛和多聚甲醛(PFA)溶液处理后的情况， 左为戊二醛溶液、 右 为多聚甲醛溶液； 0041 图1b是戊二醛溶液固定的红细胞的扫描电子显微镜下的形态； 0042 图1c是戊二醛溶液固定的红细胞的激光扫描共聚焦显微镜下的明场形态； 0043 图1d是对戊二醛溶液固定的红细胞， 利用激光扫描共聚焦显微镜观察的荧光 (Ter119-PE)形态的图。 0044 图2为不同浓度锇酸的标记效果， 其中， 图2a是用不同浓度锇。

22、酸标记后， 质谱流式 细胞仪检测到的单个细胞比例； 图2b-图2h是分别以浓度为510-6、 10-5、 310-5、 5 10-5、 710-5、 10-4、 510-5(w/v)的锇酸标记的单个细胞二维散点图。 0045 图3为用红细胞定型液处理后的红细胞样品， 其中， (a)为红细胞定型液处理后保 存了15天和150天的样品中的单个细胞比例； (b)和(c)分别为保存15天和150天的单个细胞 二维散点图， (d)-(h)分别为元素78Se、 88Sr、127I、208Pb、209Bi在单个细胞中的分布图。 0046 图4为使用本发明的试剂盒及方法与铱元素标记方法获得的有核细胞检测结果对。

23、 比图。 其中， (a)是利用铱元素标记及本发明的试剂盒标记的白细胞比例图； (b)是暴露于铅 后的含铅白细胞(暴露组)利用铱元素标记及本发明的试剂盒标记得到的细胞比例图。 具体实施方式 0047 为使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚明白， 以下结合具体实施例参照附 图对本发明作进一步的详细说明。 0048 作为本发明的一个方面， 提供了一种戊二醛溶液在长期保存红细胞中的应用， 使 用其保存红细胞的方法例如包括以下步骤： 0049取新鲜的人或动物抗凝全血， 加入其3倍体积的磷酸盐缓冲液(不含钙镁离子)， 混合均匀， 得到单个细胞悬液； 0050向其中逐滴加入为细胞悬液体积4倍的浓度25(。

24、v/v)的戊二醛溶液， 常温 静置10min30min； 0051用磷酸盐缓冲液(不含钙镁离子)通过离心洗涤细胞； 0052细胞冻存： 将细胞悬浮于含有13(w/v)的封闭蛋白(如牛血清白蛋白)且不 含钙镁离子的缓冲液中， 或本领域常用的用于细胞冻存的溶液中， 冻存于-80冰箱。 0053 作为本发明的另一个方面， 提供了一种单个细胞的检测试剂盒及使用其的方法， 所述方法包括如下步骤： 0054取新鲜的人或动物抗凝全血， 加入其3倍体积的磷酸盐缓冲液(不含钙镁离子)， 混合均匀， 得到单个细胞悬液； 0055向细胞悬液中逐滴加入红细胞定型液， 常温静置1030min； 0056用磷酸盐缓冲液(。

25、不含钙镁离子)通过离心洗涤细胞； 0057每种样品取21064106个细胞悬浮于染色缓冲液中， 加入等体积的包含金 属标记抗体的染色缓冲液(其中， 抗体的稀释倍数按照其说明书)， 混合均匀， 室温静置 30min， 随后利用染色缓冲液通过离心洗涤细胞； 说明书 4/9 页 6 CN 111157433 A 6 0058 需要说明的是， 虽然在这里使用了21064106个细胞， 但在细胞浓度为1106 8106个/ml的范围内， 也能够实现本发明的效果； 0059锇酸溶液标记： 将上述细胞全部悬浮于100 l的染色缓冲液中， 加入1ml 10-5 10-4(w/v)锇酸溶液， 同时持续涡旋细胞悬。

26、液， 常温静置10min30min， 随后利用染色缓冲 液通过离心洗涤细胞； 0060利用超纯水通过离心洗涤细胞3次后， 利用质谱流式细胞仪完成单个红细胞中 元素的检测。 0061 红细胞定型液为能够对红细胞进行固定， 且不使红细胞发生破裂的试剂， 优选为 浓度25(v/v)， 更优选为23(v/v)的戊二醛溶液。 0062 进一步地， 本发明的染色液及试剂盒以及红细胞定型液优选在低温保存， 保存条 件例如为28。 0063 分散： 优选在向细胞加入红细胞定型液、 染色液等时利用涡旋或吹打等进行分散。 0064 静置： 如无特殊说明， 均在常温下进行， 只要细胞与上清液达到良好分层即可， 可 。

27、以为1030min。 0065 以上操作如无特殊说明， 均在常温下进行。 0066 洗涤： 能够利用不含钙镁离子的染色缓冲液、 磷酸缓冲液。 0067 离心： 例如在8001200G， 优选为800G下进行， 时间可以为510min。 0068 本发明所述的染色缓冲液为包含0.51(w/v)的封闭蛋白(如牛血清白蛋白)且 不含钙镁离子的pH范围为7.27.4的常用生理缓冲液， 优选所述常用生理缓冲液为磷酸缓 冲液， 例如PBS。 0069 进一步地， 细胞在经过所述步骤1)的处理后悬浮于染色缓冲液中。 该状态下可长 时间例如数月保存于-80冰箱， 最长可保存1年。 0070 细胞经过所述步骤1。

28、)-3)的处理后悬浮于染色缓冲液中， 该状态下可长时间保存 于-80冰箱， 最长可保存1个月。 0071 实施例1 0072 在本实施例中， 比较了戊二醛溶液与多聚甲醛溶液处理对小鼠外周血分离的红细 胞的低温(-80)保存效果。 0073 具体实施过程如下： 0074 1)取5份0.1ml新鲜小鼠(Bal/bc)抗凝全血， 加入0.3ml的PBS(不含钙镁离子， 如无 特殊说明， 下文中均相同)， 混合均匀得到0.4ml单个细胞悬液。 0075 2)向其中分别逐滴加入1.6ml浓度为2、 2.5、 3、 5(v/v)的戊二醛溶液或 1.6ml 4多聚甲醛溶液， 同时持续涡旋细胞悬液， 常温静置。

29、20min。 0076 3)用PBS通过离心(800G， 5min)洗涤细胞2次， 弃上清； 0077 4)将经处理的上述细胞分别悬浮于1ml染色缓冲液(含有1(w/v)的牛血清白蛋 白(BSA， Sigma)的PBS(1xPBS， HyClone)， 且不含钙镁离子， 如无特殊说明， 下文中均相同) 中， 冻存于-80冰箱； 0078 5)2周后取出冻存的细胞， 于室温自然解冻， 离心(800G， 5min)， 弃上清， 观察管中 上清液的颜色， 发红则认为存在红细胞破损的情况。 0079 将2.5(v/v)浓度戊二醛溶液处理的细胞分为2份， 分别利用扫描电子显微镜 说明书 5/9 页 7 。

30、CN 111157433 A 7 (SEM)、 激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察细胞形态。 0080 利用戊二醛和多聚甲醛处理后的上清照片示于图1a。 0081 结果显示： 使用浓度2、 2.5、 3、 5(v/v)的戊二醛溶液处理所得的上清呈无 色透明， 而多聚甲醛溶液处理的上清呈红色。 可初步推测多聚甲醛溶液处理的红细胞经过 冻存解冻过程后破损而释放血红素， 致使上清呈红色(图1a右侧)， 而利用2.5(v/v)的戊 二醛溶液进行处理后， 红细胞经过冻存解冻过程， 仍保持了形态完整(图1a左侧)。 0082 图1b是利用SEM、 图1c和图1d是利用CLSM观察的戊二醛处理的红细胞的形。

31、态。 从图 1b、 图1c和图1d可知， 经过使用含有戊二醛的本发明的红细胞定型液进行处理以及冻存和 解冻后， 红细胞细胞膜保持完整， 整个细胞形态为椭圆形， 能够用于后续的单个细胞检测。 0083 进一步证明了利用浓度2、 2.5、 3、 5(v/v)特别是浓度2.5(v/v)的戊二 醛溶液作为红细胞定型液， 能够实现红细胞长时间的完整保存。 推测其理由是由于戊二醛 溶液通过形成分子间的交联， 影响蛋白构型从而固定细胞形态结构。 0084 实施例2 0085 在本实施例中研究了测定单个细胞元素分布的适用锇酸标记浓度。 0086 1)取血： 准备雌性Balb/c小鼠3只， 取小鼠全血于肝素钠抗。

32、凝管中； 0087 2)将上述全血0.1ml加入0.3ml的PBS中， 混合均匀， 得到0.4ml细胞悬液； 0088 3)向其中逐滴加入1.6ml浓度为2.5(v/v)的戊二醛溶液， 同时持续涡旋细胞悬 液， 常温静置20min； 0089 4)用PBS通过离心(800G， 5min)洗涤细胞2次， 弃上清； 0090 5)将全部细胞悬浮于1ml染色缓冲液中， 保存于-80冰箱； 0091 6)取出冻存的细胞， 于室温自然解冻， 离心(800G， 5min)， 弃上清； 0092 7)取解冻得到的约4106个细胞， 将细胞悬浮于50 l染色缓冲液中， 加入50 l包 含1.1 l抗小鼠Ter。

33、119-154Sm抗体(3154005B， 富鲁达)的染色缓冲液， 混合均匀， 室温静置 30min； 0093 8)用染色缓冲液离心(800G， 5min)洗涤细胞2次， 弃上清， 以每100 l含有约4106 个细胞的密度分散于PBS中； 0094 9)分别向100 l的上述细胞PBS悬液中逐滴加入1ml510-6、 10-5、 310-5、 5 10-5、 710-5、 10-4、 510-5(w/v)的锇酸溶液， 同时持续涡旋细胞悬液， 常温静置 10min； 0095 10)用染色缓冲液通过离心(800G， 5min)洗涤细胞2次， 弃上清； 0096 11)将细胞悬浮于1ml染色缓。

34、冲液中， 保存于-80冰箱； 0097 12)在利用质谱流式细胞仪(Helios)检测单个红细胞中的铅元素前， 将冻存于-80 的细胞自然融化， 利用超纯水通过离心(800G， 5min)洗涤细胞3次后上样。 内参使用 EQbeads。 0098 质谱流式细胞仪检测参数： 0099 细胞悬液进样流速： 3031 l/min， 0100 事件收集速率500事件/s， 0101 EQbeads浓度： 1015， 0102 EQbeads监测元素： 140/142Ce(铈)、 151/153Eu(铕)、 165Ho(钬)、 175/176Lu(镥)； 说明书 6/9 页 8 CN 111157433。

35、 A 8 0103 待测元素： 154Sm(Ter119)、78Se、88Sr、127I、192Os、190Os、208Pb、209Bi。 0104 检测结果如图2所示。 0105 结果： 图2a中， Y轴为使用了7种不同的锇酸浓度进行标记的单个细胞比例， X轴为 锇酸浓度。 其中， 可知510-6锇酸浓度时， 被染色的单个细胞的比例明显低于其他浓度， 证实该浓度染色效果差， 不适于作为单个细胞检测的条件。 0106 图2b-图2h为流式细胞仪的散点图， 图中每一个点代表一个细胞， 颜色深代表细胞 密度高， 颜色浅代表细胞密度低。 散点图进一步证实在锇酸浓度为510-6(w/v)时， 细胞 群。

36、分散， 证实该浓度染色效果差； 在锇酸溶液浓度为510-4(w/v)时， 细胞群上端明显向 右偏移， 提示染色信号过强， 影响单个细胞群的分布和鉴定， 证实该浓度效果也不适于单个 细胞的检测。 0107 综上， 在本发明的染色液中的锇酸工作浓度为10-510-4(w/v)范围时， 与作 为金属标记抗体的红细胞特异性金属标记抗体组合使用， 可得到良好的染色和检测效果。 其中， 在浓度为510-5(w/v)时， 单个细胞分布集中， 并且可以明显看出呈现2个细胞群， 右边的细胞群(以圆圈示出)的锇酸信号大约是左边的2倍， 说明右边细胞群为细胞二聚体， 以此区分单个细胞和二聚体以及多细胞团， 故更优选。

37、。 0108 实施例3 0109 利用红细胞定型液处理的红细胞的经时稳定性。 0110 1)取0.1ml新鲜人的抗凝全血， 加入0.3ml体积的PBS中， 混合均匀， 得到0.4ml细胞 悬液； 0111 2)向其中逐滴加入1.6ml浓度为2.5(v/v)的戊二醛溶液， 同时持续涡旋细胞悬 液， 常温静置20min； 0112 3)用PBS通过离心(800G， 5min)洗涤细胞2次， 弃上清； 0113 4)将全部细胞悬浮于1ml染色缓冲液中， 均分为2份， 保存于-80冰箱， 备用； 0114 5)分别在保存时间为15天和150天时取出一份冻存的细胞， 于室温自然解冻， 离心 (800G，。

38、 5min)， 弃上清， 用于后续标记； 0115 6)取复苏得到约4106个细胞， 将细胞悬浮于50 l染色缓冲液中， 加入50 l包含 1.1 l抗人CD235ab-141Pr抗体(3141001B， 富鲁达)的染色缓冲液， 混合均匀， 室温静置 30min； 0116 7)用染色缓冲液离心(800G， 5min)洗涤细胞2次， 弃上清， 以每100 l含有约4106 个细胞的密度分散于PBS中； 0117 8)向100 l的上述细胞PBS悬液中逐滴加入1ml浓度为510-5(w/v)的锇酸溶液， 同时持续涡旋细胞悬液， 常温静置10min； 0118 9)用染色缓冲液通过离心(800G，。

39、 5min)洗涤细胞2次， 弃上清； 0119 10)将细胞悬浮于1ml染色缓冲液中， 保存于-80冰箱； 0120 11)24h后， 将冻存于-80的细胞自然融化， 利用超纯水通过离心(800G， 5min)洗 涤细胞3次后上样， 利用质谱流式细胞仪(Helios)检测单个红细胞中的镨141Pr(CD235ab)、 硒78Se、 锶88Sr、 碘127I、 锇192Os、 锇190Os、 铅208Pb、 铋209Bi元素。 内参使用EQbeads。 0121 质谱流式细胞仪检测参数： 0122 细胞悬液进样流速： 3031 l/min， 说明书 7/9 页 9 CN 111157433 A 。

40、9 0123 事件收集速率500事件/s， 0124 EQbeads浓度： 1015， 0125 EQbeads监测元素： 140/142Ce(铈)、 151/153Eu(铕)、 165Ho(钬)、 175/176Lu(镥)； 0126 待测元素： 镨141Pr(CD235ab)、 硒78Se、 锶88Sr、 碘127I、 锇192Os、 锇190Os、 铅208Pb、 铋 209Bi。 0127 检测结果如图3(a)(c)所示。 0128 结果： 二维流式散点图显示， 在-80摄氏度保存了15天、 150天的单个细胞群的分布 相似， 无明显差异， 同时二者的单个细胞比例也非常接近， 提示保存。

41、较长时间的红细胞样品 在保存过程中没有发生改变， 证明该试剂盒可以用于长时间保存红细胞样品。 0129 图3(d)(h)分别示出了元素78Se、 88Sr、127I、208Pb、209Bi的单个细胞分布图， 图中 每一个点代表一个细胞， 各单个细胞中的元素含量的值以如每个图右侧的颜色棒所示的颜 色表示， 颜色越接近颜色棒上端的红色， 该点的元素含量越高， 颜色越接近颜色棒下端的深 蓝色， 该点的元素含量越低。 结果显示： 镨、 硒、 锶、 碘、 铋中有少数深红色(非常高)、 橙色(较 高)点， 大部分点为深蓝色(非常低)， 提示在样品中， 这些元素的分布模式为高含量的元素 集中分布于少数红细胞。

42、中， 而对于208Pb元素， 大部分点为浅蓝色(较低)浅黄色(中等)， 提 示在样品中， 铅元素的分布模式为低中等含量的元素分布于大量红细胞中， 与其他元素 具有差异， 且其含量整体高于其他元素， 均量为725counts(信号强度)之间。 0130 实施例4 0131 本发明的染色液试剂盒检测小鼠脾脏白细胞(有核细胞)中的单个细胞的铅分布。 0132 雌性Balb/c小鼠6只， 分为硝酸铅组(3只)和对照组(3只)。 分别从尾静脉注射200 l PBS(对照组)或200 l 5mM硝酸铅溶液(暴露组)； 0133 注射4h后， 解剖小鼠取脾脏， 制备成脾脏单个细胞悬液， 利用红细胞裂解液(红。

43、细 胞裂解液， 索莱宝)裂解红细胞， 得到白细胞悬液； 0134 将上述白细胞悬液平均分为两份， 分别使用本发明的试剂盒及方法(下文称为锇 标记法)进行标记和检测。 即， 分成对照组+锇标记法、 暴露组+锇标记法、 对照组+铱标记法、 暴露组+铱标记法四种样品， 进行下述试验： 0135 对照组+锇标记法、 暴露组+锇标记法 0136 1)取0.4ml白细胞悬液， 向其中逐滴加入1.6ml浓度为2.5(v/v)的戊二醛溶液， 同时持续涡旋细胞悬液， 常温静置20min； 0137 2)用PBS通过离心(800G， 5min)洗涤细胞2次， 弃上清； 0138 3)取4106个细胞， 将细胞悬浮。

44、于50 l染色缓冲液中， 加入50 l包含1.1 l抗小鼠 CD45-147Sm抗体(3147003B， 富鲁达)的染色缓冲液， 混合均匀， 室温静置30min； 0139 4)用染色缓冲液通过离心(800G， 5min)洗涤细胞2次， 弃上清， 以每100 l含有约4 106个细胞的密度分散于PBS中； 0140 5)向100 l的上述细胞PBS悬液中逐滴加入1ml浓度为510-5(w/v)的锇酸溶液， 同时持续涡旋细胞悬液， 常温静置10min； 0141 6)用染色缓冲液通过离心(800G， 5min)洗涤细胞2次， 弃上清； 0142 7)利用超纯水通过离心(800G， 5min)洗涤。

45、细胞3次后上样； 利用质谱流式细胞仪检 测铅元素。 内参使用EQbeads。 说明书 8/9 页 10 CN 111157433 A 10 0143 质谱流式细胞仪(Helios)检测参数 0144 细胞悬液进样流速： 3031 l/min， 0145 事件收集速率500事件/s， 0146 EQbeads浓度： 1015， 0147 EQbeads监测元素： 140/142Ce(铈)、 151/153Eu(铕)、 165Ho(钬)、 175/176Lu(镥)； 待测元素包括： 154钐(Ter119)、 锇192Os、 锇190Os、 铅208Pb。 0148 对照组+铱标记法、 暴露组+铱。

46、标记法 0149 1)取4106个细胞， 将细胞悬浮于50 l染色缓冲液中， 加入50 l包含1.1 l抗小鼠 CD45-147Sm抗体(3147003B， 富鲁达)的染色缓冲液， 混合均匀， 室温静置30min； 0150 2)用染色缓冲液通过离心(800G， 5min)洗涤细胞2次， 弃上清， 以每100 l含有约4 106个细胞的密度分散于PBS中； 0151 3)依照商用试剂盒(201192B， FLUIDIGM)说明书进行铱元素标记； 0152 4)利用质谱流式细胞仪检测铅元素； 内参使用Eqbeads。 0153 质谱流式细胞仪(Helios)检测参数 0154 细胞悬液进样流速：。

47、 3031 l/min， 0155 事件收集速率500事件/s， 0156 EQbeads浓度： 1015， 0157 EQbeads监测元素： 140/142Ce(铈)、 151/153Eu(铕)、 165Ho(钬)、 175/176Lu(镥)； 待测元素包括： 154钐(Ter119)、 铱191Ir、 铱193Ir、 铅208Pb。 0158 检测结果如图4所示， 图4(a)为白细胞中的单个细胞比例： 其中， 在对照组的白细 胞中， 采用锇标记法获得的单细胞比例高于铱标记法， 在暴露组中， 同样地， 采用锇标记法 获得的单细胞比例高于铱标记法。 0159 图4(b)为白细胞中的含铅的单个。

48、细胞比例。 可以看出， 在没有暴露于外源铅的对 照组中， 采用锇标记法能够更加灵敏地检测到小鼠白细胞中的含铅的单个细胞； 在暴露组 中， 锇标记法与铱标记法获得的白细胞中含铅的单个细胞比例相似， 提示锇标记法除了能 够标记红细胞以外， 也为对白细胞进行标记的有效方法。 0160 上述结果说明： 本发明试剂盒及其检测方法也能够用于有核细胞的标记， 另外， 本 发明试剂盒及其检测方法与商业化铱元素的标记具有相当的标记效果。 0161 本发明所述的具体实施例， 对本发明的目的、 技术方案和有益效果进行了进一步 详细说明， 应理解的是， 以上所述仅为本发明的具体实施例而已， 并不用于限制本发明， 凡 。

49、在本发明的精神和原则之内， 所做的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保 护范围之内。 0162 工业实用性 0163 与传统总量检测技术相比， 本发明的染色液、 试剂盒及使用其的检测方法解决了 单个细胞特别是红细胞中平均元素含量的检测问题， 并且通过同时使用多种抗体， 期望实 现同时检测单个红细胞中几十种元素信息， 为科研目的、 环境污染监测提供了技术支持。 本 发明的染色液、 试剂盒及使用其的检测方法通过组合使用了染色液、 金属标记抗体以及红 细胞保存液， 可实现红细胞的长期低温保存后的各种指标测定， 可以广泛应用于科研目的、 重金属污染的环境保护、 监测领域、 生物样品检测， 药品开发等。 说明书 9/9 页 11 CN 111157433 A 11 图1 说明书附图 1/5 页 12 CN 111157433 A 12 说明书附图 2/5 页 13 CN 111157433 A 13 图2 说明书附图 3/5 页 14 CN 111157433 A 14 图3 说明书附图 4/5 页 15 CN 111157433 A 15 图4 说明书附图 5/5 页 16 CN 111157433 A 16 。