靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂及其制备方法与应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010014760.3 (22)申请日 2020.01.07 (71)申请人 山东大学齐鲁医院 地址 250012 山东省济南市历下区文化西 路107号 (72)发明人 李杰孙霄郭鲁商蒙蒙 时丹丹 (74)专利代理机构 济南金迪知识产权代理有限 公司 37219 代理人 杨磊 (51)Int.Cl. A61K 49/22(2006.01) A61K 31/728(2006.01) A61K 9/127(2006.01) A61K 47/54(2017.01) A61K 47。

2、/60(2017.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级 超声造影剂及其制备方法与应用 (57)摘要 本发明涉及一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的 脂质纳米级超声造影剂及其制备方法与应用。 本 发明中的纳米级超声造影剂以脂质为壳膜材料， 壳膜内部包裹有低分子量透明质酸和气态氟碳； 脂质包含二棕榈酰磷脂酰胆碱、 二硬脂酰基磷脂 酰乙醇胺和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二 醇-叶酸； 纳米级超声造影剂的粒径为255 497nm， 能穿过肿瘤组织血管壁间隙， 对于肿瘤的 治疗具有被动靶向性和高效性； 通过PEG链使耦 合的叶酸在脂质壳膜外部， 低。

3、分子量透明质酸包 裹在造影剂内部， 保证纳米级超声造影剂能够通 过叶酸-叶酸受体的方式主动靶向肿瘤相关巨噬 细胞， 并通过低分子量透明质酸作用于肿瘤相关 巨噬细胞， 使其从M2型巨噬细胞转化为M1型巨噬 细胞。 权利要求书1页 说明书8页 附图5页 CN 111150857 A 2020.05.15 CN 111150857 A 1.一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂， 其特征在于， 所述纳米级超 声造影剂以脂质为壳膜材料， 壳膜内部包裹有低分子量透明质酸和气态氟碳； 所述脂质包 含二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇 胺-聚乙。

4、二醇-叶酸(DSPE-PEG-FOL)； 所述纳米级超声造影剂的粒径为255497nm。 2.如权利要求1所述的一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂， 其特征 在于， 所述脂质和低分子量透明质酸的质量比为(510):1。 3.如权利要求1所述的一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂， 其特征 在于， 所述二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)和二硬脂酰基磷 脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEG-FOL)的质量比为(17):(14):(14)。 4.如权利要求1所述的一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂， 其特征 在于， 所述气态。

5、氟碳为全氟丙烷。 5.如权利要求1所述的一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂， 其特征 在于， 所述纳米级超声造影剂的平均粒径为342nm。 6.权利要求15任一项所述的一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂 的制备方法， 其特征在于， 包括步骤如下： (1)将甘油与磷酸盐缓冲液混匀制成水合液， 取丙二醇与水合液混匀后， 按比例加入二 棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺- 聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEG-FOL)， 得混悬液； (2)向步骤(1)的混悬液中通入气态氟碳置换出空气， 水浴加热至脂质完全溶解得乳浊 液； (。

6、3)按比例向步骤(2)脂质完全溶解后的乳浊液中加入低分子量透明质酸， 机械振荡80 100s后静置， 取下层液并用磷酸盐缓冲液稀释后低速离心， 取上层混悬液即得靶向肿瘤 相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂。 7.如权利要求6所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述水合液中甘油和磷酸盐 缓冲液的体积比为1:9； 优选的， 步骤(1)中所述丙二醇和水合液的体积比为1:1。 8.如权利要求6所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)和(3)中所述磷酸盐缓冲液的组 分为： Na2HPO4 8mM， KH2PO4 2mM， pH 7.2； 优选的， 步骤(2)中所述水浴加热的温度为5070。 9。

7、.如权利要求6所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(3)中所述低速离心为200500rpm 离心37min； 优选的， 步骤(3)中所述下层液与稀释用磷酸盐缓冲液的体积比为1:3。 10.权利要求15任一项所述的纳米级超声造影剂联合超声辐照在促进肿瘤相关巨噬 细胞从M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化中的用途。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111150857 A 2 一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂及其制 备方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂及其制备方法 与应用， 属于超声分子影像学技术领域。 背景技术 0002 巨噬细胞。

8、在病理条件下表现出连续的功能激活状态， M1型和M2型用于表示巨噬细 胞活化状态的两个极端， 这两种活化类型在免疫和炎症反应中起相反的作用。 肿瘤相关巨 噬细胞(tumor associated macrophage,TAM)是M2型巨噬细胞的一种特殊类型， 可以促进 肿瘤新生血管形成、 促进细胞外基质的重塑， 从而促进肿瘤的发生和转移， 是肿瘤微环境中 的主要免疫成分， 在原发肿瘤的发生， 转移器官的扩散、 播种和增殖中起着至关重要的作 用。 此外， TAM的密度与肿瘤的进展和预后密切相关。 鉴于巨噬细胞的功能具有可塑性， 与直 接杀死TAM相比， 促进其从M2型(促肿瘤)巨噬细胞转化为M1。

9、型(抗肿瘤)巨噬细胞是更好的 选择。 另外， 与肿瘤细胞相比， TAM在遗传上是稳定的， 因此不易产生放化疗抵抗。 并且， TAM 主要位于肿瘤基质的边缘区域， 易于与通过血液循环到达的治疗药物相互作用。 综上所述， TAM是肿瘤治疗方案中的重要治疗靶点。 0003 常用的几种靶向TAM的分子或受体包括IL-4R， 甘露糖受体和叶酸受体 (folate receptor ,FR )。 但IL-4R也存在于除TAM外的其他免疫细胞如T或B细胞表面， 而甘露糖受 体在内皮细胞亚群中也有高表达。 FR 在人TAM表面高表达， 而在正常组织不表达或低表达， 因此可以选择FR 作为靶向TAM的靶点。 0。

10、004 作为药物输送系统(drug delivery system,DDS)， 纳米级超声造影剂在肿瘤靶向 治疗中具有较大的优势， 其可与医用诊断超声联合进行实时监控， 在特定的时间和位置释 放药物， 并通过超声靶向纳泡破坏(ultrasound targeted nanobubble destruction, UTND)增强细胞对药物的吸收能力。 目前尚未见到TAM靶向的纳米级超声造影剂的相关研 究。 发明内容 0005 针对现有技术的不足， 本发明提供了一种靶向肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的脂质纳 米级超声造影剂及其制备方法， 以脂质为壳膜材料、 全氟丙烷为气体内核制备纳米级超声 造影剂， 。

11、该造影剂显像持久， 能够经医用超声仪靶向爆破， 生物安全性高， 具有较强的肿瘤 相关巨噬细胞(TAM)的靶向结合能力。 0006 本发明还提供了上述靶向肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的脂质纳米级超声造影剂在促 进肿瘤相关巨噬细胞(TAM)从M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化中的用途。 0007 术语说明： 0008 肿瘤相关巨噬细胞： (tumor associated macrophage,TAM)， 是巨噬细胞的一种活 化类型， 是肿瘤微环境中的主要免疫成分。 TAM是M2型巨噬细胞的一种特殊类型， 可以促进 说明书 1/8 页 3 CN 111150857 A 3 肿瘤新生血管形成、 促进细。

12、胞外基质的重塑， 从而促进肿瘤的发生和转移。 0009 低分子量透明质酸： (low molecular weight hyaluronic acid,LMW-HA)， 分子量 在3-10kDa的透明质酸。 0010 DSPE-PEG-FOL： 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸。 0011 DSPE-PEG-FITC： 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-异硫氰酸荧光素。 0012 DPPC： 二棕榈酰磷脂酰胆碱。 0013 HA-FOL-NB： 叶酸修饰的携载低分子量透明质酸的纳米级超声造影剂。 0014 FOL-NB： 叶酸修饰的纳米级超声造影剂。 0015 NB： 无靶向修饰、 未携。

13、载低分子量透明质酸的纳米级超声造影剂。 0016 室温： 具有本领域公知的含义， 一般是指252。 0017 本发明的技术方案如下： 0018 一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂， 所述纳米级超声造影剂以 脂质为壳膜材料， 壳膜内部包裹有低分子量透明质酸和气态氟碳； 所述脂质包含二棕榈酰 磷脂酰胆碱(DPPC)、 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二 醇-叶酸(DSPE-PEG-FOL)； 所述纳米级超声造影剂的粒径为255497nm。 0019 根据本发明优选的， 所述脂质和低分子量透明质酸的质量比为(510):1； 进一步 优选的质量比为7.5:1。

14、。 0020 根据本发明优选的， 所述二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺 (DSPE)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEG-FOL)的质量比为(17):(1 4):(14)； 进一步优选的质量比为7:2:4。 0021 根据本发明优选的， 所述气态氟碳为全氟丙烷。 0022 根据本发明优选的， 所述纳米级超声造影剂的平均粒径为342nm。 0023 本发明中， 所述靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂， 以叶酸为靶向 配体， 以肿瘤相关巨噬细胞表面的叶酸受体 为受体， 进行肿瘤相关巨噬细胞的靶向结合。 叶酸作为靶向配体， 具有亲和力高， 稳定性。

15、好的优点， 叶酸在体内和在储存过程中均以维生 素的形式存在， 容易与多种治疗剂结合， 无免疫原性， 并且能溶解于有机溶剂、 酸和碱。 0024 本发明中， 所述靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂中的低分子量透 明质酸能够促进肿瘤相关巨噬细胞从M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化， 并且这种转化作 用不受巨噬细胞初始激活状态的影响。 透明质酸在水溶性、 生物相容性、 和非免疫原性方面 具有卓越的特性。 0025 上述一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂的制备方法， 包括步骤 如下： 0026 (1)将甘油与磷酸盐缓冲液混匀制成水合液， 取丙二醇与水合液混匀后， 按比例加 入二棕榈。

16、酰磷脂酰胆碱(DPPC)、 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇 胺-聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEG-FOL)， 得混悬液； 0027 (2)向步骤(1)的混悬液中通入气态氟碳置换出空气， 水浴加热至脂质完全溶解得 乳浊液； 0028 (3)按比例向步骤(2)脂质完全溶解后的乳浊液中加入低分子量透明质酸， 机械振 荡80100s后静置， 取下层液并用磷酸盐缓冲液稀释后低速离心， 取上层混悬液即得靶向 说明书 2/8 页 4 CN 111150857 A 4 肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂。 0029 根据本发明优选的， 步骤(1)中所述水合液中甘油和磷酸盐缓冲液的。

17、体积比为1: 9。 0030 根据本发明优选的， 步骤(1)中所述丙二醇和水合液的体积比为1:1。 0031 根据本发明优选的， 步骤(1)和(3)中所述磷酸盐缓冲液的组分为： Na2HPO4 8mM， KH2PO4 2mM， pH 7.2。 0032 根据本发明优选的， 步骤(2)中所述水浴加热的温度为5070； 进一步优选为 65。 0033 根据本发明优选的， 步骤(3)中所述低速离心为200500rpm离心37min； 进一步 优选为300rpm离心5min。 0034 根据本发明优选的， 步骤(3)中所述下层液与稀释用磷酸盐缓冲液的体积比为1: 3。 0035 上述纳米级超声造影剂联。

18、合超声辐照在促进肿瘤相关巨噬细胞从M2型巨噬细胞 向M1型巨噬细胞转化中的用途。 0036 以上本发明制备方法中未特别说明的均按照现有技术。 0037 本发明的技术特点： 0038 本发明制备的纳米级超声造影剂， 以叶酸为靶向配体， 以低分子量透明质酸为药 物制剂， 在制备纳米级超声造影剂时， 将二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、 二硬脂酰基磷脂酰乙 醇胺(DSPE)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEG-FOL)三种脂质溶解于 甘油、 丙二醇、 磷酸盐缓冲液的混合溶液中， 由于甘油性状粘稠， 直接将甘油、 丙二醇、 磷酸 盐缓冲液混合很难得到均一溶液， 从而影响后续加入的脂。

19、质的溶解效果， 因此本发明首先 制备甘油和磷酸盐缓冲液的水合液， 再将水合液与丙二醇混合， 得到的混合溶液稳定均一， 从而达到最佳的脂质溶解效果； 另外， 为了兼顾制备的超声造影剂的纳米范围粒径和超声 增强成像功能， 在机械振荡后取下层液， 弃去粒径过大的纳米级超声造影剂， 再经低速离心 取上层液， 弃去粒径过小的纳米级超声造影剂， 所得纳米级超声造影剂的粒径为255 497nm。 0039 有益效果： 0040 1、 本发明制备的靶向肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的脂质纳米级超声造影剂， 是以脂 质为壳膜材料， 低分子量透明质酸(LMW-HA)和全氟丙烷气体包裹在壳膜内部， 纳米级超声 造影剂的。

20、粒径为255497nm， 平均粒径为342nm(PDI:0.155)， 在纳米级范围内， 能穿过肿瘤 组织血管壁间隙， 具备增强的通透滞留效应， 对于肿瘤的治疗具有被动靶向性和高效性。 0041 2、 本发明制备的靶向肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的脂质纳米级超声造影剂具有持久 的增强显像能力， 增强显像可达到20min， 生物安全性高， 并能够经医用超声诊断仪爆破， 达 到指定部位释放所载药物并通过UTND促进其吸收的目的。 0042 3、 本发明制备的靶向肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的脂质纳米级超声造影剂， 通过PEG 链使耦合的叶酸在脂质壳膜外部， 低分子量透明质酸(LMW-HA)包裹在脂质造。

21、影剂内部， 保 证纳米级超声造影剂能够通过叶酸-叶酸受体的方式主动靶向肿瘤相关巨噬细胞(TAM)， 并 通过低分子量透明质酸(LMW-HA)作用于肿瘤相关巨噬细胞(TAM)， 使其从M2型巨噬细胞转 化为M1型巨噬细胞。 说明书 3/8 页 5 CN 111150857 A 5 0043 4、 本发明利用超声辐照的方式， 可以实现纳米级超声造影剂的靶向显影， 从而实 时监测肿瘤范围。 0044 5、 本发明制备的靶向肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的脂质纳米级超声造影剂联合超声 靶向纳泡破坏(UTND)， 可选择性破坏纳米级超声造影剂， 释放纳米级超声造影剂中的低分 子量透明质酸， 从而促进肿瘤相关。

22、巨噬细胞(TAM)从促肿瘤的M2型巨噬细胞表型转化为抗 肿瘤的M1型巨噬细胞， 为肿瘤治疗提供了一种新策略。 附图说明 0045 图1是纳米级超声造影剂的显微镜照片； 图中， A为光学显微镜照片， B为荧光显微 镜照片； 0046 图2为纳米级超声造影剂的粒径分布图及电位分布图； 图中， A为粒径分布图， B为 电位分布图； 0047 图3为纳米级超声造影剂粒径及聚合物分散性指数(PDI)的变化折线图； 0048 图4为不同浓度条件培养基和不同培养时间mrc1， il10， nos2和tnf基因的表达情 况； 图中， A为使用浓度为100的条件培养基在不同培养时间的基因表达情况， B为使用不 。

23、同浓度的条件培养基培养24h的基因表达情况； 0049 图5为肿瘤相关巨噬细胞模型建立前后的光学显微镜照片； 图中， A为肿瘤相关巨 噬细胞模型建立前的光学显微镜照片， B为肿瘤相关巨噬细胞模型建立后的光学显微镜照 片； 0050 图6为不同纳米级超声造影剂原料对细胞存活率的影响； 图中， A为脂质对细胞存 活率的影响， 横坐标为脂质浓度， 纵坐标为存活率； B为低分子量透明质酸对细胞存活率的 影响， 横坐标为低分子量透明质酸浓度， 纵坐标为存活率； 0051 图7为纳米级超声造影剂在不同时间点的体外显影图像； 0052 图8为纳米级超声造影剂的体外增强成像的相对强度变化情况； 图中， A为成。

24、像相 对强度变化曲线； B为成像相对强度变化柱状图； 0053 图9为造影剂与肿瘤相关巨噬细胞靶向结合情况； 图中， A和E为叶酸修饰的纳米级 超声造影剂(FOL-NB)与肿瘤相关巨噬细胞靶向结合荧光照片及流式细胞检测结果， B和F为 在游离叶酸竞争性抑制情况下叶酸修饰的纳米级超声造影剂(FOL-NB)与肿瘤相关巨噬细 胞靶向结合荧光照片及流式细胞检测结果， C和G为无靶向性的纳米级超声造影剂(NB)与肿 瘤相关巨噬细胞靶向结合荧光照片及流式细胞检测结果， D和H为在游离叶酸竞争性抑制情 况下无靶向性的纳米级超声造影剂(NB)与肿瘤相关巨噬细胞靶向结合荧光照片及流式细 胞检测结果； 0054 。

25、图10为不同处理条件下mrc1， il10， nos2和tnf基因的表达情况； 图中， 横坐标表示 处理条件，“+” 表示有该处理条件，“-” 表示无该处理条件； 0055 图11为不同处理条件下白细胞介素10(IL-10)和肿瘤坏死因子(TNF- )的表达情 况； 图中， A为白细胞介素10(IL-10)的表达情况柱状图， 纵坐标为IL-10的浓度； B为肿瘤坏 死因子(TNF- )的表达情况柱状图， 纵坐标为TNF- 的浓度； 0056 图12为不同处理条件下M2型巨噬细胞表面特异性受体CD206表达水平流式细胞检 测结果。 说明书 4/8 页 6 CN 111150857 A 6 具体实。

26、施方式 0057 下面结合实施例对本发明做进一步说明， 但本发明的保护范围并不仅限于此。 0058 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEG-FOL)购自Avanti公司， 产品 编号880124P； 二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)购自Sigma-Aldrich， 产品编号P0763； 二硬脂酰 基磷脂酰乙醇胺(DSPE)购自Sigma-Aldrich， 产品编号P3531； 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚 乙二醇-异硫氰酸荧光素(DSPE-PEG-FITC)购自西安瑞禧， 产品编号R0055； 低分子量透明质 酸(LMW-HA)购自华熙福瑞达生物有限公司， 产品编号9004-61。

27、-9。 0059 实施例1： 脂质纳米级超声造影剂的制备 0060 一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂的制备方法， 包括步骤如 下： 0061 (1)将甘油与磷酸盐缓冲液以体积比1:9混匀制成水合液， 取0.4mL丙二醇、 0.4mL 水合液置于1.5mL EP管中， 加入脂质， 所述脂质为0.7mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、 0.2mg 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、 0.4mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(DSPE- PEG-FOL)， 另外， 为在荧光显微镜下观察纳米级超声造影剂的结构， 再加入0.1mg二硬脂酰 基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-异硫氰酸荧光素。

28、(DSPE-PEG-FITC)， 得混悬液； 0062 (2)向步骤(1)的混悬液中通入全氟丙烷置换出空气， 将EP管放置于65恒温水浴 锅中加热至脂质完全溶解得乳浊液； 0063 (3)向步骤(2)脂质完全溶解后的乳浊液中加入0.2mL浓度为1mg/mL的低分子量透 明质酸(LMW-HA)溶液， 再次用全氟丙烷置换空气， 机械振荡90s后静置， 取下层液0.5mL移入 15mL离心管中， 加磷酸盐缓冲液至2mL， 300rpm离心5min， 取上层混悬液即得靶向肿瘤相关 巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂。 0064 其中， 磷酸盐缓冲液的组分为： Na2HPO4 8mM， KH2PO4 2mM。

29、， pH 7.2。 0065 取上述制备的纳米级超声造影剂， 稀释后滴加到载玻片上， 通过光学显微镜及荧 光显微镜观察造影剂的表观形貌， 结果如图1所示， 1000光学显微镜下(图1A)可见纳米级 超声造影剂均呈圆形， 分散均匀无聚集， 并具有明确的核-壳结构； 荧光显微镜下(图1B)可 见纳米级超声造影剂的外壳显示为绿色， 验证了脂质(包括DPPC， DSPE和DSPE-PEG2000- FOL)构成纳米级超声造影剂的外壳。 0066 取上述制备的纳米级超声造影剂， 稀释后使用纳米激光粒度仪检测纳米级超声造 影剂的粒径和电位， 结果如图2所示， 纳米级超声造影剂的粒径为255497nm， 平。

30、均粒径为 342nm(聚合物分散性指数PDI： 0.155)， 电位为-10.05mV。 0067 取上述制备的纳米级超声造影剂与含10胎牛血清的RPMI 1640培养基混合并置 于4静置， 分别在不同时间点(1、 2、 4、 6、 8、 10h)取出纳米级超声造影剂， 稀释后使用纳米 激光粒度仪检测纳米级超声造影剂的粒径和PDI， 结果如图3所示， 纳米级超声造影剂的粒 径在4h之内无明显变化， 具有良好的稳定性， 而且其PDI在0.4之内， 表明所制备的纳米级超 声造影剂粒径较均匀。 0068 实施例2： 建立肿瘤相关巨噬细胞模型 0069 通过在条件培养基中培养RAW264.7巨噬细胞来。

31、建立肿瘤相关巨噬细胞模型， 为了 验证RAW264.7巨噬细胞成功活化为肿瘤相关巨噬细胞， 使用光学显微镜观察其形态变化， 并应用实时荧光定量聚合酶链式反应确定肿瘤相关巨噬细胞相关基因mrc1， il10， nos2和 说明书 5/8 页 7 CN 111150857 A 7 tnf的表达是否上调。 收集小鼠Lewis肺癌细胞培养基上清并用0.22 m的膜滤器过滤， 得到 条件培养基。 为了优化RAW264.7巨噬细胞活化为肿瘤相关巨噬细胞的条件， 使用不同浓度 (0， 50， 100)的条件培养基在不同时间点(0、 24、 48、 72h)处理RAW264.7巨噬细胞并进 行基因检测。 00。

32、70 使用浓度为100的条件培养基在不同时间点处理RAW264.7巨噬细胞， 其相关基 因的表达情况如图4A所示， 使用不同浓度的条件培养基处理RAW264.7巨噬细胞24h， 其相关 基因的表达情况如图4B所示， 由图4可知， 随着条件培养基浓度增加和培养时间的延长， 肿 瘤相关巨噬细胞相关基因的表达均明显上调， 证明肿瘤相关巨噬细胞模型成功建立。 0071 最终使用浓度为100的条件培养基培养RAW264.7巨噬细胞48h， 将RAW264.7巨噬 细胞活化为肿瘤相关巨噬细胞。 0072 图5为肿瘤相关巨噬细胞模型建立前后的光学显微镜照片， 显示肿瘤相关巨噬细 胞比未活化的巨噬细胞体积增大。

33、， 并出现了较多 “触角” 。 0073 实施例3： 纳米级超声造影剂生物安全性评价 0074 将实施例2得到的肿瘤相关巨噬细胞以1104个/孔接种于96孔板中， 加入培养 基， 37、 5CO2孵育培养24h后， 进行两组实验， 第一组实验， 将肿瘤相关巨噬细胞的培养 基更换为含有脂质的新鲜培养基， 脂质在新鲜培养基中的浓度分别为25、 50、 100、 200、 300 g/mL， 所含有的脂质又分为两种情况， 一种是所述脂质为二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、 二硬 脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEG-FOL)， 其质量比为7:2:4，。

34、 一种是所述脂质为二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二硬脂酰基磷脂酰乙 醇胺(DSPE)， 其质量比为7:6； 第二组实验， 将肿瘤相关巨噬细胞的培养基更换为含有低分 子量透明质酸(LMW-HA)的新鲜培养基， 低分子量透明质酸(LMW-HA)在新鲜培养基中的浓度 分别为10、 50、 100、 500、 1000、 2000 g/mL； 更换培养基后， 37、 5CO2孵育培养48h， 将培养 基更换为含有10 L CCK-8的新鲜培养基， 继续孵育1.5h， 用酶标仪在450nm波长处检测其光 吸收值， 计算细胞存活率。 0075 计算结果如图6所示， 结果显示当脂质浓度大于等于200 g/。

35、mL时， 细胞活性受到明 显抑制， 而在常用脂质浓度50 g/mL时未出现明显的细胞毒性(细胞存活率90)， 说明脂 质材料纳米级超声造影剂的生物安全性高； 此外， 低分子量透明质酸(LMW-HA)对肿瘤相关 巨噬细胞也无明显毒性， 存活率均超过80。 0076 实施例4： 纳米级超声造影剂体外显影能力测定 0077 将实施例1制备的纳米级超声造影剂置于从塑料手套上剪下的一根手指中， 并用 透析夹夹紧以保持张力， 然后将塑料手指固定在盛有37脱气水的容器中， 采用GE logiqE9超声诊断仪的造影模式， 频率9.0MHz， 机械指数(MI)0.16， 动态范围60dB， 二维与超 声造影模式。

36、同步观察， 以脱气水为对照组。 0078 使用实施例1制备的纳米级超声造影剂进行超声对比增强成像持续30分钟， 并在 不同时间点(0、 1、 2、 5、 10、 20、 30分钟)记录对比增强成像的视频。 在第30分钟， 使用超声扫 描仪上的 “爆破” 按钮(flash)通过超声辐照爆破纳米级超声造影剂。 0079 在每个时间点记录10秒的视频， 并通过超声扫描仪中的 “TIC分析” 功能进行分析。 实施例1制备的纳米级超声造影剂的体外增强成像能力由相对强度表示， 即用同一桢图像 中感兴趣区域的dB值减去背景的dB值得出。 说明书 6/8 页 8 CN 111150857 A 8 0080 纳。

37、米级超声造影剂在不同时间点的体外显影结果如图7所示， 纳米级超声造影剂 的体外增强成像的相对强度变化如图8所示， 在连续超声辐照10分钟内， 纳米级超声造影剂 均具有较高的造影强度， 10分钟后与初始强度相比略微降低， 说明所制备的纳米级超声造 影剂具备出色的体外造影成像能力。 在第30分钟， 按下超声扫描仪上的 “爆破” (flash)按键 后， 感兴趣区域图像造影强度明显增强并持续数秒， 然后图像迅速变为几乎无增强的状态， 表明经 “爆破” 后， 图像的造影强度明显低于 “爆破” 时和 “爆破” 前， 证明大多数纳米级超声 造影剂被超声破坏。 0081 实施例5： 纳米级超声造影剂的靶向能。

38、力分析 0082 将实施例2培养得到的肿瘤相关巨噬细胞以1106个/孔接种于6孔板， 待细胞生 长至5070密度时， 加入叶酸修饰的纳米级超声造影剂(FOL-NB)， 共孵育培养30min 后， 用磷酸盐缓冲液洗去未结合的纳米级超声造影剂； 同时， 以游离叶酸作为竞争抑制剂、 无靶向的纳米级超声造影剂(NB)作为对照； 分别用荧光显微镜及流式细胞仪分析纳米级超 声造影剂的靶向能力。 0083 其中， 叶酸修饰的纳米级超声造影剂(FOL-NB)按照实施例1纳米级超声造影剂的 制备方法制备， 不同之处在于， 未加入低分子量透明质酸(LMW-HA)； 无靶向性的纳米级超声 造影剂(NB)按照实施例1。

39、纳米级超声造影剂的制备方法制备， 不同之处在于， 未加入二硬脂 酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEG-FOL)和低分子量透明质酸(LMW-HA)。 0084 荧光显微镜及流式细胞仪结果显示： 与无靶向性的纳米级超声造影剂(NB)相比， 叶酸修饰的纳米级超声造影剂(FOL-NB)与肿瘤相关巨噬细胞的靶向结合更强(图9A， 9E， 9C， 9G， 10.6v.s.4.31)； 经游离叶酸竞争抑制后， 叶酸修饰的纳米级超声造影剂(FOL- NB)与肿瘤相关巨噬细胞的靶向结合减少(图9A， 9E， 9B， 9F， 10.6v.s.6.45)， 而无靶向 性的纳米级超声造影剂(NB)与肿瘤。

40、相关巨噬细胞的结合不受游离叶酸的影响(图9C， 9G， 9D， 9H， 4.31v.s.4.19)。 说明叶酸修饰的纳米级超声造影剂(FOL-NB)能通过纳米级超 声造影剂外壳上的叶酸与叶酸受体的结合主动靶向肿瘤相关巨噬细胞。 0085 实施例6： 纳米级超声造影剂联合超声辐照促进肿瘤相关巨噬细胞从M2型巨噬细 胞向M1型巨噬细胞的转化 0086 将实施例2培养得到的肿瘤相关巨噬细胞以1106个/孔接种于6孔板， 待细胞生 长至5070密度时， 给予不同处理， 分别为： 将培养基更换为含有低分子量透明质酸的 新鲜培养基(LMW-HA组)； 将培养基更换为含有实施例1制备的纳米级超声造影剂的新鲜。

41、培 养基(HA-FOL-NB组)； 将培养基更换为含有低分子量透明质酸的新鲜培养基并进行超声辐 照(US+LMW-HA组)； 将培养基更换为含有实施例1制备的纳米级超声造影剂的新鲜培养基并 进行超声辐照(US+HA-FOL-NB组)； 以新鲜培养基为对照(CONTROL组)， 超声辐照参数为： 声 强1.0W/cm2， 时间30s。 更换培养基后37、 5CO2继续培养48h， 实时荧光定量聚合酶链式反 应检测M1型和M2型巨噬细胞相关基因表达的改变， 流式细胞术和酶联免疫吸附测定试剂盒 检测相关蛋白表达水平的改变。 0087 M1型和M2型巨噬细胞相关基因的表达情况如图10所示， 其中， n。

42、os2、 tuf为M1型巨 噬细胞相关基因， mrc1、 il10为M2型巨噬细胞相关基因， 结果表明US+HA-FOL-NB组中nos2和 tnf的基因表达明显升高的同时， mrc1和il10的基因表达显著下调。 0088 M2型巨噬细胞相关细胞因子白细胞介素10(IL-10)的酶联免疫吸附测定结果如图 说明书 7/8 页 9 CN 111150857 A 9 11A所示， M1型巨噬细胞相关细胞因子肿瘤坏死因子(TNF- )的酶联免疫吸附测定结果如图 11B所示， 结果显示， US+HA-FOL-NB处理肿瘤相关巨噬细胞， 可以显著降低M2型巨噬细胞相 关细胞因子白细胞介素10的含量， 并。

43、提高M1型巨噬细胞相关细胞因子肿瘤坏死因子的含 量。 0089 采用流式细胞术检测M2型巨噬细胞表面特异性受体CD260的表达水平， 检测结果 如图12所示， US+HA-FOL-NB组的特异性受体CD206的表达明显下调。 0090 以上结果表明， 与单纯应用低分子量透明质酸(LMW-HA)相比， 超声辐照联合低分 子量透明质酸(LMW-HA)仅促进il0基因和特异性受体CD206的表达下调， 而HA-FOL-NB仅下 调细胞因子IL-10的表达。 因此， 单独应用超声辐照或HA-FOL-NB对肿瘤相关巨噬细胞没有 明显的促进转化作用， 而本发明制备的靶向肿瘤相关巨噬细胞的脂质纳米级超声造影剂 (HA-FOL-NB)联合超声辐照可以显著促进肿瘤相关巨噬细胞从M2型巨噬细胞向M1型巨噬细 胞转化。 说明书 8/8 页 10 CN 111150857 A 10 图1 图2 图3 说明书附图 1/5 页 11 CN 111150857 A 11 图4 图5 图6 说明书附图 2/5 页 12 CN 111150857 A 12 图7 图8 说明书附图 3/5 页 13 CN 111150857 A 13 图9 图10 说明书附图 4/5 页 14 CN 111150857 A 14 图11 图12 说明书附图 5/5 页 15 CN 111150857 A 15 。