杀线虫活性物质及其制备方法和用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010029502.2 (22)申请日 2020.01.13 (71)申请人 广西大学 地址 530007 广西壮族自治区南宁市西乡 塘区大学东路100号 (72)发明人 吴海燕王冬亚周勋波何琼 (74)专利代理机构 南宁市吉昌知识产权代理事 务所(普通合伙) 45125 代理人 林鹏 (51)Int.Cl. C07C 69/704(2006.01) A01N 37/36(2006.01) A01P 5/00(2006.01) C12P 7/62(2006.01) C12N。

2、 1/14(2006.01) C12R 1/66(2006.01) (54)发明名称 一种杀线虫活性物质及其制备方法和用途 (57)摘要 本发明提供了一种从日本曲霉Aspergillus japonicusZW1的次级代谢物产品中制备得到杀 线虫活性物质， 本发明对能产生毒杀线虫活性物 质的日本曲霉AspergillusjaponicusZW1进行 液体发酵培养， 得到含有杀线虫活性代谢产物的 发酵培养液， 再从发酵培养液中获得粗提物， 再 进一步纯化得到杀线虫活性物质， 本发明所提供 的杀线虫活性物质稳定性强， 对根结线虫有很强 的毒杀活性， 在1.25mg/mL浓度下48h根结线虫的 死亡。

3、率90以上， 2mg/mL浓度下6h根结线虫死亡 率100； 同时， 2mg/mL浓度下48h大豆孢囊线虫 死亡率100。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 111153797 A 2020.05.15 CN 111153797 A 1.一种杀线虫活性物质， 其特征在于， 所述杀线虫活性物质为柠檬酸二甲酯盐酸盐， 所 述杀线虫活性物质的结构式如下结构式( )所述： 2.权利要求1所述杀线虫活性物质的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)对能产生杀线虫活性物质的日本曲霉Aspergillus japonicus ZW1进行液体发酵 培养， 得到含有杀线虫活性代谢产物的发酵培养。

4、液； 所述日本曲霉Aspergillus japonicus ZW1菌株保藏在中国典型培养物保藏中心， 保藏号为CCTCC NO.M2014641； (2)将发酵培养液过滤后浓缩至原体积的1/16， 再使用正丁醇或乙酸乙酯萃取， 萃取后 通过旋蒸去除溶剂正丁醇或乙酸乙酯， 得到杀线虫活性物质的粗提物； 得到的粗提取物用 醇如甲醇或乙醇重结晶得到纯品。 3.按照权利要求2所述的制备方法， 其特征在于： 步骤(1)中将日本曲霉Aspergillus japonicus ZW1接种到液体培养基中进行液体发酵； 所述液体培养基的组分包括： KNO3 2g/ L， KCl 0.5g/L， FeSO4 0。

5、.01g/L， K2HPO4 1g/L， MgSO4 0.5g/L， 蔗糖30g/L； 液体培养基pH7。 4.按照权利要求3所述的制备方法， 其特征在于： 所述液体发酵培养的条件为： 温度26 30， 转速130170r/min。 震荡培养1216d。 5.按照权利要求3所述的制备方法， 其特征在于： 所述液体发酵培养的条件为： 温度28 ， 转速150r/min， 震荡培养14d。 6.权利要求1所述的杀线虫活性物质在植物害虫生物防治方面的用途。 7.按照权利要求6所述的用途， 其特征在于： 所述植物害虫为植物寄生线虫。 8.按照权利要求6所述的用途， 其特征在于： 所述植物害虫为根结线虫。

6、和/或大豆孢囊 线虫。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111153797 A 2 一种杀线虫活性物质及其制备方法和用途 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及一种杀线虫活性物质， 具体地， 涉及一种从日本曲 霉 Aspergillus japonicus ZW1的次级代谢物产品中制备得到杀线虫活性物质， 以及这种 杀线虫活性物质的制备方法及其在植物生物防治害虫方面的用途。 背景技术 0002 根结线虫病是世界性分布的病害， 是当前中国最重要的作物病害之一， 经济危害 极大。 1855年Berkeley首次在黄瓜上发现根结以来， 植物根结线虫病才开始受到人们的重 视， 到现在其发。

7、生和为害已有150多年的历史。 近年来， 随着蔬菜栽培面积迅速发展、 周年种 植及远距调运， 为根结线虫病的发生、 发展和传播提供了适宜的环境， 造成土壤中的根结线 虫迅猛增殖， 以致 “年年种大棚， 棚棚有线虫” ， 成为蔬菜生产上的一大障碍。 给棚室蔬菜生 产造成极大的经济损失， 严重影响农业生产和农民收入。 根结线虫病一旦在棚室内发生则 长期存在， 很难彻底铲除， 一般造成减产2030， 重者50以上， 甚至绝收。 由于该线虫寄 主范围广， 给防治带来很大困难。 此外， 根结线虫危害还增加了根腐病及枯萎病等土传性真 菌病害和部分细菌病害的发生几率， 已成为当前蔬菜生产的一大障碍。 黑龙江。

8、、 辽宁、 北京、 河南、 湖北、 江苏、 云南和海南等地都有过根结线虫病严重发生和流行的报道。 在我国危害 严重的根结线虫主要有南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、 花生根结线虫 (Meloidogyne arenaria)、 北方根结线虫(Meloidogyne hapla)和爪哇根结线虫 (Meloidogyne javanica)。 0003 大豆孢囊线虫病是大豆上的主要病害之一， 世界各大豆产区均有发生。 我国的东 北和黄淮海大豆主要产区， 如辽宁、 吉林、 黑龙江、 山西、 河南、 山东、 安徽等省普遍发生， 危 害严重和制约了我国大豆生产。 该病一般使大豆。

9、减产1020， 重者可达3050， 某 些产区因大面积发生而毁种。 大豆孢囊线虫是一种定居型内寄生线虫， 专性寄生， 寄主范围 比较窄， 主要是豆科植物如大豆、 赤豆、 菜豆、 绿豆、 豌豆等。 线虫自身蠕动距离有限， 主要通 过农事耕作、 田间水流或借风携带传播， 也可混入未腐熟堆肥或种子携带远距离传播。 0004 长期以来， 植物线虫病害的防治主要依赖化学杀线剂， 但杀线剂多为高毒、 高残留 药剂， 杀死土壤中植物寄生线虫的同时， 也杀死了有益生物， 严重破坏生态平衡， 污染环境， 威胁人类的健康。 而生物防治被广泛认为是一种有前景的防病途径， 因此， 从生物源获得对 植物寄生线虫具有高毒。

10、杀活性物质， 对开发新型环境友好杀线虫农药具有十分重要的意 义。 微生物的代谢产物种类繁多， 且能够大批量生产， 周期短， 经济效益优于植物源的产物， 人们倾向于开发利用微生物的代谢产物， 微生物的代谢产物在医学领域和农业生产上被广 泛应用， 利用生防菌株防治植物线虫病害是一种重要的治理途径。 目前， 已经商业化的生防 菌株种类有很多， 如淡紫色拟青霉、 厚垣孢普可尼亚菌、 坚强芽孢杆菌、 荧光假单胞菌、 阿维 链霉菌等， 其中的厚垣孢普可尼亚菌和淡紫拟青霉在中国被商业化生产使用。 因此， 微生物 的代谢产物的分离提取与鉴定具有重要意义。 说明书 1/6 页 3 CN 111153797 A 。

11、3 发明内容 0005 针对上述的背景技术， 本发明提供了一种从日本曲霉的次级代谢物产品中制备得 到杀线虫活性物质， 以及这种杀线虫活性物质的制备方法及其在植物害虫生物防治方面的 用途。 0006 本申请的发明人筛选得到一株日本曲霉Aspergillus japonicus ZW1， 其代谢产 物对根结线虫有毒杀作用， 本发明申请人已经在2014年12月10日将该菌株提交给中国典型 培养物保藏中心保藏， 保藏号为CCTCC NO.M2014641， 并在2015年1月30日申请了发明专利， 申请号为201510052458.6。 0007 本发明的目的在于提供一种从日本曲霉Aspergillu。

12、s japonicus ZW1中提取的杀 线虫活性物质， 所述日本曲霉Aspergillus japonicus ZW1保藏在中国典型培养物保藏中 心， 保藏号为CCTCC NO.M2014641。 0008 所述杀线虫活性物质为柠檬酸二甲酯盐酸盐， 其结构式如下结构式( )所述： 0009 0010 0011 本发明的第二个目的在于提供所述杀线虫活性物质的制备方法， 包括以下步骤： 0012 (1)对日本曲霉Aspergillus japonicus ZW1进行液体发酵培养， 得到含有杀虫活 性代谢产物的发酵培养液； 所述日本曲霉Aspergillus japonicus ZW1保藏在中国典。

13、型培 养物保藏中心， 保藏号为CCTCC NO.M2014641； 0013 (2)将发酵培养液过滤后浓缩至原体积的1/16， 再使用正丁醇或乙酸乙酯萃取， 萃 取后通过旋蒸去除溶剂正丁醇或乙酸乙酯， 得到杀线虫活性物质的粗提物； 0014 得到的粗提物用醇如甲醇或乙醇重结晶可得纯品。 0015 其中， 步骤(1)中将日本曲霉Aspergillus japonicus ZW1接种到液体培养基中进 行液体发酵； 所述液体培养基的组分包括： KNO3 2g/L， KCl 0.5g/L， FeSO4 0.01g/L， K2HPO4 1g/L， MgSO4 0.5g/L， 蔗糖30g/L； 液体培养基。

14、pH7。 0016 其中， 所述液体发酵培养的条件为： 温度2630， 转速130170r/min。 震荡培养 1216d； 优选地， 所述液体发酵培养的条件为： 温度28， 转速150r/min， 震荡培养14d。 0017 本发明的第三个目的提供所述杀线虫活性物质在植物害虫生物防治方面的用途； 其中， 所述植物害虫为植物寄生线虫； 进一步地， 所述植物害虫为根结线虫和/或大豆孢囊 线虫。 0018 本发明的有益效果 0019 本发明所提供的杀线虫活性物质稳定性强， 对根结线虫和大豆孢囊线虫有很强的 毒杀活性， 在1.25mg/mL浓度下48h根结线虫的死亡率90以上， 2mg/mL浓度下6。

15、h线虫死亡 率100； 同时， 2mg/mL浓度下48h大豆孢囊线虫死亡率100。 说明书 2/6 页 4 CN 111153797 A 4 附图说明 0020 图1为核磁共振氢谱； 0021 图2为核磁共振碳谱。 具体实施方式 0022 以下实施例进一步说明本发明的内容， 但不应理解为对本发明的限制。 在不背离 本发明精神和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明 的范围。 0023 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所 使用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0024 实施例1杀线虫活性物质的提取。

16、 0025 1、 菌株的来源和活化 0026 日本曲霉Aspergillus japonicus ZW1菌株来源于广西大学农学院线虫学实验 室， 学名为 Aspergillus japonicus， GenBank登录号： KR708636.1； 所述菌株被保藏于中国 典型培养物保藏中心保藏， 保藏号为CCTCC NO.M2014641。 0027 将ZW1菌株从保存的试管中转移至PDA培养基上， 置于GXZ-280C-4型的恒温培养 箱， 25培养7d活化。 0028 2、 制备发酵培养液 0029 制备Czapek液体培养基， 液体培养基的组分为： KNO3 2g/L， KCl 0.5g/。

17、L， FeSO4 0.01 g/L， K2HPO4 1g/L， MgSO4 0.5g/L， 蔗糖30g/L； 液体培养基pH7。 0030 将Czapek液体培养基装入250mL的三角瓶中， 每瓶装100mL； 用0.6cm孔径的打孔器 打孔， 从步骤1培养了7d的PDA培养基中挑取菌饼转接至三角瓶中， 然后在28的恒温摇床 培养14d， 共培养8L。 0031 3、 将步骤2得到的发酵培养液用医用纱布过滤， 然后用旋转蒸发仪进行蒸馏， 48 ， 70r/min， 除去大部分水， 当蒸馏瓶中剩下500mL水和ZW-1菌株的产物的混合物时停止 旋蒸。 0032 4、 将浓缩液转移至2L的分液漏斗。

18、， 加入1L分析纯的正丁醇， 盖上盖子， 剧烈摇晃 1015s， 然后至于铁架静置， 待其分层后， 将下层液体放入1L三角瓶内， 上层液体放入 2L 旋蒸瓶内， 进行旋蒸； 下层液体倒回分液漏斗， 再加入正丁醇分析纯， 继续萃取， 如此重复4 次。 收集分液漏斗上层样品并旋蒸减少液体的量， 再转至100mL旋蒸瓶中， 旋蒸至样品中无 溶剂， 得到粗提物。 0033 5、 样品重结晶 0034 将分离到的粗提物用甲醇溶解， 置于4条件下， 等待其结晶， 然后过滤， 用氯仿分 析纯多次清洗结晶， 然后再用石油醚分析纯多次清洗， 再用甲醇分析纯溶解， 25进行重结 晶， 获得杀线虫活性物质。 003。

19、5 实施例2杀线虫活性物质的杀虫活性试验 0036 1、 根结线虫虫卵的收集与孵化 0037 根结线虫在广西大学农学院线虫学实验室进行繁殖， 番茄(品种： 以色列F1， 广州 亚蔬园艺种苗有限公司)作为其繁殖寄主。 接种根结线虫35d后， 取番茄根， 用自来水轻轻地 说明书 3/6 页 5 CN 111153797 A 5 冲洗， 然后置于显微镜下(Olympus corporation， 型号： SZX2-ILLT， 日本东京)挑取根结线 虫卵囊， 将挑取的卵囊置于325目的小筛子里， 将小筛子放进培养皿中， 往培养皿中加水， 至 水与筛子底部接触或浸没过筛子底部， 盖上保鲜膜， 置于25无。

20、光照的恒温培养箱进行孵 化， 每天收集孵化的根结线虫2龄幼虫， 当天进行毒杀根结线虫2龄幼虫的活性检测。 0038 2、 大豆孢囊线虫虫卵的收集与孵化 0039 大豆孢囊线虫在广西大学农学院线虫学实验室进行繁殖， 大豆(品种： 鲁豆4号)作 为其繁殖寄主。 接种后35天分离孢囊， 将花盆倒扣后轻轻取下大豆根， 自来水洗去根部沙 子， 于干净的培养皿中用毛刷将白色孢囊刷下， 用细针轻轻地将白色孢囊挑出至450目筛 中， 70酒精消毒3min后， 无菌水冲洗4次， 破碎孢囊释放卵， 加少许无菌水， 避光 25下孵 化， 试验当天收集孵出的2龄幼虫备用。 0040 3、 不同浓度的杀线虫活性物质的杀。

21、虫活性试验 0041 将杀线虫活性物质配成浓度为0.25、 0.50、 0.75、 1.00、 1.25mg/mL溶液， 加入96孔 板， 每孔200 L， 然后每孔加入根结线虫2龄幼虫60头左右。 将96孔板置于25条件下， 分别 在处理后6、 12、 24和48h于光学显微镜(Ti-S Nikon显微镜Nikon Instruments Inc. 东京， 日本)下观察， 统计根结线虫2龄幼虫的死亡数量， 并拍照。 线虫死亡的判定标准： 线虫僵直， 且用毛针刺激后不活动， 说明线虫死亡。 以无菌水为对照组， 进行试验3次试验。 死亡率 (线虫死亡数/线虫总数)100， 研究结果见表1。 00。

22、42 同样用不同浓度的杀线虫活性物质处理大豆孢囊线虫2龄幼虫， 试验的方法和线 虫死亡判定均同根结线虫， 研究结果见表2。 0043 表1不同浓度杀根结线虫活性物质对根结线虫2龄幼虫的影响 0044 0045 0046 注： 同列平均数后的相同字母表示根据Duncant新复极差法检验在P0.05水平无 差异显著。 0047 从表1可以看出， 不同浓度的杀线虫活性物质处理根结线虫2龄幼虫的死亡率具有 显著差异； 在48h， 1 .25mg/mL的杀线虫活性物质处理根结线虫2龄幼虫的死亡率达到 91.7， 显著高于其他处理(P0.05)； 0.5mg/mL的杀线虫活性物质处理根结线虫的死亡率 在4。

23、8 h达到20.8， 显著高于无菌水对照组(P0.05)。 0048 表2不同浓度杀线虫活性物质对大豆孢囊线虫2龄幼虫的毒杀作用 说明书 4/6 页 6 CN 111153797 A 6 0049 0050 注： 同列平均数后的相同字母表示根据Duncant新复极差法检验在P0.05水平无 差异显著。 0051 从表2可以看出， 不同浓度的杀线虫活性物质处理大豆孢囊线虫2龄幼虫的死亡率 具有显著差异； 在低浓度0.250.5mg/ml情况下对大豆孢囊线虫2龄幼虫没有影响， 当浓度 0.75mg/ml时， 24h和48h线虫死亡率均显著高于对照组(P0.05)， 在48h， 1.75mg/mL 。

24、的杀线 虫活性物质处理大豆孢囊线虫2龄幼虫的死亡率达到96.2； 2mg/mL的杀线虫活性物质处 理大豆孢囊线虫的死亡率达100。 0052 4、 2mg/mL杀线虫活性物质溶液的杀虫活性试验 0053 将杀线虫活性物质配成浓度为2mg/mL溶液， 加入96孔板， 每孔200 L， 然后每孔加 入根结线虫2龄幼虫60条左右。 将96孔板置于25条件下， 分别在处理后6、 12、 24 和48h于 光学显微镜(Ti-S Nikon显微镜Nikon Instruments Inc.东京， 日本)下观察， 统计根结线 虫2龄幼虫的死亡数量。 线虫死亡的判定标准： 线虫僵直， 且用毛针刺激后不活动， 。

25、说明线虫 死亡。 以无菌水为对照组， 进行试验3次试验。 死亡率(线虫死亡数/线虫总数)100， 实 验结果见表3。 0054 表3 2mg/mL杀线虫活性物质对根结线虫2龄幼虫的影响 0055 0056 注： 同列平均数后的相同字母表示根据Duncant新复极差法检验在P0.05水平无 说明书 5/6 页 7 CN 111153797 A 7 差异显著。 0057 从表3可以看出浓度为2mg/mL的杀线虫活性物质毒杀根结线虫2龄幼虫的死亡率 在 6h达到100， 显著高于对照组(P0.05)。 0058 实施例3核磁共振分析杀线虫活性物质的结构式 0059 利用高分辨率核磁共振波谱仪测定杀线。

26、虫活性物质的核磁共振数据， 检测氢原子 和碳原子数量及其相关性， 获得氢谱和碳谱图， 进行图谱分析， 得知构成这一物体原子核的 位置和种类， 查找物质的分子结构， 绘制物质的结构图像。 为确保结构的准确性， 利用超高 效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪检测其相对分子质量。 0060 结晶产物， 无色晶体(甲醇， CD3OD)， 1H NMR(CD3OD,400MHz) :3.68(each 3H, s, 7,8-CH3) ,2.95,2.85(each 2H,AB system,d,J12.0Hz,2,4-CH2)。 13C NMR(CD3OD, 100MHz) :175.00(s,C-6),170.46(s,C-1,C-5),72.84(s,C-3),50.78(q,C-7,C-8),42.63 (t, C-2,C-4)(见表4， 图2)。 0061 表4结晶产物 的氢和碳的相关性 0062 0063 从核磁共振的结果， 可以得到杀线虫活性物质的结构式如下， 其名称为柠檬酸二 甲酯盐酸盐： 0064 说明书 6/6 页 8 CN 111153797 A 8 图1 图2 说明书附图 1/1 页 9 CN 111153797 A 9 。