植物粒型相关蛋白OsSDSG及其编码基因与应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010095556.9 (22)申请日 2020.02.17 (71)申请人 南京农业大学 地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇 国家农业科技园南京农业大学基地 (72)发明人 万建民江玲牟昌铃董慧 王益华赵志刚刘裕强周时荣 刘世家田云录刘喜陈亮明 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 杜静徐冬涛 (51)Int.Cl. C07K 14/415(2006.01) C12N 15/29(2006.01) C12N 15/82(200。

2、6.01) C12N 15/11(2006.01) A01H 5/10(2018.01) A01H 6/46(2018.01) (54)发明名称 一种植物粒型相关蛋白OsSDSG及其编码基 因与应用 (57)摘要 本发明公开了一个植物控制水稻粒型相关 蛋白OsSDSG及其编码基因与应用。 本发明提供的 蛋白质， 是如下(a)或(b)的蛋白质： (a)由SEQID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将SEQ IDNO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残 基的取代和/或缺失和/或添加且与植物粒型大 小相关的由SEQIDNO.1衍生的蛋白质。 将所述 蛋白的编码基因导入存在粒型变小缺陷。

3、的植物 中， 可以培育粒型变大的植物。 所述蛋白及其编 码基因可以应用于作物遗传改良。 权利要求书1页 说明书7页 序列表15页 附图3页 CN 111153980 A 2020.05.15 CN 111153980 A 1.一种控制粒型的蛋白质OsSDSG， 其特征在于选自如(a)或(b)所示的任一种： (a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且与淀粉合成相关的由序列1衍生的蛋白质。 2.编码权利要求1所述蛋白的基因OsSDSG。 3.根据权利要求2所述的基因OsSDSG， 其。

4、特征在于： 所述基因是如下1)或2)或3)或4)或 5)所述的DNA分子： 1)SEQ ID NO.2所示的DNA分子； 2)SEQ ID NO.3所示的DNA分子； 3)SEQ ID NO.4所示的DNA分子； 4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白OsSDSG的DNA分子； 5)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90以上同源性， 且编码植物粒型相关蛋白 的DNA分子。 4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌。 5.根据权利要求4所述的重组表达载体， 其特征在于： 所述重组表达载体是在 pCUBi1390载体的多。

5、克隆位点Hind和BamHI之间插入权利要求2或3所述基因得到的重组 质粒。 6.扩增权利要求2或3所述基因的全长或其任意片段的引物对。 7.权利要求1所述蛋白， 权利要求2或3所述基因， 权利要求4所述重组表达载体、 表达 盒、 转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用； 优选的， 所述植物为水稻。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于权利要求1所述蛋白， 权利要求2或3所述基 因， 权利要求4所述重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌中的至少一种在培育粒 型形成正常或粒型变大的转基因植物中的应用； 优选的， 所述植物为水稻。 9.一种培育粒型形成正常的转基因植物的方。

6、法， 是将权利要求2或3所述基因导入粒型 形成异常植物中， 得到粒型形成正常的转基因植物； 所述粒型形成异常的植物为粒型变小 的植物； 所述粒型正常的转基因植物为籽粒大小形成正常的转基因植物； 优选的， 所述植物 为水稻。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于： 权利要求2或3所述基因通过权利要求4或 5所述重组表达载体导入粒型大小形成异常的植物中。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111153980 A 2 一种植物粒型相关蛋白OsSDSG及其编码基因与应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程领域， 涉及一个植物粒型相关蛋白OsSDSG及其编码基因与应 用。 背景技术 0002。

7、 水稻是世界上最重要的粮食作物之一， 也是我国最主要的粮食作物之一。 据统计， 全球有一半以上的人口以水稻为主食,也是我国三分之二以上人口的主食。 随着经济的发 展， 世界正面临着人口的不断增加、 耕地面积的迅速减少， 粮食安全越来越受到人们的关 注。 因此， 提高水稻的产量是迫切需要解决的问题。 水稻的产量由三个因素决定， 即每株有 效穗数、 每穗粒数和千粒重。 有研究表明， 增加粒重能够提高水稻的产量。 而水稻的粒型直 接影响千粒重。 同时， 随着人们生活水平的提升， 对稻米品质的要求也在不断地提高， 而水 稻的粒型影响着水稻的外观品质、 加工品质、 蒸煮食味品质。 0003 水稻(Ory。

8、za sativa L.)粒型主要受到的粒长、 粒宽、 粒厚的影响。 粒型一方面会 受到母本效应的影响， 这是由于母本植株不仅为籽粒的发育提供了遗传物质， 还有营养物 质， 所以籽粒的粒型会受到母本基因型的影响。 特别是在水稻种子的发育和形成过程中， 随 着双受精的开始， 胚乳不仅不会被胚吸收， 而且还会逐渐增大， 存储营养物质， 最终占据水 稻种子的绝大部分空间， 最终影响水稻籽粒的大小。 另一方面， 水稻的胚和胚乳被外稃和内 稃包围， 细胞数目和细胞的大小决定了外稃和内稃的大小， 而外稃和内稃的大小决定了籽 粒灌浆的空间， 最终能够决定水稻的粒型。 0004 在遗传上， 水稻粒型受到复杂的。

9、调控途径的影响， 包括激素、 G蛋白信号途径、 丝裂 原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径、 泛素途径、 表观修饰等。 运用遗传学， 并结合功能基因组 学和迅速发展的高通量测序方法， 目前已经有越来越多的粒型相关数量性状位点(QTL)和 基因被定位和克隆， 例如： GS3、 GW5、 GS5。 同时， 克隆粒型相关基因和阐明粒型调控机制对增 加水稻产量和提高水稻品质有着重要的意义。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种植物粒型相关蛋白OsSDSG及其编码基因与应用。 0006 本发明提供的控制水稻粒型相关蛋白OsSDSG， 来源于稻属水稻(Oryza sativa var.NJ35)， 是。

10、如下(a)或(b)的蛋白质： 0007 (a)由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 0008 (b)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且与粒型相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。 0009 序列表中的SEQ ID NO.1由1447个氨基酸残基组成， 自氨基末端第858至1355位为 SNF2_N和HELICc结构域。 0010 为了使(a)中的OsSDSG便于纯化， 可在由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列 组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。 说明书 1/7 页 3 CN。

11、 111153980 A 3 0011 表1标签的序列 0012 标签残基序列 Poly-His2-10(通常为6个)HHHHHH FLAG8DYKDDDDK 0013 上述(b)中的OsSDSG可以由人工合成， 也可以先合成其编码基因， 再进行生物表达 得到。 上述(b)中的OsSDSG的编码基因可通过将序列表中SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示 的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子， 和/或进行一个或几个碱基对的错义突 变， 和/或在其5 端和/或3 端连上表1所示的标签的编码序列得到。 0014 编码上述水稻粒型蛋白的基因(OsSDSG)也属于本发明的保护范围。。

12、 0015 所述基因OsSDSG可为如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子： 0016 1)序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA分子； 0017 2)序列表中SEQ ID NO.3所示的DNA分子； 0018 3)序列表中SEQ ID NO.4所示的DNA分子； 0019 4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； 0020 5)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90以上同源性， 且编码粒型蛋白的DNA 分子。 0021 序列表中的SEQ ID NO.2由4344个核苷酸组成。 0022 所述严格条件可为在0.1SSPE(或0.1S。

13、SC)， 0.1SDS的溶液中， 在65下杂交 并洗膜。 0023 含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。 0024 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。 0025 所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。 所述植 物表达载体还可包含外源基因的3 端非翻译区域， 即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA加工或基因表达的DNA片段。 所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3 端， 如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、 植物基因(如大豆贮存蛋 白基因)3 端转录的非翻译区均具有类似功能。 0026。

14、 使用所述基因构建重组植物表达载体时， 在其转录起始核苷酸前可加上任何一种 增强型启动子或组成型启动子， 如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、 玉米的泛素启动子 (Ubiquitin)， 它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用； 此外， 使用本发明的基因 构建植物表达载体时， 还可使用增强子， 包括翻译增强子或转录增强子， 这些增强子区域可 以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等， 但必需与编码序列的阅读框相同， 以保证整 个序列的正确翻译。 所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的， 可以是天然的， 也可 以是合成的。 翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。 0027 。

15、为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选， 可对所用植物表达载体进行 加工， 如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、 萤光素酶基因等)、 具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、 卡那霉素标记物等)或是抗 化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。 从转基因植物的安全性考虑， 可不加任何选择性 标记基因， 直接以逆境筛选转化植株。 0028 所述重组表达载体可为在pCUBi1390载体的多克隆位点Hind和BamHI之间重组 说明书 2/7 页 4 CN 111153980 A 4 插入所述基因(OsSDSG)的启动子、 基因组和3 端非翻译区域得到的重组。

16、质粒。 所述重组质 粒具体可为pCUBi1390-OsSDSGpro-gOsSDSG； 所述pCUBi1390-OsSDSGpro-gOsSDSG是将 OsSDSG的启动子、 基因组和3 端非翻译区域序列通过重组技术插入pCUBi1390多克隆位点 Hind和BamHI之间得到的(Clontech公司， Infusion重组试剂盒)。 0029 将含有OsSDSG的pCUBi1390命名为pCUBi1390-OsSDSGpro-gOsSDSG。 0030 含有以上任一所述基因(pCUBi1390-OsSDSGpro-gOsSDSG)的表达盒、 转基因细胞 系及重组菌均属于本发明的保护范围。 0。

17、031 扩增所述基因(pCUBi1390-OsSDSGpro-gOsSDSG)全长或任一片段的引物对也属于 本发明的保护范围。 0032 本发明的另一个目的是提供一种培育粒型形成正常的转基因植物的方法。 0033 本发明提供的培育粒型形成正常的转基因植物的方法， 是将所述基因导入粒型变 小缺陷的植物中， 得到粒型变大的转基因植物； 具体来说， 所述基因通过所述重组表达载体 导入粒型变小的异常植物中； 所述粒型变小异常植物可为sdsg。 0034 所述蛋白、 所述基因、 所述重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌或所述 方法均可应用于水稻育种。 0035 利用任何一种可以引导外源基因在植。

18、物中表达的载体， 将编码所述蛋白的基因导 入植物细胞， 可获转基因细胞系及转基因植株。 携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti 质粒、 Ri质粒、 植物病毒载体、 直接DNA转化、 显微注射、 电导、 农杆菌介导等常规生物学方法 转化植物细胞或组织， 并将转化的植物组织培育成植株。 被转化的植物宿主既可以是单子 叶植物， 也可以是双子叶植物， 如： 烟草、 百脉根、 拟南芥、 水稻、 小麦、 玉米、 黄瓜、 番茄、 杨 树、 草坪草、 苜宿等。 0036 本发明还提供所述的基因、 蛋白、 重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌 中的至少一种在植物育种中的应用， 特别是在培育粒型形成正常。

19、或粒型变大的植物育种中 的应用。 0037 本发明还提供所述的基因、 蛋白、 重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌 中的至少一种在水稻育种中的应用， 特别是在培育粒型形成正常或粒型变大的水稻育种中 的应用。 0038 本发明所述的粒型形成异常的植物为粒型变小的植物； 所述粒型正常的植物为籽 粒大小形成正常的植物。 0039 本发明首次发现、 定位并克隆得到一个新的影响水稻粒型相关蛋白的基因 OsSDSG。 将所述蛋白的编码基因导入发生粒型变小缺陷的植物中， 可以得到粒型变大的转 基因植物。 所述蛋白及其编码基因可以应用于作物的遗传改良。 附图说明 0040 图1为野生型NJ35(WT。

20、)和突变体sdsg成熟籽粒外观表型图(标尺1cm)。 0041 图2为野生型NJ35(WT)和突变体sdsg成熟籽粒糙米外观表型图(标尺1cm)。 0042 图3为野生型NJ35(WT)和突变体sdsg抽穗后颖壳横截面细胞观察比较(上面两横 截面观察的张颖壳图片， 标尺0.2cm； 半薄切片横截面观察标尺0.4mm)， 以及颖壳外稃 内表皮纵向细胞观察(下面两张为纵向细胞观察的颖壳图片， 标尺0.2cm； 内表皮细胞观 说明书 3/7 页 5 CN 111153980 A 5 察标尺100 m)。 0043 图4为OsSDSG基因精细定位示意图。 0044 图5为OsSDSG转基因互补验证T2。

21、代纯和家系粒型互补图(标尺1cm)。 具体实施方式 0045 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。 下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 0046 实施例1、 控制植物种子粒型相关蛋白及其编码基因的发现 0047 一、 水稻粒型变小突变体sdsg表型观察 0048 粳稻品种NJ35经钴60辐射诱变库中筛选获得的稳定遗传的小粒突变体， 命名为 sdsg。 0049 图1为NJ35(WT)成熟种子未去壳籽粒， 表现为正常籽粒大小的表型， 以及sdsg成熟 种子未去壳籽粒， 表。

22、现为籽粒变小的表型。 0050 图2为NJ35(WT)成熟种子去除颖壳的糙米， 表现为正常糙米大小的表型， 以及sdsg 成熟种子去除颖壳的糙米， 表现为糙米变小的表型。 0051 利用半薄切片对抽穗后NJ35(WT)和突变体sdsg颖壳中间部位的横截面细胞进行 观察和统计(图3上面两张颖壳图片和半薄切片图片)。 根据颖壳横截面细胞的观察， 在野生 型NJ35(WT)中， 颖壳最外层细胞具有正常数目， 而在突变体sdsg中， 颖壳最外层细胞数目显 著减少(图3)； 对处于包穗时期的NJ35(WT)和突变体sdsg外稃同一部位的内表皮进行细胞 学观察和统计(图3下面两张颖壳图片和纵向细胞图片)，。

23、 发现在NJ35(WT)具有正常细胞数 目， 而突变体sdsg细胞的数目显著减少(图3)。 0052 二、 突变体sdsg的遗传分析和突变基因定位 0053 1、 突变体sdsg的遗传分析和突变基因初步定位 0054 由于突变体sdsg具有粒型变小的表型， 首先我们构建野生型NJ35(WT)和突变体 sdsg的正反交， 所得F1自交后得到F2后代， 挑选F2中正常粒型类型和像突变体一样粒型变小 的类型的单株数量符合3:1的分离比例， 因此,sdsg中控制粒型大小的表型是由单个隐性核 基因控制的。 0055 利用突变体sdsg与DJY杂交构建定位群体， 在构建的F2分离群体中选取粒型与突 变体s。

24、dsg粒型一样的极端(单株)的叶片提取DNA。 将覆盖水稻全基因组的SSR引物和InDel 引物在NJ35(WT)和DJY之间进行多态性分析， 并挑选均匀分布在每条染色体上且在两个亲 本间具有多态的标记。 利用挑选好的多态引物对sdsg、 DJY以及选取的10个极端进行初连 锁， 最终将控制籽粒大小的关键基因定位在第5号染色体标记S5-2和RM161两个分子标记之 间。 0056 其中， SSR标记和InDel标记分析的流程如下： 0057 (1)提取上述选取单株的总DNA作为模板， 具体方法如下： 0058 1、 取0.3克左右的水稻叶片， 置于2.0mL的离心管中， 离心管中放置一颗钢珠，。

25、 把装 好样品的2.0mL离心管在液氮中冷冻6min， 置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品50秒， 确保样品磨碎后倒掉钢珠。 说明书 4/7 页 6 CN 111153980 A 6 0059 2、 加入500 L提取液(含100mM Tris-HCl(pH 8.0)， 20mM EDTA(pH 8.0)， 1.4M NaCl， 0.2g/ml CTAB的溶液)， 漩涡器上剧烈涡旋混匀， 65水浴30min， 每隔10分钟混匀一 次， 使其充分反应。 0060 3、 待样品稍微冷却， 向离心管中加入500 L氯仿， 充分混匀， 12000rpm离心5min。 0061 4、 。

26、吸取3中的上清液到新的1.5mL离心管中， 并向1.5mL离心管中加入上清体积 0.7-2倍的预冷的异丙醇， 轻柔混匀后， 将样品放于-20冰箱中， 静置30min。 0062 5、 将4中的样品进行离心， 12000rpm， 3min。 0063 6、 倒掉上清， 向离心管中加入400 L预冷的70乙醇， 轻柔混匀， 将样品置于-20 冰箱中静置30min。 0064 7、 将6中的样品进行离心， 12000rpm， 3min， 弃去上清， 室温晾干。 0065 8、 向干燥后的1.5mL离心管中加入200 L 1TE(121克Tris溶于1升水中， 用盐酸 调PH值至8.0得到的溶液)溶解。

27、DNA。 0066 9、 用移液器吸取2 L电泳检测DNA质量， 并用DU800分光光度仪测定浓度(Bechman Instrument Inc.U.S.A)。 0067 (2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/ L， 作为模板进行PCR扩增； PCR反应体系(10 L)： DNA(20ng/ L)2 L， 上游引物(2pmol/ L)0.5 L， 下游引物(2pmol/ L)0.5 L， 10 x Buffer (MgCl2 free)1 L， dNTP(10mM)0.2 L， MgCl2(25mM)0.6 L， rTaq(5u/ L)0.1 L， ddH2O 5.1 L。 0068 PC。

28、R反应程序： 95.0变性5min； 94.0变性30s、 55退火30s、 72延伸40s， 循环 数为34； 72延伸10min； 10保存5min。 PCR反应在Applied Biosystems Veriti热循环仪 中进行。 0069 (3)SSR标记的PCR产物检测 0070 扩增产物用8非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 以500bp的DNA Ladder作为 对照， 比较PCR产物的分子量大小， 利用硝酸银进行银染显色。 0071 2、 小粒突变基因的精细定位 0072 根据初定位的结果， 在初定位的区域间开发新的分子标记， 包括： 公共图谱上的分 子标记和基于水稻基因组序列。

29、数据自行开发的SSR、 InDel分子标记， 并选取有多态的新标 记， 利用剩余的极端(单株)， 以及sdsg/DJY构建的F2群体中新挑选的新极端(单株)， 进一步 缩小定位区间， 定位控制突变体sdsg表型的位点。 0073 具体方法如下： 0074 (1)SSR标记开发 0075 将公共图谱的SSR标记、 InDel标记和水稻基因组的序列进行整合， 下载定位区间 的BAC/PAC克隆序列。 一方面， 使用SSR Hunter(李强等， 遗传， 2005， 27(5):808-810)或 SSRIT软件搜索克隆中潜在的SSR序列(重复次数6)； 将这些SSR及其邻近300600bp的序 列。

30、在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较， 如果两者的SSR重复次数有差 异， 初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、 粳间存在多态性； 另一方面， 在gramene(http:/ www.gramene.org)中根据定位的区间， 将该区间籼稻和粳稻的序列进行比对， 选择具有 InDel差异达到至少3bp及以上的位点。 选取包含SSR差异和indel的区段， 用primer premier 5.0进行设计SSR标记和InDel标记， 并由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。 将自 行设计的SSR标记和indel标记稀释后， 检测其在NJ35和DJY之间的多态性， 将具有多态的分 。

31、说明书 5/7 页 7 CN 111153980 A 7 子标记作为精细定位OsSDSG基因的分子标记， 缩小定位区间。 用于精细定位的分子标记见 表2。 0076 表2用于精细定位的分子标记 0077 S5-2TGCCCTCCACTTCACTCCTCGCTGCTCCATAGAACCGT RM161TGCAGATGAGAAGCGGCGCCTCTGTGTCATCAGACGGCGCTCCG S5-39TGTCTCACCACTCCTGTTCCGGTAGACAACGACGAAT SL-8GCAATGATAATTGATCGAGTTTCTCTTCTGCCTACA SL-3-2GCTTCTTTACATTTT。

32、CAGGATTATTCGCCTTATTCA SL-9CTTTTAAGCGGTGTGTGCTCGTCGATTTCAGAATGC SL-3ACTGCTTAGTTGATGGAAGAAGGCTAGGGGGGGTGC SL-5-11CGTTCTCCGTCCCATCTAGGTGGTCCGTAACTAATGC Sl-5-3ATGGCTGGTTGGCTACTGACGTGAGGGCTGCTTTAT SL-10CTTGAGGCGGTACTGAGTAATGTTGGATTGGATAGA 0078 最终把OsSDSG基因精细定位在标记SL-3-2和SL-5-11两个标记之间， 物理距离约 为112kb， 经网站预测该区。

33、间包含12个ORFs(图4)。 0079 (2)突变基因的获得 0080 经过对112kb区间内基因测序， 发现了OsSDSG基因存在一个单碱基的突变(图4) 0081 根据精细定位区间设计引物， 序列如下所述： 0082 primer1： 5-GTTGCAGCTAAACCCCTCTCCCTACTCCT-3(SEQ ID NO.5) 0083 primer2： 5-AAGAATGAATCCATCTGATGCCAGTCATT-3(SEQ ID NO.6) 0084 以primer1和primer2为引物， 以NJ35的cDNA为模板， 进行PCR扩增获得目的基因 (对应的基因组序列即SEQ ID。

34、 NO.3)。 0085 利用Takara的KOD FX在Applied Biosystems Veriti热循环仪上进行扩增反应： 942min； 9810s， 5530sec， 685min 30s， 34个循环； 6810min。 将PCR产物回收纯化 后克隆到载体pEASY(北京全式金公司)， 转化大肠杆菌DH5 感受态细胞(北京Tiangen公司 CB101)， 挑选阳性克隆后， 进行测序。 序列测定结果表明， PCR反应获得的片段具有序列表中 SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列， 编码1447个氨基酸残基组成的蛋白质(从ATG到TAA)(见序 列表的SEQ ID NO.1)。 。

35、将SEQ ID NO.1所示的蛋白命名为OsSDSG(即为基因定位中所述的 OsSDSG基因)， 将SEQ ID NO.1所示的蛋白的编码基因命名OsSDSG。 0086 实施例2、 转基因植物的获得和鉴定 0087 一、 重组表达载体构建 0088 以NJ35的DNA为模板， 进行PCR， 用带酶切位点的引物扩增获得OsSDSG基因的启动 子和基因组和3 端非翻译区序列(SEQ ID NO.4)， PCR引物序列如下： 0089 primer3： 5-CCGGCGCGCCAAGCTTTACGGCTTTCTAATGTGAACATTTTATTA-3(SEQ ID NO.7) 0090 prime。

36、r4： 5-GAATTCCCGGGGATCCTAGCTGAAACTAGTCCGCTTATTCATATT-3(SEQ ID NO.8) 0091 上述引物去除酶切位点序列后分别位于SEQ ID NO.4所示基因的启动子区域开始 和3 端非翻译区域末端， 扩增产物包含了该基因的启动子、 基因组和3 端非翻译区域， 将 说明书 6/7 页 8 CN 111153980 A 8 PCR产物回收纯化。 采用Infusion重组试剂盒(Clontech)将PCR产物克隆到载体pCUBi1390 中， 构建成pCUBi1390-OsSDSGpro-gOsSDSG； 重组反应体系(10.0 L)： PCR产物。

37、5 L(50- 100ng)， pCUBi1390载体2 L(30-50ng)， 5Infusion buffer 2.0 L， Infusion enzyme mix 1 L。 短暂离心后将混合体系在50水浴中重组30min， 取5 L反应体系用热激法转化大肠杆 菌DH5 感受态细胞(北京Tiangen公司； CB101)。 将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L卡那 霉素的LB固体培养基上。 0092 37培养16h后， 挑选阳性克隆进行测序。 测序结果表明， 得到了含有SEQ ID NO.4 所示基因的重组表达载体， 将含有SDSG的pCUBi1390命名为pCUBi1390-OsSDS。

38、Gpro- gOsSDSG,OsSDSG基因插入在多克隆位点Hind和BamHI之间。 0093 二、 重组表达载体的遗传转化 0094 以农杆菌菌株EHA105介导为例， 将所述重组表达载体导入粒型变小的受体植物材 料中， 此处的植物材料可为sdsg。 选用突变体sdsg植株的种子制备成熟胚的胚性愈伤组织。 水稻成熟胚遗传转化的基本流程如下所述。 0095 1、 在28、 200rpm培养条件下培育重组表达载体的农杆菌过夜， 直到农杆菌至 OD60006-1.0之间。 0096 2、 将培养合适的水稻成熟胚胚性愈伤组织与农杆菌悬浮液混合侵染30min， 用无 菌滤纸吸干菌液后转移至培养基中共。

39、培养3天。 0097 3、 将上述愈伤接种在含有150mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第一次筛选16 天。 0098 4、 挑取健康愈伤转入200mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选， 每15天 继代一次。 0099 5、 挑取抗性愈伤转入含有150mg/L潮霉素的分化培养基上分化。 0100 6、 待分化出的植株长至一定高时进行10天的炼苗， 并移栽至温室栽培。 0101 三、 转基因植株的鉴定 0102 1、 潮霉素抗性鉴定 0103 本研究中利用1浓度的潮霉素溶液鉴定转基因植株。 具体方法： 将新鲜的转基因 植株叶片(没有转基因植株叶片做阴性对照)放在培养皿中， 用新配的1。

40、的潮霉素溶液浸 泡， 放在28培养箱中暗培养48小时， 与对照比较， 叶片坏死的表明不抗， 没有坏死的表明 抗， 将抗潮霉素的两个家系命名为sdsg-com-1和sdsg-com-2。 0104 2、 表型鉴定 0105 分别将T0代转pCUBi1390-OsSDSGpro-gOsSDSG的转基因植株， 野生型NJ35和突变 体sdsg按照大田管理种植在南京农业大学土桥实验基地大田中。 鉴定到的两个独立的T2代 转基因家系粒型大小恢复到了野生型粒型大小的水平， 由此验证了转基因前的小粒表型是 由OsSDSG基因控制的， 即该OsSDSG基因为控制粒型大小的相关基因(图5)。 说明书 7/7 页。

41、 9 CN 111153980 A 9 序列表 南京农业大学 一种植物粒型相关蛋白OsSDSG及其编码基因与应用 8 SIPOSequenceListing 1.0 2 1447 PRT 稻属水稻(Oryza sativa var.NJ35) 2 Met Asp Arg Ala Ala Arg Leu Ala Arg Arg Arg Arg Gly Gly Gly Val 1 5 10 15 Thr Val Ala Glu Tyr Arg Met Val Arg Gly His Arg Arg Gly Gly Asp 20 25 30 Ala Gly Pro Val Val Val Ile A。

42、sp Val Glu Asp Asp Gly Glu Asp Ala 35 40 45 Ala Asp Asp Ser Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala Val Lys 50 55 60 Arg Arg Val Val Val Pro Gly Ala Val Ala Thr Arg Thr Arg Ser Arg 65 70 75 80 Arg Met Ala Met Ala Gln Gln Ala Pro Val Thr Pro Pro Ala Ala Ala 85 90 95 Glu Glu Ala Pro Ser Arg Arg Arg Ly。

43、s Arg Lys Gly Ala Ala Ser Ala 100 105 110 Glu Ala Gly Gly Gly Gly Pro Ser Lys Arg Arg Val Arg Ser Ser Gly 115 120 125 Ser Ala Gly Gly Arg Gly Ala Arg Lys Arg Lys Glu Ala Glu Ala Asp 130 135 140 Glu Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala 145 150 155 160 Gly Thr Pro Ala Arg Gly Gl。

44、u Ser Met Glu Val Ser Gln Val Asp Gly 165 170 175 Gly Gly Ser Ser Gly Arg Ala Asp Asp Ala Ser His Asn Gly Asn Gly 180 185 190 Glu Ser Arg Val Cys Asn Ala Asp Gly Ile Asp Gln Ala Ser Glu Glu 195 200 205 Arg Pro Ser Val Ala Gly Gly Asp Leu Ile Glu Glu Glu His Cys Gly 210 215 220 序列表 1/15 页 10 CN 11115。

45、3980 A 10 Asn Gly Glu Thr Ser Val Ala Gly Gly Asp Arg Ile Glu Glu His Cys 225 230 235 240 Gly Asn Val Glu Ala Ser Val Ala Asn Ser Asn Arg Asp Gly Gly Glu 245 250 255 Ile Ile Ala Gly Glu Gly Thr Glu Asp Arg Gly Asn Thr Glu Leu Ala 260 265 270 Val Val Asp Ser Val Asn Glu Glu Leu Ala Ser Asp Glu Asp As。

46、p Tyr 275 280 285 Asp Asp Glu Met Leu Glu Glu Lys Leu Val Gly Asp Val Ile Arg Ala 290 295 300 Tyr Ser Asn Gly Thr Asp Leu Asp Thr Asn Gly Val Asp Trp Glu Ala 305 310 315 320 Glu Asp Glu Met Glu Phe Ala Asp Leu Asp Thr Asn Val Val Asp Trp 325 330 335 Glu Ala Glu Asp Glu Met Glu Phe Asp Asp Asp Asn As。

47、p Asn Asp Ala 340 345 350 Asp Asp Asp Gly Asp Asn Phe Gly Gly Asp Ala Asp Glu Gly Asp Lys 355 360 365 Ser Val Gln Met His Asp Phe Ser Lys Val Glu Thr Gln Asp Leu Val 370 375 380 Ser His Asn Val Asn Val Ser Glu Val Arg Pro His Glu Asp Glu Glu 385 390 395 400 Ala Ile Lys Asp Glu Met Glu Ser Lys Gly Ly。

48、s Gly Ser Leu Ser Phe 405 410 415 Asn Glu Gly Ser Ser Tyr Ile Glu Ile Leu Asp Ser Asp Glu Glu Val 420 425 430 Lys Val Val Asn Asp Thr Gly Asn Ala Leu Arg Arg Lys Pro Leu Val 435 440 445 Pro Ala Lys Leu Pro Ile Val Pro Ser Cys Val Ala Trp Arg Thr Arg 450 455 460 Ser Ser Trp Gly Met Lys Glu Glu Arg Il。

49、e Ser Tyr Asn Thr Tyr Phe 465 470 475 480 Glu Val Leu Ser Asp Glu Pro Lys Glu Asp Asp Asp Asp Thr Glu Val 485 490 495 Glu Leu Asp Asp Glu Glu Asp Asp Glu Asn Asp Asp Asp Cys Asn Ser 500 505 510 Ala Ser Cys Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Arg Glu Glu 515 520 525 Glu Glu Glu Glu Ala Gln Arg Ar。

50、g Lys Gln Lys Lys Gly Ile Asp Ser 序列表 2/15 页 11 CN 111153980 A 11 530 535 540 Ser Asp Asp Glu Met Ile Asp Asp Ala Val Asp Cys Gly Ile Asp Trp 545 550 555 560 Glu Glu Asp Tyr Pro Glu Val Asp Phe Thr Arg Pro Leu Thr Phe Gln 565 570 575 Lys Asp Gly Ser Glu Ala Pro Val Gly Ser Glu Ala Phe Thr Glu Gln 58。