禽新城疫病毒新型基因工程亚单位疫苗.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010118195.5 (22)申请日 2020.02.26 (66)本国优先权数据 201910145648.0 2019.02.27 CN (71)申请人 苏州世诺生物技术有限公司 地址 215000 江苏省苏州市苏州工业园区 若水路388号D座506室 (72)发明人 曹文龙孔迪滕小锘易小萍 张大鹤 (74)专利代理机构 南京利丰知识产权代理事务 所(特殊普通合伙) 32256 代理人 王锋 (51)Int.Cl. C12N 15/45(2006.01) C07K 1。

2、4/125(2006.01) A61K 39/17(2006.01) A61P 31/14(2006.01) (54)发明名称 禽新城疫病毒新型基因工程亚单位疫苗 (57)摘要 本申请提供了一种禽新城疫病毒新型基因 工程亚单位疫苗。 所述疫苗的制备方法包括： 优 化禽新城疫病毒(NDV)的HN蛋白、 F蛋白的编码基 因； 分别克隆包含优化后HN、 F蛋白编码基因的真 核表达载体， 再分别转染CHO细胞， 并筛选出悬浮 稳定高效表达重组HN、 F蛋白的CHO细胞株进行培 养， 之后分离得到重组HN、 F蛋白； 将重组HN蛋白、 重组F蛋白与佐剂充分混匀。 本申请通过对NDV的 重要抗原蛋白HN蛋。

3、白、 F蛋白的编码基因进行优 化， 并使用CHO细胞进行真核表达， 蛋白糖基化充 分， 抗原蛋白免疫原性好， 安全性高， 表达量可达 到2-4g/L， 而且重组细胞能够大规模悬浮培养， 大大降低了疫苗制备的复杂程度， 工艺可控性 好， 批次间产品质量稳定， 并显著降低了生产成 本。 权利要求书1页 说明书40页 序列表15页 附图7页 CN 111154778 A 2020.05.15 CN 111154778 A 1.一种免疫组合物的制备方法， 其特征在于包括： 将优化的禽新城疫病毒的HN蛋白编 码基因、 F蛋白编码基因分别克隆到真核表达载体上， 得到重组真核表达载体， 之后将所述 重组真核。

4、表达载体转染CHO细胞， 再筛选获得能够悬浮稳定高效表达禽新城疫病毒重组HN 蛋白、 重组F蛋白的CHO细胞株且进行发酵培养， 之后分离得到所述重组HN蛋白、 重组F蛋白， 其后将所述重组HN蛋白和/或重组F蛋白与佐剂充分混匀， 即得所述免疫组合物； 所述重组 HN蛋白、 重组F蛋白的编码基因序列分别如SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:3所示。 2.根据权利要求1所述的的制备方法， 其特征在于： 所述重组HN蛋白、 重组F蛋白的氨基 酸序列分别如SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:4所示。 3.根据权利要求1所述的的制备方法， 其特征在于： 所述真核表达载体包括pSV2-。

5、GS、 pCI-GS或pcDNA4-GS， 优选为pCI-GS。 4.根据权利要求1所述的的制备方法， 其特征在于： 所述CHO细胞包括DG44、 DXB11、 CHO- K1或CHO-S细胞株， 优选为CHO-S。 5.根据权利要求1所述的的制备方法， 其特征在于： 所述佐剂包括白油、 硬脂酸铝、 司 本、 吐温的任意一种或者两种以上的组合， 优选为白油。 6.一种免疫组合物， 其特征在于包括禽新城疫病毒重组HN蛋白和/或重组F蛋白， 所述 重组HN蛋白、 重组F蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:4所示。 7.如权利要求6所述的免疫组合物， 其特征在于还包括。

6、药学上可接受的佐剂， 所述佐剂 包括白油、 硬脂酸铝、 司本、 吐温的任意一种或者两种以上的组合， 优选为白油。 8.由权利要求1-5中任一项所述方法制备的免疫组合物或者权利要求6-7中任一项所 述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对禽新城疫病毒抗原的免疫反应的药 剂的用途。 9.由权利要求1-5中任一项所述方法制备的免疫组合物或者权利要求6-7中任一项所 述的免疫组合物用于生产用于检测或预防动物受禽新城疫病毒感染的试剂中的用途。 10.由权利要求1-5中任一项所述方法制备的免疫组合物或者权利要求6-7中任一项所 述的免疫组合物在制备禽新城疫病毒基因工程亚单位疫苗中的用途。 权利要求书。

7、 1/1 页 2 CN 111154778 A 2 禽新城疫病毒新型基因工程亚单位疫苗 技术领域 0001 本申请涉及动物免疫药物技术领域， 具体而言， 涉及一种禽新城疫病毒新型基因 工程亚单位疫苗。 背景技术 0002 禽新城疫(Newcastle Disease,ND)是由禽新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的一种急性高度接触性传染病。 本病一年四季均可发生， 尤以寒冷和气候 多变季节多发。 该病主要特征是呼吸困难， 神经机能紊乱， 粘膜和浆膜出血和坏死。 禽新城 疫具有很高的发病率和病死率， 世界各地多有发生， 且一旦爆发将给禽养殖业带来毁灭性 打击。

8、， 是危害养禽业的一种主要传染病。 OIE将其列为A类疫病。 我国ND的发病率很高， 且死 亡率高达90以上， 严重危害我国鸡养殖业的健康发展。 0003 禽新城疫病毒(NDV)在分类上是属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒属 (Paramyxovirus)。 成熟的病毒粒子近圆形， 多数呈蝌蚪状， 直径为120-300nm， 具有囊膜， 内 含有一长螺旋状核衣壳， 直径17-18nm， 囊膜外有长约8-12nm的糖蛋白(HN和F)纤突。 F和HN 蛋白是重要的宿主保护性抗原， 能够诱导机体产生中和抗体(Stone-Hulslander J， Morrison TG.Det。

9、ection of an interaction between the HN and F proteins in Newcastle disease vims-in-fected cells.Jvirol， 1997； 71： 62876295.)。 F蛋白是NDV 感染细胞的必需蛋白， 它不仅能促进病毒囊膜与宿主细胞膜融合， 而且能促进相邻宿主细 胞之间发生融合， 是构成致病力的重要成分。 HN蛋白识别并吸附于细胞表面的受体， 参与病 毒粒子感染。 螺旋形核衣壳是由一个与蛋白相联结的单股RNA所形成， 具有RNA聚合酶活性， 它被一个双层脂质膜所包裹， 脂质膜内衬有一层特殊的M蛋白， 而脂。

10、质膜的外层又被具有纤 突的糖蛋白所覆盖， 使外形呈花穗状。 其中M蛋白是一种细胞核-细胞质穿梭蛋白， 在病毒基 因复制转录以及子代病毒粒子组装和释放过程中发挥了重要作用(DUAN Z Q， HU S L， LIU X F.Function compare-son of the matrix protein between Newcastle disease virus and other paramyxoviruses-a reviewJ.Acta Microbiologica Sinica， 2016， 56(7)： 10701078.(in Chinese).)。 0004 目前已公开专利。

11、申请中， 禽新城疫病毒的相关疫苗较多为全病毒灭活疫苗， 全病 毒苗生产过程中使用活病毒， 存在散毒的风险。 灭活过程可能存在灭活不彻底的风险。 如 CN106729689A公开了一种禽新城疫病毒灭活疫苗制备方法， 它使用鸡胚成纤维细胞悬浮培 养生产新城疫病毒灭活苗， 鸡胚成纤维细胞属于原代细胞非常难于培养， 病毒滴度不高。 发明内容 0005 本申请旨在提供一种免疫组合物、 其制备方法及在制备禽新城疫病毒新型基因工 程亚单位疫苗中的应用， 以解决现有技术中的问题。 0006 为了实现上述目的， 根据本申请的一个方面， 提供了一种免疫组合物的制备方法， 包括： 将优化的禽新城疫病毒的HN蛋白编码。

12、基因、 F蛋白编码基因分别克隆到真核表达载体 说明书 1/40 页 3 CN 111154778 A 3 上， 得到重组真核表达载体， 之后将所述重组真核表达载体转染CHO细胞， 再筛选获得能够 悬浮稳定高效表达禽新城疫病毒重组HN蛋白、 重组F蛋白的CHO细胞株且进行发酵培养， 之 后分离得到所述重组HN蛋白、 重组F蛋白， 其后将所述重组HN蛋白和/或重组F蛋白与佐剂充 分混匀， 即得所述免疫组合物。 0007 进一步的， 所述重组HN蛋白的编码基因为SEQ ID NO:1所示核酸序列或其保守性 变异序列， 但优选为前者。 0008 进一步的， 所述重组HN蛋白的编码基因序列为SEQ ID。

13、 NO:3所示核酸序列或其保 守性变异序列， 但优选为前者。 0009 进一步的， 所述保守性变异序列为与原始序列95以上相同的核酸序列。 0010 本申请的另一目的在于提供一种免疫组合物， 包含： 0011 采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者其与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95以上相同 的核酸分子编码的禽新城疫病毒重组HN蛋白； 0012 以及， 0013 采用SEQ ID NO:3的核酸分子或者与SEQ ID NO:3的核苷酸序列95以上相同的 核酸分子编码的禽新城疫病毒重组F蛋白。 0014 进一步的， 所述的禽新城疫病毒重组HN蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者。

14、 与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95以上相同的氨基酸序列， ， 但优选为前者。 0015 进一步的， 所述的禽新城疫病毒重组F蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或者与 SEQ ID NO:4的全长氨基酸序列95以上相同的氨基酸序列， 但优选为前者。 0016 本申请的另一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中 诱导针对禽新城疫病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。 0017 本申请的又一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于预防动物受禽 新城疫病毒感染的药剂的用途。 0018 本申请的又一目的在于提供一种核酸分子组合物， 包含SEQ ID NO:1的顺序核苷。

15、 酸序列或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95以上相同的用于编码禽新城疫病毒NH蛋白的 顺序核苷酸序列； 以及， 0019 包含SEQ ID NO:3的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:3的核苷酸序列95以上 相同的用于编码禽新城疫病毒F蛋白的顺序核苷酸序列。 0020 本申请的又一目的在于提供一种所述的核酸分子用于生产用于在受试动物中诱 导针对禽新城疫病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。 0021 本申请的又一目的在于提供一种所述的核酸分子用于生产用于预防动物受禽新 城疫病毒感染的药剂的用途。 0022 本申请的又一目的在于提供所述的免疫组合物在制备禽新城疫病毒基因工程亚 单位疫苗中。

16、的用途。 0023 进一步的， 制备所述疫苗时， 可以单独使用所述重组HN蛋白者或者所述重组F蛋 白， 也可以将两者混合使用， 优选将该两种重组蛋白等比例混合使用。 0024 本申请的又一目的在于提供一种蛋白组合物， 其选自由以下组成的组： 0025 SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95以上相同 的氨基酸序列； 说明书 2/40 页 4 CN 111154778 A 4 0026 SEQ ID NO:4的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:4的全长氨基酸序列95以上相同 的氨基酸序列。 0027 本申请的又一目的在于提供一种适用于在受试动物体内产生。

17、针对禽新城疫病毒 的免疫反应的免疫组合物， 包含： 0028 所述的蛋白组合物， 和， 0029 佐剂。 0030 进一步， 所述佐剂选自白油(M52)、 硬脂酸铝、 司本、 吐温的一种或者两种以上的组 合， 且不限于此， 优选为白油。 0031 本申请提供了一种CHO细胞表达的重组禽新城疫病毒HN和F蛋白以及亚单位疫苗 的制备方法和应用， 并证明该疫苗能够在鸡体内产生较强的体液免疫， 免疫后的鸡能够抵 御强毒攻毒， 属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域， 其目的在于提供一种可大规模工业 化生产的鸡传染性鼻气管炎病毒重组亚单位疫苗的制备方法： 先分别克隆包含重组HN以及 F蛋白编码基因的真核表达。

18、载体， 然后分别转染CHO细胞， 通过选择， 筛选得到悬浮稳定高效 表达HN和F蛋白的CHO细胞株； 发酵培养上述的细胞株， 浓缩纯化后得到重组HN以及F蛋白； 最后将重组HN和重组F蛋白充分混合， 然后与佐剂充分混匀得到重组表达亚单位疫苗。 0032 特别是， 本申请通过对禽新城疫病毒的HN蛋白编码基因、 F蛋白编码基因进行优 化， 使得最终被表达的重组HN蛋白、 重组F蛋白的C端添加有NDV M蛋白的C端序列(参见Seq ID:NO:13)， 进而使得所述重组HN蛋白和重组F蛋白能够通过这个片段相互作用， 从而能够 组装成 “圆球” 样多聚体的结构， 亦即形成重组HN蛋白和重组F蛋白的聚合。

19、物， 使其免疫原性 得到显著提升， 免疫效果不仅远远优于将现有HN蛋白及F蛋白混合使用的免疫效果， 也远远 优于将重组HN蛋白及重组F蛋白单独使用或者HN蛋白与F蛋白的融合蛋白的免疫效果。 0033 进一步的， 本申请的重组HN蛋白、 重组F蛋白中还添加有N蛋白T细胞表位， 并且串 联重复两次(参见Seq ID:NO:11)， 可以增加HI抗体激发能力， 从更显著的增加免疫原性。 0034 更进一步的， 本申请的重组HN蛋白还针对血凝相关的关键表位做了一次串联重复 (参见Seq ID:NO:12)， 可以显著增加血凝抑制抗体， 增加HI抗体激发能力， 增加免疫原性。 0035 更进一步的， 本。

20、申请的重组F蛋白中， 还在F2片段疏水区的后面， 将VH氨基酸突变 了PP氨基酸， 形成一个 “柔性” 连接， 即柔性肽， 使得突变的F蛋白表达量显著提高。 0036 此外， 本申请提供的方法能够从细胞培养上清中收获目的蛋白， 且产量高达2-4g/ L， 不仅缩短了蛋白纯化时间和简化疫苗生产步骤， 也大大降低了疫苗生产成本。 0037 采用上述方案后， 本申请与现有技术相比较具有以下突出的优点和效果： 0038 (1)本申请提供一种免疫效果好、 工艺更安全的NDV基因工程亚单位疫苗， 为达到 以上目的， 本申请使用CHO细胞表达重组禽新城疫病毒HN和F蛋白。 NDV的病毒囊膜含有两个 重要抗原。

21、蛋白， 即融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)， 更易激发产生抗体， 保护更 全面。 0039 (2)本申请生产过程不涉及全病毒， 具有天然安全性， 通过此方法的表达量非常 高， 分泌到上清中， 易于纯化， 哺乳动物细胞真核表达， 表达糖基化修饰完善， 最接近原始的 分子。 悬浮培养， 易于大规模生产。 而全病毒苗生产过程中使用活病毒， 存在散毒的风险， 灭 活过程可能存在灭活不彻底的风险。 0040 (3)本申请使用CHO细胞表达NDV重要抗原蛋白HN和F蛋白， 使用真核表达， 蛋白糖 说明书 3/40 页 5 CN 111154778 A 5 基化充分， 抗原蛋白免疫原性好， 并。

22、且表达量非常高， 达到2-4g/L， 重组细胞能够大规模悬 浮培养， 大大降低了疫苗制备的复杂程度， 降低了生产成本。 免疫组合物可以大规模生产， 质控容易； 安全性高， 免疫原性好； 批次间稳定； 生产成本低。 附图说明 0041 图1为将HN-MC-NT基因PCR扩增后所获PCR产物进行凝胶电泳的结果； 其中1为HN- MC-NT基因； 2为阴性对照； M为分子量标记； 0042 图2为多个HN-MC-NT基因转化的菌落样品的PCR扩增后所获PCR产物进行凝胶电泳 的结果， 其中15均为HN-MC-NT基因转化的菌落样品PCR扩增后的产物， 6为阴性对照， M为 分子量标记； 0043 图。

23、3为构建好的真核表达载体PCI-HN-MC-NT-GS的图谱； 0044 图4为将F-MC-NT基因PCR扩增后所获PCR产物进行凝胶电泳的结果； 其中1为F-MC- NT基因； 2为阴性对照； M为分子量标记； 0045 图5为多个F-MC-NT基因转化的菌落样品的PCR扩增后所获PCR产物进行凝胶电泳 的结果， 其中15均为F-MC-NT基因转化的菌落样品PCR扩增后的产物， 6为阴性对照， M为分 子量标记； 0046 图6为构建好的真核表达载体PCI-F-MC-NT-GS的图谱； 0047 图7为实施例4中的细胞培养物上清进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果， 其中14为 BSA的四个梯。

24、度； 5为单独表达优化后HN-MC-NT蛋白的细胞培养物上清； 6为优化前HN-ori蛋 白的细胞培养物上清； 7为阴性对照； M为分子量标记； 0048 图8为实施例4中的细胞培养物上清进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果， 其中14为 BSA的四个梯度； 5为F-A蛋白的细胞培养物上清； 6为优化前F-ori蛋白的细胞培养物上清； 7 为优化后F-MC-NT蛋白的细胞培养物上清； M为分子量标记； 0049 图9为实施例5中表达HN-MC-NT蛋白重组CHO上清样品Western Blot检测结果， 其 中1为单独表达HN-MC-NT蛋白重组CHO上清样品； 2为阴性对照； M为分子量标记；。

25、 0050 图10为实施例5中表达F-MC-NT蛋白的重组CHO细胞培养物上清Western Blot检测 结果； 其中1为单独表达F-MC-NT蛋白的重组CHO细胞培养物上清； 2为阴性对照； M为分子量 标记； 0051 图11为实施例6中的电镜结果图； 0052 图12-图13分别是实施例8中的DLS分析结果。 具体实施方式 0053 鉴于现有技术的不足， 本申请人进行了大量研究和实践， 并最终得以提出一种免 疫效果好、 表达量更高以及工艺更安全的禽新城疫基因工程亚单位疫苗。 本申请的技术方 案主要是使用CHO细胞表达重组禽新城疫病毒HN和F蛋白胞外域。 更具体的讲， 本申请人于 长期研。

26、究中发现， M蛋白C端是M蛋白组装及M蛋白相互作用的主要位点， 所以分别在HN和F蛋 白的C端添加NDV M蛋白的C端序列， 发现表达的HN和F蛋白能够通过这个片段相互作用， 分 别组装成一个 “圆球” 样多聚体的结构， 从而显著提高免疫原性。 另外在HN蛋白添加了NDV N 蛋白的T包表位以及串联重复了一个血凝相关核心表位， 显著提高其免疫原性， 增加其血凝 说明书 4/40 页 6 CN 111154778 A 6 抑制(HI)抗体激发的水平， 得到优化的重组HN蛋白(其可以被定义为HN-MC-NT蛋白， HN表示 NDV HN蛋白的胞外区， MC表示M蛋白C端片段， NT表示N蛋白T细胞。

27、表位)。 在F蛋白添加了N蛋 白的T包表位， 同时在F2(F蛋白的裂解产物， 一个片段)蛋白的疏水区后面将两个氨基酸VH 突变成PP， 增加一个柔性连接片段， 显著提高F蛋白的表达量， 得到优化的重组F蛋白(其可 以被定义为F-MC-NT蛋白， F表示NDV F蛋白的胞外区， MC表示M蛋白C端片段， NT表示N蛋白T 细胞表位)。 将改造后的F-MC-NT和HN-MC-NT蛋白混合在一起， 免疫效果远远优于单独将天 然蛋白序列的HN和F蛋白胞外域混合在一起或者将两者做成一个融合蛋白的免疫效果。 0054 本申请生产过程中也不涉及全病毒， 具有天然安全性， 通过此方法的表达量非常 高， 分泌到。

28、上清中， 易于纯化， 哺乳动物细胞真核表达， 表达糖基化修饰完善， 最接近原始的 分子。 悬浮培养， 易于大规模生产。 0055 以下将结合具体实施案例对本申请的技术方案进行更为详细的说明。 0056 应该指出， 以下详细说明都是例示性的， 旨在对本申请提供进一步的说明。 除非另 有指明， 本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常 理解的相同含义。 0057 需要注意的是， 这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式， 而非意图限制根 据本申请的示例性实施方式。 如在这里所使用的， 除非上下文另外明确指出， 否则单数形式 也意图包括复数形式， 此外， 还应当理解的是。

29、， 当在本说明书中使用术语 “包含” 和/或 “包 括” 时， 其指明存在特征、 步骤、 操作、 器件、 组件和/或它们的组合。 0058 本申请提供了一种免疫组合物， 包含： 0059 采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95以上相同的 核酸分子(优选为前者)编码的禽新城疫病毒HN蛋白； 0060 以及， 0061 采用SEQ ID NO:3的核酸分子或者与SEQ ID NO:3的核苷酸序列95以上相同的 核酸分子(优选为前者)编码的禽新城疫病毒F蛋白。 0062 本申请也涉及一种诱导针对NDV抗原的免疫反应的方法， 所述方法包括向受试动 物施用本申请。

30、的疫苗。 0063 本申请也涉及一种保护受试动物免受NDV感染的方法， 所述方法包括向所述受试 动物施用本申请的疫苗。 0064 本申请还包括适用于诱导针对NDV的免疫反应的疫苗。 本申请的疫苗可包含上述 核酸分子的质粒。 核酸分子可被并入病毒颗粒中。 疫苗可还包含佐剂分子。 佐剂可为IL-12、 IL-15、 IL-28、 CTACK、 TECK、 血小板源性生长因子(PDGF)、 TNF 、 TNF 、 GM-CSF、 表皮生长因子 (EGF)、 IL-1、 IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-10、 IL-18、 IL-21、 IL-31、 IL-33或其组合； 并且在。

31、一 些实施方案中， 可为IL-12、 IL-15、 IL-28或RANTES。 0065 本文提供一种疫苗， 包括选自由以下组成的组的蛋白组合物： 包含SEQ ID NO:2 和/或4的蛋白； 在SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的整个长度上95相同的蛋白； SEQ ID NO:2或4的片段； 与SEQ ID NO:2或4的片段95相同的蛋白ID NO， 但优选为SEQ ID NO:2 和/或4的蛋白。 0066 本文还提供一种疫苗， 包括一种选自由以下组成的组的蛋白： (a)SEQ ID NO:2和/ 或4； (b)在如SEQ ID NO:2或4所述的全长序列的整个氨基酸序列长度上95相。

32、同的蛋白； 说明书 5/40 页 7 CN 111154778 A 7 (c)SEQ ID NO:2或4的包含SEQ ID NO:2的20个或更多个氨基酸的免疫原性片段； 以及(d) 在SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的整个长度上95相同的蛋白的包含20个或更多个氨基 酸的免疫原性片段； 但优选为组(a)。 0067 还提供一种疫苗， 包括包含编码上文所述的一种或多种蛋白分子的序列的核酸分 子。 在一些实施方案中， 所述核酸分子包含选自由以下组成的组的序列： SEQ ID NO:1和/或 3； 在SEQ ID NO:1或3的核苷酸序列的整个长度上95相同的核酸序列； SEQ ID NO:。

33、1或3的 片段； 与SEQ ID NO:1或3的片段95相同的核苷酸序列； 但优选为SEQ ID NO:1和/或3。 0068 本申请一些方面提供诱导针对NDV的免疫反应的方法， 所述方法包括以下步骤： 向 个体施用NDV抗原和/或其组合物。 0069 本申请另外的一些方面提供保护个体免受NDV感染的方法。 所述方法包括以下步 骤： 向所述个体施用预防有效量的包含此类核酸序列的核酸分子或组合物； 其中所述核酸 序列在所述个体的细胞中表达， 并且针对由所述核酸序列编码的蛋白诱导保护性免疫反 应。 0070 本申请的一些方面提供一种诱导针对NDV抗原的免疫反应的方法， 所述方法包括 向受试动物施用。

34、本申请的核酸分子。 0071 本申请的一些方面提供一种保护受试动物免受NDV感染的方法， 所述方法包括向 所述受试动物施用本申请的核酸分子。 0072 在另一方面， 本申请提供一种选自由以下组成的组的蛋白： (a)SEQ ID NO:2和/或 4； (b)在SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的整个长度上98相同的蛋白； (c)SEQ ID NO:2或4 的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段； 以及(d)在SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的 整个长度上98相同的蛋白的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段； 但优选为组(a)。 0073 本申请的一些方面提供一种适用于在受试动物中产。

35、生针对NDV的免疫反应的疫 苗， 所述疫苗包含： 本申请的核酸分子以及佐剂分子。 所述佐剂可为IL-12、 IL-15、 IL-28、 CTACK、 TECK、 血小板源性生长因子(PDGF)、 TNF 、 TNF 、 GM-CSF、 表皮生长因子(EGF)、 IL-1、 IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-10、 IL-18、 IL-21、 IL-31、 IL-33或其组合； 并且在一些实施方案 中， 可为IL-12、 IL-15、 IL-28或RANTES。 0074 本申请的疫苗可还包括一种或多种如上所述的核酸分子和一种或多种由所述核 酸分子编码的蛋白。 0075 1.。

36、定义. 0076 本文所用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的而并不旨在限制。 如在说明 书和所述权利要求中所使用， 除上下文另外明确规定之外， 单数形式 “一个” 、“一种” 和 “所 述” 包括复数形式。 0077 对于本文所列举的数值范围， 明确涵盖了在有相同精密度之间的每个插入的数 字。 例如， 对于6-9的范围， 除了6和9外还涵盖数字7和8， 并且对于6.0-7.0的范围， 明确涵盖 了数字6.0、 6.1、 6.2、 6.3、 6.4、 6.5、 6.6、 6.7、 6.8、 6.9以及7.0。 0078 如本文所用的 “佐剂” 意指被添加到本文所述的基因工程亚单位疫苗中来增强。

37、由 编码核酸序列的所编码的抗原免疫原性的任何分子。 0079 如本文所用的 “抗体” 意指类型IgG、 IgM、 IgA、 IgD或IgE的抗体， 或片段、 其片段或 衍生物， 包括Fab、 F(ab)2、 Fd以及单链抗体、 双链抗体、 双特异性抗体、 双功能抗体及其衍 说明书 6/40 页 8 CN 111154778 A 8 生物。 所述抗体可以是从动物的血清样本中分离出的抗体、 多克隆抗体、 亲和纯化抗体或其 混合物， 所述混合物对所需的表位或从其衍生的序列表现足够的结合特异性。 0080 如本文所用的 “编码序列” 或 “编码核酸” 意指包含编码蛋白的核苷酸序列的核酸 (RNA或DN。

38、A分子)。 所述编码序列可以进一步包括可操作地连接至调控元件的起始信号和终 止信号， 所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或动物的细胞中指导表达的启动子和多 聚腺苷酸化信号。 0081 如本文所用的 “互补体” 或 “互补” 意指核酸可以指在核苷酸或核酸分子的核苷酸 类似物之间的Watson-Crick(例如， A-T/U和C-G)或者Hoogsteen碱基配对。 0082 如本文所用的 “共有” 或 “共有序列” 意指基于分析特定NDV抗原的一队列的多个亚 型的多肽序列。 可制备编码共有多肽序列的核酸序列。 包含蛋白的疫苗可以被用来诱导针 对特定NDV抗原的多种亚型或血清型的广泛免疫， 所述。

39、疫苗包含编码这些蛋白的共有序列 和/或核酸分子。 0083 如本文可互换使用的 “电穿孔” 、“电-透化作用” 或 “电动增强” ( “EP” )意指使用跨 膜电场脉冲来诱导在生物膜中的微观途径(孔隙)； 它们的存在允许生物分子如质粒、 寡核 苷酸、 siRNA、 药物、 离子以及水从细胞膜的一侧流动到另一侧。 0084 如本文所用的相对于核酸序列的 “片段” 意指编码能够在与全长野生型病毒株NDV 抗原交叉反应的动物中引发免疫反应的多肽的核酸序列或其一部分。 所述片段可以是选自 编码下文所述的蛋白片段的各种核苷酸序列的至少一种的DNA片段。 0085 就多肽序列来说，“片段” 或 “免疫原性。

40、片段” 意指能够在与全长野生型病毒株NDV 抗原交叉反应的动物中引发免疫反应的多肽。 蛋白的片段可以包含蛋白的至少10、 至少 20、 至少30、 至少40、 至少50、 至少60、 至少70、 至少80、 至少90或至少 95。 在一些实施方案中， 蛋白的片段可以包含蛋白的至少20个氨基酸或更多、 至少30个氨 基酸或更多、 至少40个氨基酸或更多、 至少50个氨基酸或更多、 至少60个氨基酸或更多、 至 少70个氨基酸或更多、 至少80个氨基酸或更多、 至少90个氨基酸或更多、 至少100个氨基酸 或更多、 至少110个氨基酸或更多、 至少120个氨基酸或更多、 至少130个氨基酸或更多、。

41、 至少 140个氨基酸或更多、 至少150个氨基酸或更多、 至少160个氨基酸或更多、 至少170个氨基酸 或更多、 至少180个氨基酸或更多、 至少190个氨基酸或更多、 至少200个氨基酸或更多、 至少 210个氨基酸或更多、 至少220个氨基酸或更多、 至少230个氨基酸或更多或至少240个氨基 酸或更多。 0086 如本文所用的术语 “遗传构建体” 是指包含编码蛋白的核苷酸序列的DNA或RNA分 子。 所述编码序列包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号， 所述调控元件包 括能够在施用核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。 如本文所 用的术语 “表达形式” 是。

42、指基因构建体， 所述基因构建体含有可操作地连接至编码蛋白的编 码序列的必须的调控元件， 以使得当存在于所述个体的细胞中时， 编码序列将表达。 0087 如本文所用的术语 “同源性” 是指互补性程度。 可存在部分同源性或完全同源性 (即， 同一性)。 至少部分抑制完全互补序列杂交于靶标核酸的部分互补序列是使用功能术 语 “基本上同源” 来提及。 当关于如cDNA或基因组克隆的双链核酸序列使用时， 如本文所用 的术语 “基本上同源” 是指探针可在低严格性条件下杂交于双链核酸序列的链。 当关于单链 核酸序列使用时， 如本文所用的术语 “基本上同源” 是指探针可在低严格性条件下杂交于单 说明书 7/4。

43、0 页 9 CN 111154778 A 9 链核酸模板序列(即， 是单链核酸模板序列的互补序列)。 0088 在两种或更多种核酸或多肽序列的情况下， 如本文所用的 “相同” 或 “同一性” 意指 在指定区域中序列具有相同残基的指定百分比。 可以通过以下来计算所述百分比： 最佳地 比对两个序列、 在指定区域比较两个序列、 确定在两个序列中相同的残基的位置的数量以 产生匹配位置的数量、 以匹配位置的数量除以在指定区域内的位置的总数量， 并且将结果 乘以100以产生序列同一性的百分比。 在两个序列具有不同的长度或者比对产生一个或多 个交错的末端并且比较的指定区域仅包括单一序列的情况下， 单一序列的。

44、残基被包括在计 算的分母中而不是分子中。 当比较DNA和RNA时， 胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等 同的。 同一性可以手动地或者通过使用计算机序列算法如BLAST或者BLAST 2.0来执行。 0089 如本文所用的 “免疫反应” 意指响应于抗原如NDV共有抗原的引入， 宿主的免疫系 统(例如动物的免疫系统)的活化。 所述免疫反应可以是细胞反应或体液反应或两者的形 式。 0090 如本文所用的 “核酸” 或 “寡核苷酸” 或 “多核苷酸” 意指共价连接在一起的至少两 个核苷酸。 单链的描述还定义了互补链的序列。 因此， 核酸还涵盖了所描述的单链的互补 链。 核酸的很多变体可以被用于。

45、与给定的核酸相同的目的。 因此， 核酸还涵盖了基本上相同 的核酸和其互补体。 单链提供可以与靶序列在严格的杂交条件下杂交的探针。 因此， 核酸还 涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。 0091 核酸可以是单链的或者双链的或可以含有双链或者单链序列两者的部分。 所述核 酸可以是DNA、 基因组和cDNA两者、 RNA或杂合体， 其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和 核糖核苷酸的组合， 以及包括尿嘧啶、 腺嘌呤、 胸腺嘧啶、 胞嘧啶、 鸟嘌啉、 肌苷、 黄嘌呤次黄 嘌呤、 异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。 核酸可以通过化学合成方法或者通过重组方 法来获得。 0092 如本文所用的 “可操作地连接”。

46、 意指基因的表达是在空间上与之连接的启动子的 控制下进行的。 在其控制下， 启动子可以被定位在基因的5(上游)或者3(下游)。 所述启动 子和基因之间的距离可以大约与所述启动子和其在启动子从中衍化的基因中所控制的基 因之间的距离相同。 如本领域所已知， 这个距离的变化可以在没有失去启动子功能的情况 下进行调整。 0093 如本文所用的 “启动子” 意指合成的或自然来源的分子， 所述分子能够赋予、 活化 或增强细胞中的核酸的表达。 启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以便进一步增 强表达和/或改变其空间的表达和/或时间的表达。 启动子还可以包含远端增强子或阻遏元 件， 它们可以位于从转录的起。

47、始点开始的差不多几千对碱基对处。 启动子可以从包括病毒、 细菌、 真菌、 植物、 昆虫以及动物的来源中获得。 启动子可以相对于其中发生表达的细胞、 组 织或器官或相对于发生表达的发育阶段或响应于外部刺激如生理应激、 病原体、 金属离子 或诱导剂而基本地或区别地调控基因组分的表达。 启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动 子、 噬菌体T3启动子、 SP6启动子、 乳糖操纵子-启动子、 tac启动子、 SV40后期启动子、 SV40早 期启动子、 RSV-LTR启动子、 CMVIE启动子、 SV40早期启动子或者SV40后期启动子以及CMVIE 启动子。 0094 “信号肽” 和 “前导序列” 在本。

48、文可互换使用并且是指可以被连接在本文所述的NDV 蛋白的氨基末端的氨基酸序列。 信号肽/前导序列通常指示蛋白的位置。 本文所用的信号 说明书 8/40 页 10 CN 111154778 A 10 肽/前导序列优选地促进蛋白从产生其的细胞中分泌。 信号肽/前导序列常常从蛋白的剩余 部分裂解， 所述蛋白在从细胞分泌后经常被称为成熟蛋白。 信号肽/前导序列连接在所述蛋 白的N端。 0095 如本文所用的 “严格的杂交条件” 意指这样的条件， 即在所述条件下如在核酸的复 杂混合物中第一核酸序列(例如， 探针)将与第二核酸序列(例如， 靶标)进行杂交。 严格的条 件是序列依赖性的并且在不同的环境中将是。

49、不同的。 严格的条件在限定的离子强度pH下可 以被选择为比特定序列的热力学熔点(Tm)低约5-10。 所述Tm可以是这样的温度(在限定 的离子强度、 pH以及核酸浓度下)， 在所述温度下与靶标互补的50的探针与靶序列在平衡 状态下进行杂交(因为靶序列过量存在， 在Tm下， 50的探针在平衡状态下被占用)。 严格条 件可以是那些条件， 即其中盐浓度小于约1.0M的钠离子， 如在pH7.0至8.3下约0.01-1.0M的 钠离子浓度(或其它盐)， 并且温度对于短的探针(例如， 约10-50个核苷酸)为至少约30且 对于长的探针(例如， 大于约50个核苷酸)为至少约60。 严格的条件还可以通过添加去。

50、稳 定剂如甲酰胺来实现。 对于选择的或特定的杂交， 阳性信号可以是背景杂交的至少2至10 倍。 示例性的严格的杂交条件包括以下： 50甲酰胺、 5x SSC以及1SDS、 在42下孵育， 或 者5x SSC、 1SDS、 在65下孵育、 在65下用0.2x SSC和0.1SDS洗涤。 0096 如本文所用的 “基本上互补” 意指第一序列在8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95、 100、。