复合菌剂及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010049688.8 (22)申请日 2020.01.16 (83)生物保藏信息 CGMCC No. 18688 2019.10.15 CGMCC No. 18595 2019.10.15 (71)申请人 中化农业 （临沂） 研发中心有限公司 地址 276000 山东省临沂市经济开发区翔 宇路61号 (72)发明人 邱鹏飞李洪顺张西兴李延锋 柴彦亮 (74)专利代理机构 北京清亦华知识产权代理事 务所(普通合伙) 11201 代理人 肖阳 (51)Int.Cl. C12N。

2、 1/14(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C05F 11/00(2006.01) C05G 1/00(2006.01) C05F 17/20(2020.01) C12R 1/665(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 复合菌剂及其应用 (57)摘要 本发明提出了复合菌剂及其应用， 所述复合 菌剂包括： 泡盛曲霉菌制剂和暹罗芽孢杆菌制 剂， 其中， 所述泡盛曲霉菌制剂中的泡盛曲霉于 2019年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCC No.18595， 所述暹罗芽孢杆菌制剂中的暹罗芽孢 。

3、杆菌于2019年10月15日保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为 CGMCCNo.18688。 本发明的复合菌剂具有较好的 分解纤维素能力， 可有效地应用于秸秆堆肥中， 明显加快堆肥前期起温速度， 提高发酵温度， 堆 肥后秸秆失重率增加， C/N含量降低， 堆肥腐熟程 度高， 适于规模化应用。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图1页 CN 111154661 A 2020.05.15 CN 111154661 A 1.一种复合菌剂， 其特征在于， 包括： 泡盛曲霉菌制剂和暹罗芽孢杆菌制剂， 其中， 所述泡盛曲霉菌制剂中的泡盛曲霉(Aspergillus a。

4、wamori)于2019年10月15日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCC No.18595， 所述暹罗芽孢杆菌制剂中的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)于2019年10月15日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCC No.18688。 2.根据权利要求1所述的复合菌剂， 其特征在于， 所述复合菌剂包括5060重量份的泡 盛曲霉菌制剂和4050重量份的暹罗芽孢杆菌制剂。 3.根据权利要求1所述的复合菌剂， 其特征在于， 所述泡盛曲霉菌制剂中孢子含量不低 于5109个/克， 所述暹罗芽孢杆菌制剂中芽孢含量。

5、不低于11010个/克； 4.根据权利要求1所述的复合菌剂， 其特征在于， 所述复合菌剂中进一步含有辅料， 所 述辅料含有碳酸钙、 草炭土、 豆粕和麦麸的至少之一。 5.根据权利要求1所述的复合菌剂， 其特征在于， 所述泡盛曲霉的培养基含有下列的至 少之一： 草炭土、 麦麸、 豆粕、 土豆浸出液、 葡萄糖、 氯化钠、 磷酸氢二钾、 磷酸二氢钾、 碳酸钙 和水； 任选地， 基于所述培养基的总质量， 所述培养基包括： 2030质量的草炭土、 515质量的麦麸、 1020质量的豆粕、 1030质量的 土豆浸出液、 110质量的葡萄糖、 0.52质量的氯化钠、 0.52质量的磷酸氢二钾、 0.52质量。

6、的磷酸二氢钾、 0.52质量的碳酸钙， 补水至100质量， pH调节为6.8 7.2。 6.根据权利要求1所述的复合菌剂， 其特征在于， 所述暹罗芽孢杆菌的培养基含有下列 的至少之一： 玉米淀粉、 蔗糖、 豆粕、 酵母粉、 蛋白胨、 磷酸氢二钾、 磷酸二氢钾、 碳酸钙、 氯化 钠和消泡剂； 任选地， 基于所述培养基的总质量， 所述培养基包括： 15质量的玉米淀粉、 0.52质量的蔗糖、 26质量的豆粕、 0.10.4质量的 酵母粉、 0.10.5质量的蛋白胨、 0.10.5质量的磷酸氢二钾、 0.10.5质量的磷酸 二氢钾、 0.050.2质量的碳酸钙、 0.050.2质量的氯化钠、 0.10。

7、.5质量的消泡 剂， 补水至100质量， pH调节为6.87.2。 7.权利要求16任一项所述复合菌剂在秸秆堆肥中的应用。 8.一种秸秆堆肥的方法， 其特征在于， 包括： 将权利要求17任一项所述复合菌剂与秸秆进行混合共培养。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 包括： 将秸秆、 水以及任选的尿素进行混合， 使得到的混合料液中碳氮比为(2030)： 1， 水分 含量为5070质量； 将所述复合菌剂按照15质量接种于所述混合料液中进行发酵。 10.一种有机肥料， 其特征在于， 是通过权利要求8或9所述秸秆堆肥的方法得到。 11.权利要求16任一项所述复合菌剂在有机废物好氧堆肥中的应用。。

8、 权利要求书 1/1 页 2 CN 111154661 A 2 复合菌剂及其应用 技术领域 0001 本发明涉及生物领域。 具体地， 本发明涉及复合菌剂及其应用。 背景技术 0002 随着耕作技术的进步， 秸秆的产量越来越多， 但是由于秸秆的利用率不大， 大都都 被焚烧处理， 导致资源的浪费， 同时也引起了环境的污染。 秸秆作为有机肥生产的良好原 料， 由于缺乏成熟、 高效的转化技术， 一直没有充分利用。 将秸秆还田可以充分利用秸秆中 养分资源、 改良土壤。 还田后的秸秆在土壤微生物作用下发生腐解， 秸秆中的纤维素、 半纤 维素和木质素等成分转化为植物易于吸收的简单化合物， 从而改善土壤理化性。

9、质， 提高土 壤肥力， 进而提高作物的产量和质量。 0003 然而， 目前适用于秸秆堆肥的微生物仍有待研究。 发明内容 0004 本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。 为此， 本发明提出了一种复合菌剂， 其具有较好的分解纤维素能力， 可有效地应用于秸秆堆肥中， 明显加快堆肥前期起温速度， 提高发酵温度。 堆肥后秸秆失重率增加， C/N含量降低， 堆肥腐 熟程度高， 适于规模化应用。 0005 在本发明的一个方面， 本发明提出了复合菌剂。 根据本发明的实施例， 所述复合菌 剂包括： 泡盛曲霉菌制剂和暹罗芽孢杆菌制剂， 其中， 所述泡盛曲霉菌制剂中的泡盛曲霉 (Aspe。

10、rgillus awamori)于2019年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心 （北京市朝阳区北辰西路1号院3号） ， 保藏编号为CGMCC No.18595， 所述暹罗芽孢 杆菌制剂中的暹罗芽孢杆菌 (Bacillus siamensis)于2019年10月15日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （北京市朝阳区北辰西路1号院3号） ， 保藏编号为 CGMCC No.18688。 0006 发明人为了获得适用于秸秆堆肥的微生物而进行大量实验筛选， 考虑到秸秆中的 主要成分为纤维素， 于是先以具有高产纤维素酶作为筛选指标， 初筛到了一些菌株。 进一步。

11、 地， 发明人发现， 产纤维素酶量及纤维素酶活性接近的菌株对于秸秆堆肥的作用效果也不 尽相同。 因此， 发明人推断某些菌株可能在秸秆堆肥过程中产生某些代谢物以促进堆肥腐 熟。 同时， 发明人发现， 秸秆堆肥效果好的菌株并不一定对城市污泥或畜禽粪便等堆肥效果 也好， 可能是由于处理物的组成成分有所差异造成的。 进而， 发明人在此基础上进一步优化 筛选获得两株秸秆堆肥效果最佳的微生物泡盛曲霉B-13(Aspergillus awamori)和暹罗 芽孢杆菌(Bacillus siamensis)， 两者不仅具有较好的分解纤维素能力， 而且秸秆堆肥效 果好。 进一步地， 发明人发现， 两者共同作用时。

12、， 秸秆堆肥效果明显好于两者单独作用的效 果累加， 推断可能是一种菌株生长代谢过程中产生促进另一种菌株生长代谢或堆肥的物 质， 从而整体上进一步提升秸秆堆肥效果。 由此， 根据本发明实施例的复合菌剂具有极佳的 秸秆堆肥效果， 可明显加快堆肥前期起温速度， 提高发酵温度。 堆肥后秸秆失重率增加， C/N 说明书 1/9 页 3 CN 111154661 A 3 含量降低， 堆肥腐熟程度高， 适于规模化应用。 0007 根据本发明的实施例， 上述复合菌剂还可以具有下列附加技术特征： 0008 根据本发明的实施例， 所述复合菌剂包括5060重量份的泡盛曲霉菌制剂和40 50重量份的暹罗芽孢杆菌制剂。。

13、 由此， 可以使泡盛曲霉菌制剂和暹罗芽孢杆菌保持较好的 生长代谢状态， 高产纤维素酶， 并协同增进秸秆堆肥效果， 加快堆肥前期起温速度， 提高发 酵温度。 堆肥后秸秆失重率增加， C/N含量降低， 堆肥腐熟程度高， 适于规模化应用。 0009 根据本发明的实施例， 所述泡盛曲霉菌制剂中孢子含量不低于5109个/克， 所述 暹罗芽孢杆菌制剂中芽孢含量不低于11010个/克。 由此， 使得复合菌剂中具有较多的活性 组成， 从而更好地高产纤维素酶， 并提高秸秆堆肥效果。 0010 根据本发明的实施例， 所述复合菌剂中进一步含有辅料， 所述辅料含有碳酸钙、 草 炭土、 豆粕和麦麸的至少之一。 由此， 。

14、以供微生物生长代谢， 并且， 通过控制其添加量以保证 活菌数满足要求。 0011 根据本发明的实施例， 所述泡盛曲霉的培养基含有下列的至少之一： 草炭土、 麦 麸、 豆粕、 土豆浸出液、 葡萄糖、 氯化钠、 磷酸氢二钾、 磷酸二氢钾、 碳酸钙和水。 发明人经过 大量实验得到上述培养基组成， 在此培养基中生长的泡盛曲霉代谢活性高， 可以高产纤维 素酶， 秸秆堆肥效果好， 可明显加快堆肥前期起温速度， 提高发酵温度， 堆肥后秸秆失重率 增加， C/N含量降低， 堆肥腐熟程度高， 适于规模化应用。 0012 根据本发明的实施例， 基于所述培养基的总质量， 所述培养基包括： 2030质量 的草炭土、 。

15、515质量的麦麸、 1020质量的豆粕、 1030质量的土豆浸出液、 110 质量的葡萄糖、 0.52质量的氯化钠、 0.52质量的磷酸氢二钾、 0.52质量的磷 酸二氢钾、 0.52质量的碳酸钙， 补水至100质量， pH调节为6.87.2。 发明人经过大 量实验得到上述较优配比， 由此， 以进一步提高纤维素酶的产量及活性， 提高秸秆堆肥效 果。 0013 根据本发明的实施例， 所述暹罗芽孢杆菌的培养基含有下列的至少之一： 玉米淀 粉、 蔗糖、 豆粕、 酵母粉、 蛋白胨、 磷酸氢二钾、 磷酸二氢钾、 碳酸钙、 氯化钠和消泡剂。 发明人 经过大量实验得到上述培养基组成， 在此培养基中生长的暹罗。

16、芽孢杆菌代谢活性高， 可以 高产纤维素酶， 秸秆堆肥效果好， 可明显加快堆肥前期起温速度， 提高发酵温度， 堆肥后秸 秆失重率增加， C/N含量降低， 堆肥腐熟程度高， 适于规模化应用。 0014 根据本发明的实施例， 基于所述培养基的总质量， 所述培养基包括： 15质量的 玉米淀粉、 0.52质量的蔗糖、 26质量的豆粕、 0.10.4质量的酵母粉、 0.10.5 质量的蛋白胨、 0.10.5质量的磷酸氢二钾、 0.10.5质量的磷酸二氢钾、 0.05 0.2质量的碳酸钙、 0.050.2质量的氯化钠、 0.10.5质量的消泡剂， 补水至100质 量， pH调节为 6.87.2。 发明人经过。

17、大量实验得到上述培养基组成， 在此培养基中生长 的暹罗芽孢杆菌代谢活性高， 可以高产纤维素酶， 秸秆堆肥效果好， 可明显加快堆肥前期起 温速度， 提高发酵温度， 堆肥后秸秆失重率增加， C/N含量降低， 堆肥腐熟程度高， 适于规模 化应用。 0015 在本发明的又一方面， 本发明提出了前面所述复合菌剂在有机废物好氧堆肥中的 应用。 根据本发明实施例的复合菌剂具有高产纤维素酶能力， 堆肥效果好， 明显加快堆肥前 期起温速度， 提高发酵温度， 堆肥后有机废物失重率增加， C/N含量降低， 堆肥腐熟程度高， 说明书 2/9 页 4 CN 111154661 A 4 适于规模化应用。 0016 本领域。

18、技术人员能够理解的是， 前面针对复合菌剂所描述的特征和优点， 同样适 用于该应用， 在此不再赘述。 0017 在本发明的另一方面， 本发明提出了前面所述复合菌剂在秸秆堆肥中的应用。 如 前所述， 根据本发明实施例的复合菌剂具有高产纤维素酶能力， 秸秆堆肥效果好， 明显加快 堆肥前期起温速度， 提高发酵温度， 堆肥后秸秆失重率增加， C/N含量降低， 堆肥腐熟程度 高， 适于规模化应用。 0018 本领域技术人员能够理解的是， 前面针对复合菌剂所描述的特征和优点， 同样适 用于该应用， 在此不再赘述。 0019 在本发明的又一方面， 本发明提出了一种秸秆堆肥的方法。 根据本发明的实施例， 所述方。

19、法包括： 将前面所述复合菌剂与秸秆进行混合共培养。 由此， 根据本发明实施例的方 法可以提高秸秆堆肥效果， 明显加快堆肥前期起温速度， 提高发酵温度， 堆肥后秸秆失重率 增加， C/N含量降低， 堆肥腐熟程度高， 适于规模化应用。 0020 根据本发明的实施例， 所述方法包括： 将秸秆、 水以及任选的尿素进行混合， 使得 到的混合料液中碳氮比为(2030)： 1， 水分含量为5070质量； 将所述复合菌剂按照1 5 质量接种于所述混合料液中进行发酵。 由此， 在发酵过程中暹罗芽孢杆菌和泡盛曲霉 能够高效代谢纤维素酶以将秸秆中的纤维素、 半纤维素和木质素分解为小分子物质， 从而 易于植物吸收， 。

20、改善土壤理化性质， 提高土壤肥力， 从而提高作物的产量和质量。 0021 本领域技术人员能够理解的是， 前面针对复合菌剂所描述的特征和优点， 同样适 用于该秸秆堆肥的方法， 在此不再赘述。 0022 在本发明的又一方面， 本发明提出了一种有机肥料。 根据本发明的实施例， 所述有 机肥料是通过前面所述秸秆堆肥方法所得到的。 由此， 根据本发明实施例的有机肥料中纤 维素、 半纤维素和木质素已被分解为小分子物质， 使得该有机肥料易于植物吸收， 改善土壤 理化性质， 提高土壤肥力， 从而提高作物的产量和质量。 0023 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出， 部分将从下面的描述中变 得明显，。

21、 或通过本发明的实践了解到。 附图说明 0024 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得 明显和容易理解， 其中： 0025 图1显示了根据本发明一个实施例的暹罗芽孢杆菌的系统发育树示意图； 0026 图2显示了根据本发明一个实施例的泡盛曲霉的系统发育树示意图。 具体实施方式 0027 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。 本领域技术人员将会理解， 下面的 实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限定本发明的范围。 实施例中未注明具体技术或条 件的， 按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。 所用试剂或仪 器未注明生产厂商者， 均为可以通过市。

22、购获得的常规产品。 0028 实施例1 说明书 3/9 页 5 CN 111154661 A 5 0029 1、 菌株分离与筛选 0030 (1)产纤维素酶菌株的分离： 在中化农业临沂研发中心试验田中搜集腐烂秸秆以 及畜禽粪便， 称取1g放入100ml无菌水中， 150rpm， 30条件下振荡30min， 然后进行梯度稀 释至105， 选取3个梯度进行涂布， 每个梯度3个平行， 在30培养箱中培养2d后选取不同菌 落形态的菌株在LB培养基上划线， 定期观察菌落生长情况。 然后采用平板划线法， 纯化菌 株， 分别编号保存。 0031 (2)产纤维素酶菌株的筛选： 采用平板水解圈法， 制备LB培养。

23、基(添加羧甲基纤维 素钠)， 用牙签将(1)中分离保存到的菌株移植在平板中央， 30恒温培养48h后吸取2的 刚果红溶液5ml加入平皿中， 20分钟后冲洗干净， 观察菌落周围有无水解圈。 0032 根据水解圈大小筛选获得5株水解圈较大的菌株， 其中畜禽粪便三株编号为： A-2、 A-3 和A-5； 腐烂秸秆两株： B-13和B-14， 这些菌株在不同培养时间(24h、 36h、 48h、 60h) 下 水解圈直径和菌落直径参见表1。 0033 表1不同培养时间菌株水解圈及菌落直径 0034 0035 (3)以步骤(2)筛选获得的5株菌株作为实验菌株进行如下秸秆堆肥研究： 0036 1)小麦秸秆。

24、制备： 从田间选取新鲜小麦秸秆， 晒干， 剪切成1cm左右的小段， 烘干备 用。 0037 2)摇瓶培养： 配制LB液体培养基， 于500ml三角瓶中装入250ml培养液， 同时加入 10g制备步骤1)获得的小麦秸秆， 灭菌， 冷却后分别接种初筛获得的5株菌株， 在45， 170rpm条件下培养7天。 0038 3)失重率测定： 将上述培养完成的小麦秸秆， 用四层纱布过滤， 冲洗干净， 烘干称 重， 记作m1， 失重率()m1/10g， 该结果即为菌株对秸秆的失重率， 以不接种菌株的处理 为空白对照。 0039 计算公式为： 说明书 4/9 页 6 CN 111154661 A 6 0040 。

25、(1)秸秆失重率()(W1-W2)/W1100 0041 (2)小麦秸秆的失重率()菌株处理的小麦秸秆失重率-空白对照的小麦秸秆 失重率。 其中， W1为秸秆降解前质量， W2为秸秆降解后质量。 0042 最终， 选择小麦秸秆失重率最高的两株菌株作为目标菌株， 即菌株B-13和A-2， 其 失重率分别高达12和9.5， 具有较好的秸秆堆肥效果。 0043 表2小麦秸秆失重率 0044 A-2 A-3 A-5 B-13 B-14 失重率() 9.5 6.5 7.4 12 5.8 0045 实施例2 0046 1、 菌株A-2的鉴定 0047 (1)微生物学特性： LB培养基上37培养2d形成大小。

26、4mm左右的菌落、 边缘整齐、 凸 起、 白色粘性半透明。 最适生长温度37， 耐盐(NaCl)浓度为14， 生长pH为4.0-9.0， 最适 为7.0。 0048 (2)分子生物学特性： 由分子生物学16SrDNA序列形成的菌株系统发育树显示， 该 菌株与Bacillus siamensis strain XSG14同源性最为接近， 故经分子生物学鉴定和微生 物学特性分析， 初步认定该菌株为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。 0049 该菌株16SrDNA序列如下， 系统发育树参见图1。 0050 TCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGG。

27、AACGTATTCACCGCGGCATG CTGATCCGCG ATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCC GAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGG CTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTC TGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGA TGATTTGACGTCATC CCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGG C AACTAAGATCAAGGGTGGCGCTCGTTGCGGGACTTAA。

28、CCCAACATCTCACGACACG AGCTGACGACAACCATGCA CCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTC TAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTT CTTCGCGTTGCTTCGAATTAAA CCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTC TTGCG ACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAA CCCCCTAACACT TAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTAC。

29、CAGGGTATCTAATCCTGT TCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCG TCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCC ACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGG AATTCCACTCTCCT CTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTT CA CATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACG CTTGCCACCTACGTATTAC CGCGGCTGCTGGCACGTAGTT。

30、AGCCGTGGCTTTCTGGTTA GGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTAC TTGTTCTTCCCTAACAACAGAGC TTTACGATCCGAAAATTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCG TCCATTG CGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTG TGGCCGATC ACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCA CCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCC ATCTGTAAGTGGT。

31、AGCCGAAGCCACCTTTTAT GTTTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCG GTTTCCCGGAGTTATC CCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCG(SEQ ID NO： 1) 0051 2、 菌株B-13的鉴定 0052 (1)微生物学特性： 在PDA培养基上菌落生长迅速， 平坦， 质地粉粒状， 表面暗褐色， 无渗出液， 菌落反面呈不同程度的橙黄色， 具辐射状沟纹， 生孢子球形或近球形， 直径3.5 5 m， 壁粗糙。 说明书 5/9 页 7 CN 111154661 A 7 0053 。

32、(2)分子生物学特性： 0054 该菌株ITS序列如下， 系统发育树参见图2。 由此， 鉴定出该菌株为泡盛曲霉 (Aspergillus awamori)。 0055 AACGGGAGGGCGGGTCTTTGGGCAACCTCCCATCCGTGTCTATTGTACCCTGTTGCTT CGGCGGGCC CGCCGCTTGTCGGCCGCCGGGGGGGCGCCTCTGCCCCCCGGGCCCGTG CCCGCCGGAGACCCCAACACGAACACT GTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGA ATGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGT。

33、TCCGGC ATCGATGAAGAAC GCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTG AAC GCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTG CCCTCAAGCCCGGCTTGTGT GTTGGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCC GAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGT ATGGGGCTTTGTCACATGC TCTGTAGGATTGGCCGGCGCCTGCCGACGTTTTCCAACCATT。

34、CTTTCCAGGTTGAC CT CGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAAGCCGGAGGAATTTT CTTCCTTTT(SEQ ID NO： 2) 0056 实施例3微生物菌剂的制备 0057 1、 暹罗芽孢杆菌制剂的制备 0058 步骤1： 将平皿中保存的暹罗芽孢杆菌株A-2， 用接种环接种至含有250ml LB培养 液的三角瓶中， 30、 170rpm于恒温培养箱中培养36h。 0059 步骤2： 将上述发酵菌液接种至中试发酵罐中(10L50L500L)， 37培养， 发酵 完成后进行喷雾干燥， 分装， 活菌数为100-150亿/g。 。

35、与碳酸钙混合复配， 形成活菌数为100 亿/g的菌粉， 即制得用于堆肥使用的暹罗芽孢杆菌A-2菌剂。 中试培养基配方为： 玉米淀粉 3， 蔗糖1， 豆粕4.5， 酵母粉0.2， 蛋白胨0.2， 磷酸氢二钾、 磷酸二氢钾各0.3， 碳 酸钙、 氯化钠0.1， 消泡剂0.3， 补水至100质量， pH调节为7.0。 0060 2、 泡盛曲霉菌制剂的制备 0061 步骤1： 将平皿中保存的泡盛曲霉B-13菌株， 打菌饼， 接种至含有250ml PDA培养液 的三角瓶中， 30， 170rpm， 于恒温培养箱中培养3天。 0062 步骤2： 将上述发酵菌液按5(v/w)的比例接种至固体培养基中， 28。

36、培养三天， 将其烘干粉碎， 与麦麸混合形成活菌数为50亿/g的泡盛曲霉B-13菌粉， 即制得用于堆肥使 用的泡盛曲霉B-13菌剂。 固体培养基配方为： 草炭土25， 麦麸10， 豆粕15， 土豆浸出液 20， 葡萄糖5， 氯化钠、 磷酸氢二钾、 磷酸二氢钾、 碳酸钙各1， 补水至 100， pH调节为 7.0。 0063 3、 复合菌剂的制备 0064 根据上述1和2制备的暹罗芽孢杆菌和泡盛曲霉菌制剂， 按表3的比例进行混合， 重 量份组成为泡盛曲霉菌粉制剂5060份， 暹罗芽孢杆菌菌粉制剂4050份， 即得一种用于 秸秆腐熟的复合菌剂。 0065 表3菌剂复配比例 0066 比例 泡盛曲霉(。

37、份) 暹罗芽孢杆菌(份) 比例1 50 50 比例2 60 40 比例3 45 55 0067 实施例4复合菌剂的应用 说明书 6/9 页 8 CN 111154661 A 8 0068 下面以玉米秸秆为例， 说明本发明微生物菌剂在高温好氧堆肥上的应用。 0069 高温好氧堆肥物料为玉米秸秆， 添加尿素调节C/N比约为25:1， 加水混匀， 控制水 分在55左右， 按2比例接种实施例3制备的复合菌剂(共3种比例)， 充分混合后进行堆置 发酵。 同时以不添加本发明的微生物接种剂为对照。 堆肥时间为60d， 每天检测堆体温度， 间 隔7d翻堆一次， 待堆温达到65时翻堆； 每7d采用多点四分法取样。

38、检测堆肥腐熟度指标， 对 堆肥结束时样品还检测其养分等理化指标。 结果见表46。 0070 根据表4和表5可知， 该复合菌剂可明显促进堆肥前期起温速度， 提高发酵温度， 延 长高温持续时间。 堆肥后秸秆失重率增加， C/N降低， 含水率减少， 堆肥腐熟程度高。 结果说 明该复合菌剂有利于秸秆高温好氧堆肥， 提高发酵效率， 其中按比例2复配的效果最佳， 即 泡盛曲霉菌粉制剂60份， 暹罗芽孢杆菌菌粉制剂40份。 0071 根据表6可知， 采用本发明制备的复合菌剂对秸秆进行高温堆制的有机肥料各项 指标均优于国家标准， 且明显优于对照组处理。 说明按照三种比例制备的复合菌剂均可用 于秸秆类有机肥的制。

39、作。 0072 表4复合菌剂对堆肥温度的影响 0073 0074 0075 表5复合菌剂对秸秆腐熟度的影响 说明书 7/9 页 9 CN 111154661 A 9 0076 0077 表6有机肥检测结果 0078 0079 0080 在本说明书的描述中， 参考术语 “一个实施例” 、“一些实施例” 、“示例” 、“具体示 例” 、 或 “一些示例” 等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、 结构、 材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。 在本说明书中， 对上述术语的示意性表述不 必须针对的是相同的实施例或示例。 而且， 描述的具体特征、 结构、 材料或者特点可以在任 说明。

40、书 8/9 页 10 CN 111154661 A 10 一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。 此外， 在不相互矛盾的情况下， 本领域的技 术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结 合和组合。 0081 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例， 可以理解的是， 上述实施例是示例 性的， 不能理解为对本发明的限制， 本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述 实施例进行变化、 修改、 替换和变型。 说明书 9/9 页 11 CN 111154661 A 11 SEQUENCE LISTING 中化农业 （临沂） 研发中心有限公司 复合菌剂及其应用 P。

41、IDC3196463 2 PatentIn version 3.5 1 1325 DNA Artificial Sequence 1 1 tctcgtggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg 60 atccgcgatt actagcgatt ccagcttcac gcagtcgagt tgcagactgc gatccgaact 120 gagaacagat ttgtgggatt ggcttaacct cgcggtttcg ctgccctttg ttctgtccat 180 tgtagcacgt gtgtagccca 。

42、ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt 240 cctccggttt gtcaccggca gtcaccttag agtgcccaac tgaatgctgg caactaagat 300 caagggtggc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac 360 catgcaccac ctgtcactct gcccccgaag gggacgtcct atctctagga ttgtcagagg 420 atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaat。

43、t aaaccacatg ctccaccgct 480 tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt tcagtcttgc gaccgtactc cccaggcgga 540 gtgcttaatg cgttagctgc agcactaagg ggcggaaacc ccctaacact tagcactcat 600 cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgttcg ctccccacgc tttcgctcct 660 cagcgtcagt tacagaccag agagtcgcct tcgccactgg tgttcctcca catctct。

44、acg 720 catttcaccg ctacacgtgg aattccactc tcctcttctg cactcaagtt ccccagtttc 780 caatgaccct ccccggttga gccgggggct ttcacatcag acttaagaaa ccgcctgcga 840 gccctttacg cccaataatt ccggacaacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg 900 gcacgtagtt agccgtggct ttctggttag gtaccgtcaa ggtaccgccc tattcgaacg 960 gtacttgttc t。

45、tccctaaca acagagcttt acgatccgaa aattcatcac tcacgcggcg 1020 ttgctccgtc agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt 1080 ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct acgcatcgtt 1140 gccttggtga gccgttacct caccaactag ctaatgcgcc gcgggtccat ctgtaagtgg 1200 tagccgaagc caccttttat gtttga。

46、acca tgcggttcaa acaaccatcc ggtattagcc 1260 ccggtttccc ggagttatcc cagtcttaca ggcaggttac ccacgtgtta ctcacccgtc 1320 cgccg 1325 2 585 序列表 1/2 页 12 CN 111154661 A 12 DNA Artificial Sequence 2 2 aacgggaggg cgggtctttg ggcaacctcc catccgtgtc tattgtaccc tgttgcttcg 60 gcgggcccgc cgcttgtcgg ccgccggggg ggcgcctc。

47、tg ccccccgggc ccgtgcccgc 120 cggagacccc aacacgaaca ctgtctgaaa gcgtgcagtc tgagttgatt gaatgcaatc 180 agttaaaact ttcaacaatg gatctcttgg ttccggcatc gatgaagaac gcagcgaaat 240 gcgataacta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg agtctttgaa cgcacattgc 300 gccccctggt attccggggg gcatgcctgt ccgagcgtca ttgctgccct caagcc。

48、cggc 360 ttgtgtgttg ggtcgccgtc cccctctccg gggggacggg cccgaaaggc agcggcggca 420 ccgcgtccga tcctcgagcg tatggggctt tgtcacatgc tctgtaggat tggccggcgc 480 ctgccgacgt tttccaacca ttctttccag gttgacctcg gatcaggtag ggatacccgc 540 tgaacttaag catatcaata aagccggagg aattttcttc ctttt 585 序列表 2/2 页 13 CN 111154661 A 13 图1 图2 说明书附图 1/1 页 14 CN 111154661 A 14 。