基于萱草叶面温度筛选耐干旱萱草的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010112396.4 (22)申请日 2020.02.24 (71)申请人 上海应用技术大学 地址 200235 上海市徐汇区漕宝路120-121 号 (72)发明人 李昊倪迪安梁锦钟荣 谭雨馨 (74)专利代理机构 上海汉声知识产权代理有限 公司 31236 代理人 胡晶 (51)Int.Cl. G01N 25/20(2006.01) G01N 15/14(2006.01) G01N 5/00(2006.01) G01N 5/04(2006.01) G01N 23/22。

2、51(2018.01) G01N 23/2202(2018.01) G01N 15/08(2006.01) G01N 21/84(2006.01) G01N 33/00(2006.01) (54)发明名称 一种基于萱草叶面温度筛选耐干旱萱草的 方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于萱草叶面温度筛选 耐干旱萱草的方法， 包括以下步骤： S1： 初步筛 选： 测量不同萱草品种的叶面温度， 将每株萱草 的叶面温度排序； S2： 进一步测定： 挑选所述步骤 S1中萱草叶面温度排序中最高的或最低的萱草， 测量萱草细胞倍性、 气孔导度、 叶片相对含水量、 离体叶片失水率、 叶片的气孔尺寸和密度， 再通 。

3、过萱草自然干旱胁迫实验下的存活能力和复水 试验后生长发育状况， 确认筛选耐干旱萱草品 种。 本发明提供的耐干旱筛选方法简单， 工作量 小， 避免了大量的萱草进行自然胁迫实验， 只需 要进行温度初筛， 然后进一步做确认实验即可。 权利要求书1页 说明书8页 附图2页 CN 111157575 A 2020.05.15 CN 111157575 A 1.一种基于萱草叶面温度筛选耐干旱萱草的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： S1： 初步筛选： 测量不同萱草品种的叶面温度， 将每株萱草的叶面温度排序； S2： 进一步测定： 挑选所述步骤S1中萱草叶面温度排序中最高的或最低的萱草， 测量萱 草细胞倍。

4、性、 气孔导度、 叶片相对含水量、 离体叶片失水率、 叶片的气孔尺寸和密度， 再通过 萱草自然干旱胁迫实验下的存活能力和复水试验后生长发育状况， 确认筛选耐干旱萱草品 种。 2.根据权利要求1所述的基于萱草叶面温度筛选耐干旱萱草的方法， 其特征在于， 所述 步骤2中测定萱草细胞倍性的方法： 使用： 取10mg新鲜、 幼嫩萱草叶片组织样本置于培养皿 中， 加入400 l核提取缓冲液， 使用刀片切碎组织， 切割60-180秒保证萱草组织均匀切碎， 加 入1600 l DAPI染色溶液20放置20min使用38 m过滤样本， 使用流式细胞仪测量。 3.根据权利要求2所述的基于萱草叶面温度筛选耐干旱萱。

5、草的方法， 其特征在于， 所述 细胞核缓冲提取液包含100mmol/L柠檬酸、 体积分数为0.5pH3的Tween-80、 400mmol/L 的七水和磷酸氢二钠； 流式细胞仪测量时， 电压设置为400mV， 流速设置为0.4 l/s。 4.根据权利要求1所述的基于萱草叶面温度筛选耐干旱萱草的方法， 其特征在于， 采用 扫描电镜测量萱草叶片的气孔， 在上午9-11点自然光照下， 选取正常生理状态萱草向阳面 叶片， 剪取上半部分叶片， 去除叶尖， 放入植物组织固定液中后置于冰盒保存， 采用扫描电 子显微镜测量萱草气孔数据。 5.根据权利要求4所述的基于萱草叶面温度筛选耐干旱萱草的方法， 其特征在。

6、于， 所述 植物组织固定液为浓度为65无水乙醇、 6乙酸和5甲醛的混合液。 6.根据权利要求5所述的基于萱草叶面温度筛选耐干旱萱草的方法， 其特征在于， 所述 植物组织固定液还包括46ml甘油。 7.根据权利要求1所述的基于萱草叶面温度筛选耐干旱萱草的方法， 其特征在于， 所述 步骤2中测量气孔导度的方法为： 在上午9-11点自然光照下， 选取正常生理状态萱草叶片向 阳面进行测定， 测定气孔导度， 测定光强设置为1000 mol.m-2s-1。 8.根据权利要求1所述的基于萱草叶面温度筛选耐干旱萱草的方法， 其特征在于， 采用 高精度红外测温仪测量萱草叶面温度。 权利要求书 1/1 页 2 C。

7、N 111157575 A 2 一种基于萱草叶面温度筛选耐干旱萱草的方法 技术领域 0001 本发明属于花卉筛选的领域， 尤其涉及一种基于萱草叶面温度筛选耐干旱萱草的 方法。 背景技术 0002 萱草， 古称谖草， 为多年生宿根草本， 多数原产于中国， 现主要品种由美国的种质 资源公司、 植物园和园艺爱好者收集中国、 日本所产萱草属植物， 进行杂交选育所得， 萱草 属植物种间很容易杂交,而且一些种类花的大小、 颜色、 花的形态和花期等都有很大的变化 幅度,因此具有观赏性长， 观赏性高， 品种繁多， 花色丰富艳丽， 抗逆性强， 适应性强等诸多 优点， 作为观赏性植物日益受到人们的重视， 发展前景。

8、广阔。 我国现代萱草育种， 自1974年 起， 中国地形复杂， 气候多变， 整体地势呈西高东低， 有大量的土地处于干旱与半干旱之间， 因此选育耐干旱萱草品种是萱草育种的重要目标之一， 以往筛选抗干旱品种的方法大多数 是通过测定其植物生理状态， 需要做大量的对照实验。 需要较长的测定周期， 消耗大量的人 力资源， 且工作量很大， 大规模使用化学药剂来测定植物生理状态， 资金耗费较高， 且很容 易造成不可逆的土地污染。 发明内容 0003 本发明针对上述现有技术中的问题， 提供了一种基于叶面温度筛选耐干旱萱草的 方法， 基于萱草叶面温度， 初步筛选出耐干旱品种， 然后再进一步确定该品种是否耐干旱的。

9、 方法， 该筛选方法简单， 工作量小一种可大规模筛选， 耐干旱萱草品种的方法。 0004 为解决上述问题， 本发明的技术方案为： 0005 一种基于萱草叶面温度筛选耐干旱萱草的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 0006 S1： 初步筛选： 测量不同萱草品种的叶面温度， 将每株萱草的叶面温度排序； 0007 S2： 进一步测定： 挑选所述步骤S1中萱草叶面温度排序中最高的或最低的萱草， 测 量萱草细胞倍性、 气孔导度、 叶片相对含水量、 离体叶片失水率、 叶片的气孔尺寸和密度， 再 通过萱草自然干旱胁迫实验下的存活能力和复水试验后生长发育状况， 筛选耐干旱萱草品 种。 0008 进一步地， 。

10、所述的测定萱草细胞倍性的方法： 使用： 取10mg新鲜、 幼嫩萱草叶片组 织样本置于培养皿中， 加入400 l核提取缓冲液， 使用刀片切碎组织， 切割60-180秒保证萱 草组织均匀切碎， 加入1600 l DAPI染色溶液20放置20min使用38 m过滤样本， 使用流式 细胞仪测量。 0009 进一步地， 所述细胞核缓冲提取液包含100mmol/L柠檬酸、 体积分数为0.5pH3 的Tween-80、 400mmol/L的七水和磷酸氢二钠； 流式细胞仪测量时， 电压设置为400mV， 流速 设置为0.4 l/s。 0010 进一步地， 采用扫描电镜测量萱草叶片的气孔， 在上午9-11点自然。

11、光照下， 选取正 常生理状态萱草向阳面叶片， 剪取上半部分叶片， 去除叶尖， 放入植物组织固定液中后置于 说明书 1/8 页 3 CN 111157575 A 3 冰盒保存， 采用扫描电子显微镜测量萱草气孔数据。 0011 进一步地， 植物组织固定液为浓度为65无水乙醇、 6乙酸和5甲醛的混合液。 0012 优选地， 若要长久保存， 所述植物组织固定液还包括46ml甘油， 以防止蒸发和材 料变硬， 作为保存液使用。 0013 进一步地， 所述测量气孔导度的方法为： 在上午9-11点自然光照下， 选取正常生理 状态萱草叶片向阳面进行测定， 测定气孔导度(Gs)， 测定光强设置为1000 mol.。

12、m-2s-1。 0014 进一步地， 采用高精度红外测温仪测量萱草叶面温度。 0015 本发明由于采用以上技术方案， 使其与现有技术相比具有以下的优点和积极效 果： 0016 本发明根据蒸腾作用能够降低植物叶面温度， 建立了一种可大规模、 快速筛选耐 干旱萱草品种的方法。 太阳光照射到萱草叶片上师， 大部分能量从光能转变为热能。 萱草叶 面温度升高， 为防止萱草叶片被灼伤， 植物会通过气孔蒸腾作用散发水分， 水变为水蒸气的 过程中吸收热能， 从而降低萱草叶面温度。 研究发现， 植物的蒸腾作用是十分依赖气孔蒸腾 作用。 那么理论上来说， 相同生理状态下的萱草， 气孔密度大、 气孔导度高萱草蒸腾作。

13、用显 著， 叶面温度低， 同时水分丧失快， 抗干旱能力弱， 反之亦然。 因此， 本发明基于叶面温度初 步筛选， 然后通过测量萱草品种的细胞倍性、 气孔导度、 叶片的含水量、 离体叶片失水等指 标， 以及再通过自然干旱胁迫实验下的存活能力和复水试验后生长发育状况， 确认耐干旱 萱草品种。 因此， 本发明提供的筛选方法不需要做大量的干旱胁迫实验， 采用温度进行初步 筛选， 然后再进一步地进行确认实验即可。 附图说明 0017 图1为实施例1中 “猛子花” 品种模拟干旱胁迫实验在0d、 7d、 14d、 21d、 28d以及复水 7d之后的地上部分生长形态； 0018 图2为实施例2中 “冲里花” 。

14、品种模拟干旱胁迫实验在0d、 7d、 14d、 21d、 28d以及复水 7d之后的地上部分生长形态； 0019 图3为实施例3中 “午后” 品种模拟干旱胁迫实验在0d、 7d、 14d、 21d、 28d以及复水7d 之后的地上部分生长形态； 0020 图4为实施例4中 “X-12” 品种模拟干旱胁迫实验在0d、 7d、 14d、 21d、 28d以及复水7d 之后的地上部分生长形态； 0021 图5为实施例5中 “小拥抱” 品种模拟干旱胁迫实验在0d、 7d、 14d、 21d、 28d以及复水 7d之后的地上部分生长形态。 具体实施方式 0022 以下结合附图和具体实施例对本发明一种基于。

15、萱草叶面温度筛选耐干旱萱草的 方法进一步详细说明。 根据下面说明和权利要求书， 本发明的优点和特征将更清楚。 0023 实施例1 0024 一种基于萱草叶面温度筛选耐干旱萱草的方法， 包括以下步骤： 0025 (1)玻璃温室中央控制台显示实验环境具体数据， 室内温度29.4摄氏度， 室内湿度 95.2， 二氧化碳浓度1329PPM,光照强度15.7KL， 保持实验环境一致。 说明书 2/8 页 4 CN 111157575 A 4 0026 使用精密红外测温仪测量玻璃温室所有品种萱草叶面温度， 同一个品种选取五株 相同生理状态相似的同品种萱草进行测量， 每株萱草测量叶面三个点的温度取平均值作为。

16、 单株萱草叶面温度。 使用excel软件进行筛选排序， 筛选出叶面温度最高或者最低的萱草品 种。 0027 实施例一为一个叶面温度最高的萱草品种之一：猛子花 ， 测得叶面温度为32.6 (小数点保留一位)。 0028 (2)测定萱草细胞染色体倍性的方法： 取10mg新鲜、 幼嫩萱草叶片组织样本置于培 养皿中， 加入400 l核提取缓冲液， 使用锋利刀片切碎组织， 切割60-180秒保证萱草组织均 匀切碎， 加入1600 lDAPI染色溶液20放置20min， 使用38 m(400目)过滤样本， 使用流式细 胞仪上机测量， 电压设置400mV， 阈值调节至最大， 流速设置为0.4 l/s 猛子花。

17、 萱草品种测 量结果为二倍体。 0029 (3)测定气孔导度的方法： 在上午9-11点自然光照下， 选取 猛子花 品种萱草叶片 向阳面进行测定， 测定气孔导度(Gs)， 测定光强设置为1000 mol.m-2.s-1， 进行五次生物学 重复实验， 对测量结果取平均值，猛子花 品种萱草气孔导度为0.046mol H2O m-2s-1。 0030 (4)测定相对含水量的方法： 相对含水量RWC在早上8:00-10:00， 剪取 猛子花 品 种的萱草(生理状态相同)三片成熟的叶片， 迅速装入塑料袋封装。 同时置于冰盒中并迅速 带回实验室， 实验室保持恒温， 避光。 将实验材料从塑料取出， 擦干叶片上。

18、的水分， 用1/ 10000电子天平分别称量， 记录起始数据， 即样品鲜重Wf， 放入离心管中吸水24h后， 称饱和 重Wt， 然后将叶片放入70烘箱中烘干48h称干重Wd， 计算该品种萱草的相对含水量RWC (WfWd)|(Wt-Wd)， 实验重复三次， 取平均值。 0031 萱草未进行旱胁迫处理时， 测RWC为90.8； 萱草干旱处理7d后， 再次测RWC为 83.4； 萱草干旱处理14d后， 最后测RWC为73.8。 0032 (5)离体叶片失水率测量方法： 用小剪刀和小镊子分别从 猛子花 萱草上剪取3片 叶片置于称量纸上称重。 避免阳光直射， 放在室内弱光下,置于称量纸上， 不同时间(。

19、分别是 0h、 0.5h、 1h、 1.5h、 2h、 2.5h、 3h、 4h、 5h)称量叶片的重量,称量5次， 实验重复三次， 以此来计 算不同品种萱草叶片失水率， 记录猛子花叶片的失水数据(0.00、 0.00、 1 .59、 1.89、 3.17、 3.57、 4.76、 6.35、 7.94)。 0033 (6)扫描电镜测量气孔密度的方法： 在9-11点自然光照下， 选取正常生理状态萱草 向阳面叶片， 剪取上半部分叶片， 去除叶尖， 放入植物组织固定液中后置于冰盒保存， 采用 日立扫描电子显微镜(Hitachi S-3400N)测量萱草气孔数据， 使用ImageJ软件计算气孔数 据。

20、。 (数据汇总表1) 0034 (7)选择筛选出的 猛子花 进行干旱胁迫实验， 实验开始当天对实验材料充分浇 水， 置于玻璃温室保持较为恒定的外部环境， 之后不浇水持续28d， 拍照记录0d、 7d、 14d、 21d、 28d以及复水7d后的萱草地上形态部分， 观察萱草干旱实验下的存活能力以及复水后 生长发育状况， 参看图1， 从左至右是萱草在0d、 7d、 14d、 21d、 28d以及复水7d的生长形态， 观 察可知，猛子花 地上部分形态， 叶片干枯程度轻微， 复水后可快速恢复， 综合气孔导度、 相 对含水量、 离体叶片失水率和干旱胁迫实验结果等多方因素判断为耐干旱萱草品种。 0035 。

21、实施例2 0036 一种基于萱草叶面温度筛选耐干旱萱草的方法， 包括以下步骤： 说明书 3/8 页 5 CN 111157575 A 5 0037 (1)玻璃温室中央控制台显示实验环境具体数据， 室内温度29.4摄氏度， 室内湿度 95.2， 二氧化碳浓度1329PPM,光照强度15.7KL， 保持实验环境一致。 0038 使用精密红外测温仪测量玻璃温室所有品种萱草叶面温度， 同一个品种选取五株 相同生理状态相似的同品种萱草进行测量， 每株萱草测量叶面三个点的温度取平均值作为 单株萱草叶面温度。 使用excel软件进行筛选排序， 筛选出叶面温度最高或者最低的萱草品 种。 0039 实施例二为一。

22、个叶面温度最高的萱草品种之一：冲里花 ， 测得叶面温度为32.8 (小数点保留一位)。 0040 (2)测定萱草细胞倍性的方法： 取10mg新鲜、 幼嫩萱草叶片组织样本置于培养皿 中， 加入400 l核提取缓冲液， 使用锋利刀片切碎组织， 切割60-180秒保证萱草组织均匀切 碎， 加入1600 lDAPI染色溶液20放置20min， 使用38 m(400目)过滤样本， 使用流式细胞仪 上机测量， 电压设置400mV， 阈值调节至最大， 流速设置为0.4 l/s， 测量结果为二倍体。 0041 (3)测定气孔导度的方法： 在上午9-11点自然光照下， 选取 冲里花 品种萱草叶片 向阳面进行测定。

23、， 测定气孔导度(Gs)， 测定光强设置为1000 mol.m-2.s-1， 进行五次生物学 重复实验， 对测量结果取平均值，猛子花 品种萱草气孔导度为0.028mol H2O m-2s-1。 0042 (4)测定相对含水量的方法： 相对含水量RWC在早上8:00-10:00， 剪取 冲里花 品 种的萱草(生理状态相同)三片成熟的叶片， 迅速装入塑料袋封装。 同时置于冰盒中并迅速 带回实验室， 实验室保持恒温， 避光。 将实验材料从塑料取出， 擦干叶片上的水分， 用1/ 10000电子天平分别称量， 记录起始数据， 即样品鲜重Wf， 放入离心管中吸水24h后， 称饱和 重Wt， 然后将叶片放入。

24、70烘箱中烘干48h称干重Wd， 计算该品种萱草的相对含水量RWC (Wf-Wd)|(Wt-Wd),实验重复三次， 取平均值。 0043 萱草未进行干旱胁迫处理时， 测RWC为90.7； 待萱草干旱处理7d后， 再次测RWC为 81.7； 待萱草干旱处理14d后， 最后测RWC为75.6。 0044 (5)测量离体叶片失水率： 用小剪刀和小镊子分别从 冲里花 萱草上剪取3片叶片 置于称量纸上称重。 避免阳光直射， 放在室内弱光下,置于称量纸上， 不同时间(分别是0h、 0.5h、 1h、 1.5h、 2h、 2.5h、 3h、 4h、 5h)称量叶片的重量,称量5次， 实验重复三次， 以此来计。

25、算 不同品种萱草叶片失水率， 待叶片出现萎蔫后， 记录冲里花叶片的失水数据(0.00、 2.13、 4.26、 5.67、 7.09、 8.51、 9.93、 10.64、 12.77)。 0045 (6)扫描电镜测量气孔密度的方法： 在9-11点自然光照下， 选取正常生理状态萱草 向阳面叶片， 剪取上半部分叶片， 去除叶尖， 放入植物组织固定液中后置于冰盒保存， 采用 日立扫描电子显微镜(Hitachi S-3400N)测量萱草气孔数据， 使用ImageJ软件计算气孔数 据(数据汇总至表一)。 0046 (7)选择筛选出的 冲里花 进行干旱胁迫实验， 实验开始当天对实验材料充分浇 水， 置于。

26、玻璃温室保持较为恒定的外部环境， 之后不浇水持续28d， 拍照记录0d、 7d、 14d、 21d、 28d以及复水7d后的萱草地上形态部分， 参看图2， 从左至右是萱草在0d、 7d、 14d、 21d、 28d以及复水7d的生长形态， 观察萱草干旱实验下的存活能力以及复水后生长发育状况， 冲里花 地上部分形态， 叶片干枯程度轻微， 复水后可快速恢复， 综合气孔导度、 相对含水 量、 离体叶片失水率和干旱胁迫实验结果等多方因素判断为耐干旱萱草品种。 0047 实施例3 说明书 4/8 页 6 CN 111157575 A 6 0048 一种基于萱草叶面温度筛选耐干旱萱草的方法， 包括以下步骤。

27、： 0049 (1)玻璃温室中央控制台显示实验环境具体数据， 室内温度29.4摄氏度， 室内湿度 95.2， 二氧化碳浓度1329PPM,光照强度15.7KL， 保持实验环境一致。 0050 使用精密红外测温仪测量玻璃温室所有品种萱草叶面温度， 每个品种选取五株相 同生理状态相似的同品种萱草进行测量， 每株萱草测量叶面三个点的温度取平均值作为单 株萱草叶面温度。 使用excel软件进行筛选排序， 筛选叶面温度最高或者最低的萱草品种。 0051 实施例三为筛选出的叶片表面温度最低之一的萱草品种：午后 ， 测得叶面温度 为29.1(小数点保留一位)。 0052 (2)测定萱草细胞倍性的方法： 取1。

28、0mg新鲜、 幼嫩萱草叶片组织样本置于培养皿 中， 加入400 l核提取缓冲液， 使用锋利刀片切碎组织， 切割60-180秒保证萱草组织均匀切 碎， 加入1600 lDAPI染色溶液20放置20min， 使用38 m(400目)过滤样本， 使用流式细胞仪 上机测量， 电压设置400mV， 阈值调节至最大， 流速设置为0.4 l/s， 测量结果为四倍体。 0053 (3)测定气孔导度的方法： 在上午9-11点自然光照下， 选取 午后 品种萱草叶片向 阳面进行测定， 测定气孔导度(Gs)， 测定光强设置为1000 mol.m-2 .s-1， 进行五次生物学重 复实验， 对测量结果取平均值，午后 品。

29、种萱草气孔导度为0.059mol H2O m-2s-1。 0054 (4)测定相对含水量的方法： 相对含水量RWC在早上8:00-10:00， 剪取 午后 品种 的萱草(生理状态相同)三片成熟的叶片， 迅速装入塑料袋封装。 同时置于冰盒中并迅速带 回实验室， 实验室保持恒温， 避光。 将实验材料从塑料取出， 擦干叶片上的水分， 用1/10000 电子天平分别称量， 记录起始数据， 即样品鲜重Wf， 放入离心管中吸水24h后， 称饱和重Wt， 然后将叶片放入70烘箱中烘干48h称干重Wd， 计算该品种萱草的相对含水量RWC(Wf- Wd)|(Wt-Wd),实验重复三次， 取平均值。 0055 萱。

30、草未进行干旱胁迫处理时， 测RWC为87.9； 萱草干旱处理7d后， 再次测RWC为 83.9； 萱草干旱处理14d后， 最后测RWC为70.7。 0056 (5)测定离体叶片失水率： 用小剪刀和小镊子分别从 午后 萱草上剪取3片叶片置 于称量纸上称重。 避免阳光直射， 放在室内弱光下,置于称量纸上， 不同时间(分别是0h、 0.5h、 1h、 1.5h、 2h、 2.5h、 3h、 4h、 5h)称量叶片的重量,称量5次， 实验重复三次， 以此来计算 不同品种萱草叶片失水率， 待叶片出现萎蔫后， 记录叶片的失水数据(0.00、 1.60、 3.20、 4.80、 7.20、 8.00、 9.。

31、60、 11.20、 12.00)。 0057 (6)扫描电镜测量气孔密度的方法： 在9-11点自然光照下， 选取正常生理状态萱草 向阳面叶片， 剪取上半部分叶片， 去除叶尖， 放入植物组织固定液中后置于冰盒保存， 采用 日立扫描电子显微镜(Hitachi S-3400N)测量萱草气孔数据， 使用ImageJ软件计算气孔数 据。 (数据汇总表一) 0058 (7)选择筛选出的 午后 进行干旱胁迫实验， 实验开始当天对实验材料充分浇水， 置于玻璃温室保持较为恒定的外部环境， 之后不浇水持续28d， 拍照记录0d、 7d、 14d、 21d、 28d以及复水7d后的萱草地上形态部分， 参看图3， 。

32、从左至右是萱草在0d、 7d、 14d、 21d、 28d以 及复水7d的生长形态， 观察萱草干旱实验下的存活能力以及复水后生长发育状况， 观察可 知，午后 地上部分形态， 叶片干枯程度严重， 占整株二分之一， 复水后需人工剪除枯枝后 恢复， 综合气孔导度、 相对含水量、 离体叶片失水率和干旱胁迫实验结果等多方因素判断不 耐干旱萱草品种。 说明书 5/8 页 7 CN 111157575 A 7 0059 实施例4 0060 一种基于萱草叶面温度筛选耐干旱萱草的方法， 包括以下步骤： 0061 (1)玻璃温室中央控制台显示实验环境具体数据， 室内温度29.4摄氏度， 室内湿度 95.2， 二氧。

33、化碳浓度1329PPM,光照强度15.7KL， 保持实验环境一致。 0062 使用精密红外测温仪测量玻璃温室所有品种萱草叶面温度， 每个品种选取五株相 同生理状态相似的同品种萱草进行测量， 每株萱草测量叶面三个点的温度取平均值作为单 株萱草叶面温度。 使用excel软件进行筛选排序， 筛选叶面温度最高或者最低的萱草品种。 0063 实例一为筛选出的叶片表面温度最低之一的萱草品种：X-12 ， 测得叶面温度为 29.1(小数点保留一位)。 0064 (2)测定萱草细胞倍性的方法： 使用： 取10mg新鲜、 幼嫩萱草叶片组织样本置于培 养皿中， 加入400 l核提取缓冲液， 使用锋利刀片切碎组织，。

34、 切割60-180秒保证萱草组织均 匀切碎， 加入1600 lDAPI染色溶液20放置20min， 使用38 m(400目)过滤样本， 使用流式细 胞仪上机测量， 电压设置400mV， 阈值调节至最大， 流速设置为0.4 l/s， 测量结果为四倍体。 0065 (3)测定气孔导度的方法： 在上午9-11点自然光照下， 选取 X-12 品种萱草叶片向 阳面进行测定， 测定气孔导度(Gs)， 测定光强设置为1000 mol.m-2.s-1， 进行五次生物学重 复实验， 对测量结果取平均值，X-12 品种萱草气孔导度为0.085mol H2O m-2s-1。 0066 (4)测定相对含水量的方法： 。

35、相对含水量RWC在早上8:00-10:00， 剪取 X-12 品种 的萱草(生理状态相同)三片成熟的叶片， 迅速装入塑料袋封装。 同时置于冰盒中并迅速带 回实验室， 实验室保持恒温， 避光。 将实验材料从塑料取出， 擦干叶片上的水分， 用1/10000 电子天平分别称量， 记录起始数据， 即样品鲜重Wf， 放入离心管中吸水24h后， 称饱和重Wt， 然后将叶片放入70烘箱中烘干48h称干重Wd， 计算该品种萱草的相对含水量RWC(Wf- Wd)|(Wt-Wd),实验重复三次， 取平均值。 0067 萱草未进行干旱胁迫处理时， 测RWC为92.1； 待萱草干旱处理7d后， 再次测RWC为 85.。

36、8； 待萱草干旱处理14d后， 最后测RWC为78.8。 0068 (5)测定离体叶片失水率： 用小剪刀和小镊子分别从 X-12 萱草上剪取3片叶片置 于称量纸上称重。 避免阳光直射， 放在室内弱光下,置于称量纸上， 不同时间(分别是0h、 0.5h、 1h、 1.5h、 2h、 2.5h、 3h、 4h、 5h)称量叶片的重量,称量5次， 实验重复三次， 以此来计算 该品种萱草叶片失水率， 待叶片出现萎蔫后， 记录x-12叶片的失水数据(0.00、 2.02、 4.04、 6.06、 8.08、 10.10、 12.12、 13.13、 15.15)。 0069 (6)所述的扫描电镜测量气孔。

37、密度的方法： 在9-11点自然光照下， 选取正常生理状 态萱草向阳面叶片， 剪取上半部分叶片， 去除叶尖， 放入植物组织固定液中后置于冰盒保 存， 采用日立扫描电子显微镜(Hitachi S-3400N)测量萱草气孔数据， 使用ImageJ软件计算 气孔数据。 (数据汇总表一)。 0070 (7)选择筛选出的 X-12 进行干旱胁迫实验， 实验开始当天对实验材料充分浇水， 置于玻璃温室保持较为恒定的外部环境， 之后不浇水持续28d， 拍照记录0d、 7d、 14d、 21d、 28d以及复水7d后的萱草地上形态部分， 参看图4， 从左至右是萱草在0d、 7d、 14d、 21d、 28d以 及。

38、复水7d的生长形态， 观察萱草干旱实验下的存活能力以及复水后生长发育状况， 观察 X- 12 地上部分形态， 叶片干枯程度严重， 干枯枝叶占整株植物三分之二， 需人工帮助， 剪除干 枯职业， 更换盆土后可恢复， 综合气孔导度、 相对含水量、 离体叶片失水率和干旱胁迫实验 说明书 6/8 页 8 CN 111157575 A 8 结果等多方因素判断为不耐干旱萱草品种。 0071 实施例5 0072 1.一种基于萱草叶面温度筛选耐干旱萱草的方法， 包括以下步骤： 0073 (1)玻璃温室中央控制台显示实验环境具体数据， 室内温度29.4摄氏度， 室内湿度 95.2， 二氧化碳浓度1329PPM,光。

39、照强度15.7KL， 保持实验环境一致。 0074 使用精密红外测温仪测量玻璃温室所有品种萱草叶面温度， 每个品种选取五株相 同生理状态相似的同品种萱草进行测量， 每株萱草测量叶面三个点的温度取平均值作为单 株萱草叶面温度。 使用excel软件进行筛选排序， 筛选叶面温度最高或者最低的萱草品种。 0075 实例一为筛选出的叶片表面温度最低之一的萱草品种：小拥抱 ， 测得叶面温度 为29.1(小数点保留一位)。 0076 (2)测定萱草细胞倍性的方法： 使用： 取10mg新鲜、 幼嫩萱草叶片组织样本置于培 养皿中， 加入400 l核提取缓冲液， 使用锋利刀片切碎组织， 切割60-180秒保证萱草。

40、组织均 匀切碎， 加入1600 lDAPI染色溶液20放置20min， 使用38 m(400目)过滤样本， 使用流式细 胞仪上机测量， 电压设置400mV， 阈值调节至最大， 流速设置为0.4 l/s， 测量结果为二倍体。 0077 (3)测定气孔导度的方法： 在上午9-11点自然光照下， 选取 小拥抱 品种萱草叶片 向阳面进行测定， 测定气孔导度(Gs)， 测定光强设置为1000 mol.m-2.s-1， 进行五次生物学 重复实验， 对测量结果取平均值，小拥抱 品种萱草气孔导度为0.085mol H2Om-2s-1。 0078 (4)测定相对含水量的方法： 相对含水量RWC在早上8:00-1。

41、0:00， 剪取 小拥抱 品 种的萱草(生理状态相同)三片成熟的叶片， 迅速装入塑料袋封装。 同时置于冰盒中并迅速 带回实验室， 实验室保持恒温， 避光。 将实验材料从塑料取出， 擦干叶片上的水分， 用1/ 10000电子天平分别称量， 记录起始数据， 即样品鲜重Wf， 放入离心管中吸水24h后， 称饱和 重Wt， 然后将叶片放入70烘箱中烘干48h称干重Wd， 计算该品种萱草的相对含水量RWC (Wf-Wd)|(Wt-Wd),实验重复三次， 取平均值。 0079 萱草未进行干旱胁迫处理时， 测RWC为88.2； 萱草干旱处理7d后， 再次测RWC为 74.2； 萱草干旱处理14d后， 最后测。

42、RWC为68.3。 0080 (5)离体叶片失水率用小剪刀和小镊子分别从 小拥抱 萱草上剪取3片叶片置于 称量纸上称重。 避免阳光直射， 放在室内弱光下,置于称量纸上， 不同时间(分别是0h、 0.5h、 1h、 1.5h、 2h、 2.5h、 3h、 4h、 5h)称量叶片的重量,称量5次， 实验重复三次， 以此来计算不同品 种萱草叶片失水率， 待叶片出现萎蔫后， 记录小拥抱叶片的失水数据(0.00、 1.92、 1.92、 3.85、 5.77、 5.77、 7.69、 9.62、 11.54)。 0081 (6)扫描电镜测量气孔密度的方法： 在9-11点自然光照下， 选取正常生理状态萱草。

43、 向阳面叶片， 剪取上半部分叶片， 去除叶尖， 放入植物组织固定液中后置于冰盒保存， 采用 日立扫描电子显微镜(Hitachi S-3400N)测量萱草气孔数据， 使用ImageJ软件计算气孔数 据。 (数据汇总表一) 0082 (7)选择筛选出的 小拥抱 进行干旱胁迫实验， 实验开始当天对实验材料充分浇 水， 置于玻璃温室保持较为恒定的外部环境， 之后不浇水持续28d， 拍照记录0d、 7d、 14d、 21d、 28d以及复水7d后的萱草地上形态部分， 参看图5， 从左至右是萱草在0d、 7d、 14d、 21d、 28d以及复水7d的生长形态， 观察萱草干旱实验下的存活能力以及复水后生长。

44、发育状况， 观 察 小拥抱 地上部分形态， 叶片干枯程度严重， 干枯枝叶占整株植物三分之二， 需人工帮 说明书 7/8 页 9 CN 111157575 A 9 助， 剪除干枯职业， 更换盆土后可恢复， 综合气孔导度、 相对含水量、 离体叶片失水率和干旱 胁迫实验结果等多方因素判断为不耐干旱萱草品种。 0083 在以上实施例中测定气孔导度的方法是采用美国LI-COR公司的LI-6400XT便携式 光合作用测量系统； 在测量细胞倍性的方法中， 细胞核提取液包含100mmol/L柠檬酸、 体积 分数为0.5pH3的Tween-80、 400mmol/L的七水和磷酸氢二钠； 采用电子显微镜观察萱草 。

45、植物组织时， 采用的植物组织固定液包含65无水乙醇， 6乙酸， 5甲醛(福尔马林)。 0084 表1各品种萱草的气孔密度数据汇总 0085 0086 综上所述， 本发明根据蒸腾作用能够降低植物叶面温度， 建立了一种可大规模、 快 速筛选耐干旱萱草品种的方法。 太阳光照射到萱草叶片上师， 大部分能量从光能转变为热 能。 萱草叶面温度升高， 为防止萱草叶片被灼伤， 植物会通过气孔蒸腾作用散发水分， 水变 为水蒸气的过程中吸收热能， 从而降低萱草叶面温度。 研究发现， 植物的蒸腾作用是十分依 赖气孔蒸腾作用。 那么理论上来说， 相同生理状态下的萱草， 气孔密度大、 气孔导度高萱草 蒸腾作用显著， 叶。

46、面温度低， 同时水分丧失快， 抗干旱能力弱， 反之亦然。 因此， 本发明基于 叶面温度初步筛选， 然后通过测量萱草品种的细胞倍性、 气孔导度、 叶片的含水量、 离体叶 片失水等指标， 以及再通过自然干旱胁迫实验下的存活能力和复水试验后生长发育状况， 确认耐干旱萱草品种。 因此， 本发明提供的筛选方法不需要做大量的干旱胁迫实验， 采用温 度进行初步筛选， 然后再进一步地进行确认实验即可。 0087 本发明的方法从宏观(萱草地面形态部分)到微观(萱草气孔及其生理状态)都进 行了切实可行的实验， 获得大量实验数据。 因此具有筛选结果准确， 成本较低， 筛选周期较 短等优点。 本发明的方法尤其在面对大规模， 多品种的萱草筛选实验， 可以快速、 高效、 准确 获得抗旱干优质种质资源， 对萱草抗旱研究及育种具有一定参考价值。 0088 上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明， 但是本发明并不限于上述实施 方式。 即使对本发明作出各种变化， 倘若这些变化属于本发明权利要求及其等同技术的范 围之内， 则仍落入在本发明的保护范围之中。 说明书 8/8 页 10 CN 111157575 A 10 图1 图2 图3 图4 说明书附图 1/2 页 11 CN 111157575 A 11 图5 说明书附图 2/2 页 12 CN 111157575 A 12 。