COPZ1作为脑胶质瘤治疗/预后判断靶点的应用.pdf
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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010196020.6 (22)申请日 2020.03.19 (71)申请人 山东大学齐鲁医院 地址 250012 山东省济南市历下区文化西 路107号 (72)发明人 李新钢王剑王东海倪石磊 黄斌张玉霖 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 李筝 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/02(2006.01) G01N 33/68(2006.01) G01N 33/574(2006.01) (54。
2、)发明名称 COPZ1作为脑胶质瘤治疗/预后判断靶点的 应用 (57)摘要 本发明具体涉及COPZ1作为脑胶质瘤治疗/ 预后判断靶点的应用。 本发明提供了COPZ1作为 治疗靶点, 可以显著地调节GBM细胞的铁代谢, 参 与细胞内运输、 内体成熟、 脂质稳态和自噬等过 程。 在胶质瘤患者中, COPZ1的过度表达与肿瘤分 级增加和预后不良相关。 与正常脑组织相比, GBM 组COPZ1蛋白水平显著升高。 COPZ1基因敲除可以 抑制胶质瘤细胞增殖。 本发明证实COPZ1基因敲 除直接激活NCOA4, 导致铁蛋白降解, 增加细胞内 亚铁水平, 从而触发Fenton反应, 导致胶质瘤细 胞铁死亡。。
3、 这些数据表明, COPZ1在铁代谢中起关 键作用, COPZ1/NCOA4/ATG7轴是一种新的人脑胶 质瘤治疗靶点。 权利要求书1页 说明书14页 序列表2页 附图12页 CN 111363820 A 2020.07.03 CN 111363820 A 1.COPZ1作为脑胶质瘤治疗/预后判断靶点的应用。 2.如权利要求1所述COPZ1作为脑胶质瘤治疗/预后判断靶点的应用, 其特征在于, 所述 治疗靶点的应用包括将COPZ1抑制剂作为抗脑胶质瘤活性成分, 或将COPZ1抑制剂应用于抗 脑胶质瘤药物制备的应用; 或所述预后判断靶点的应用包括将COPZ1含量检测试剂应用于 脑胶质瘤预后判断试剂。
4、的应用, 或预后判断试剂盒制备的应用。 3.COPZ1作为靶细胞铁调节剂的应用。 4.如权利要求3所述COPZ1作为靶细胞铁调节剂的应用, 其特征在于, 所述铁包括靶细 胞内铁离子、 与铁结合的转铁蛋白、 将转铁蛋白铁复合物转移到细胞内的转铁蛋白受体、 调 节亚铁的铁蛋白。 5.如权利要求3所述COPZ1作为靶细胞铁调节剂的应用, 其特征在于, 所述应用包括 COPZ1抑制剂作为铁离子、 与铁结合的转铁蛋白、 将转铁蛋白铁复合物转移到细胞内的转铁 蛋白受体激动剂的应用; 优选的, 所述COPZ1抑制剂作为亚铁离子激动剂的应用。 6.如权利要求3所述COPZ1作为靶细胞铁调节剂的应用, 其特征在。
5、于, 所述应用COPZ1抑 制剂作为调节亚铁的铁蛋白激动剂的应用。 7.COPZ1抑制剂作为脂质过氧化诱导剂或丙二醛激动剂的应用。 8.COPZ1抑制剂作为活性氧激动剂的应用; 优选的, 所述应用包括将COPZ1抑制剂作为 过氧化氢及超氧化物激动剂的应用, 所述超氧化物包括超氧自由基和高细胞毒性羟基自由 基。 9.COPZ1抑制剂作为自噬诱导剂的应用; 优选的, 所述应用包括COPZ1抑制剂作为LC3B- II激动剂、 或自噬底物SQSTM1抑制剂, 或自噬相关蛋白7激动剂的应用。 10.COPZ1抑制剂作为NCOA4激动剂的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111363820 A 2。
6、 COPZ1作为脑胶质瘤治疗/预后判断靶点的应用 技术领域 0001 本发明属于胶质瘤诊断标志物技术领域, 具体涉及COPZ1作为脑胶质瘤治疗/预后 判 断靶点的应用, 及COPZ1作为胶质瘤细胞铁代谢、 脂质过氧化或自噬途径调节剂的应用。 背景技术 0002 公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解, 而不必然 被视 为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技 术。 0003 胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是成人最常见的原发性恶性脑肿 瘤, 年发病率为5.26/10万。 尽管接受了最大限度的手术切除、。
7、 放疗和替莫唑胺治疗, 患者 的中 位生存期仍为14.6个月。 胶质瘤患者通常预后差, 生活质量差。 治疗GBM的目的是诱导 肿 瘤细胞死亡, 同时保留正常组织细胞。 然而, 肿瘤细胞通过激活应激适应反应使遗传或 表观 遗传变化而导致肿瘤耐药性, 因此了解这些保护反应的分子机制可能会提高治疗效 果。 0004 铁死亡是一种铁依赖型的调节性细胞死亡, 是致死性脂质过氧化的结果。 尽管铁 死亡的 生理功能尚不清楚, 但活性氧(ROS)的积累超过谷胱甘肽(GSH)维持的氧化还原含 量, 可诱发铁死亡。 铁是代谢酶的重要辅助因子, 与神经递质传递、 氧转运、 细胞分裂和能 量产 生等许多生物学过程紧密。
8、相关。 正常铁转运的中断可能导致细胞内铁浓度过高, 通过 芬顿 (Fenton)反应驱动细胞内ROS生成, 引发细胞内脂质过氧化, 最终对细胞产生细胞毒 作 用。 芬顿反应是一种催化过程, 它将亚铁和过氧化氢转化为一种剧毒的羟基自由基。 研 究表 明, 铁死亡与多种人类疾病有关, 如缺血性心脏病、 脑损伤、 肾衰和癌症。 然而, 目前对 铁 死亡在GBM中的作用知之甚少。 在过去10年中获得的大量证据表明, 铁吸收和铁利用的 变化是肿瘤细胞的基本特征, 铁代谢的变化是癌症的关键代谢特征。 与正常细胞相比, 癌细 胞改变了许多铁代谢相关蛋白的表达和铁相关酶的活性。 这些变化往往有助于癌细胞铁的 。
9、相 对高利用率, 并促进铁依赖蛋白的功能, 这些蛋白质参与许多生理过程, 如肿瘤的发生、 发 展和转移。 基于铁稳态重塑的策略为癌症治疗提供有希望的选择。 此外, 通过铁螯合剂 降低 细胞内铁含量、 靶向铁相关蛋白或提高细胞内铁水平被认为是治疗癌症的可行方法。 0005 目前的研究中, 一些蛋白质被证实参与了癌细胞对铁的吸收、 储存和利用, 包括铁 伴侣 多聚(rC)结合蛋白1(PCBP1)、 核受体辅活化因子(NCOA4)、 铁反应元件结合蛋白2 (IREB2) 和热休克蛋白 1(HSPB1)。 Coatomer蛋白复合物zeta 1(COPZ1)属于Coatomer蛋白 复 合物I(COP。
10、I), 参与细胞内运输、 内体成熟、 脂质稳态和自噬。 研究表明, COPZ1的耗竭 导 致甲状腺肿瘤细胞死亡, 提示其作为甲状腺癌治疗靶点的潜力。 此外, 在皮下异种移植模 型中局部注射si-COPZ1寡核苷酸可减少肿瘤生长。 此外, 还证实COPZ1参与HeLa细胞的 铁 代谢和铜绿假单胞菌的铜稳态。 说明书 1/14 页 3 CN 111363820 A 3 发明内容 0006 靶向铁相关蛋白或提高细胞内铁水平被认为是治疗癌症的可行方法。 因此, 重塑 铁稳态 的策略也可能成为GBM的一种有前途的治疗策略。 本发明的研究证实了, 降低COPZ1 的 表达会通过直接增加人GBM细胞中NCO。
11、A4蛋白而导致铁死亡, 并且进一步提供了 COPZ1/ NCOA4/FTH1通路涉及铁死亡, 这些发现不仅证实了COPZ1在铁死亡中的新作用, 而且为通 过诱导铁死亡治疗GBM患者提供了一个未来的治疗靶点。 0007 根据上述技术效果, 本发明提供以下技术方案: 0008 本发明第一方面, 提供COPZ1作为脑胶质瘤治疗/预后判断靶点的应用。 0009 本发明通过统计学方法胶质瘤细胞中COPZ1的含量与患病情况及不良预后具有相 关 性, 并且沉默COPZ1能够使胶质瘤细胞活力下降、 死亡率升高。 本发明通过进一步的研究 证实了COPZ1通过调节铁代谢、 脂质过氧化及自噬等途径诱导胶质瘤细胞死亡。
12、, 充分证明 了COPZ1可以作为胶质瘤预后判断及治疗的靶点, 可用于相应的胶质瘤治疗药物的开发。 0010 本发明第二方面, 提供COPZ1作为靶细胞铁调节剂的应用。 0011 所述铁包括靶细胞内铁离子(具体包括亚铁离子及三价铁离子)、 与铁结合的转铁 蛋白 (TF)、 将转铁蛋白铁复合物转移到细胞内的转铁蛋白受体(TFR)、 调节亚铁的铁蛋白 (FTH1)。 0012 铁在机体内与氧贮存、 运输和造血功能维持等方面具有重要的作用, 涉及癌细胞 死亡、 神经毒性、 缺血再灌注损伤和T细胞免疫等诸多生理过程。 本发明研究表明, COPZ1通 过 促进细胞内铁的转运参与调节胶质瘤细胞内铁代谢水平。
13、, 不仅为抗肿瘤药物开发提供 依据, 还有望将该结果应用于上述神经毒性、 缺血再灌注损伤和T细胞免疫等疾病相关试 剂的开 发。 0013 本发明第四方面, 提供COPZ1抑制剂作为脂质过氧化诱导剂或丙二醛激动剂的应 用。 0014 本发明第五方面, 提供COPZ1抑制剂作为活性氧激动剂的应用。 0015 本发明第六方面, 提供COPZ1抑制剂作为自噬诱导剂的应用。 0016 本发明第七方面, 提供COPZ1抑制剂作为NCOA4激动剂的应用。 0017 以上一个或多个技术方案的有益效果在于: 0018 1.COPZ1基因敲除能够直接激活NCOA4, 导致铁蛋白降解, 增加细胞内亚铁水平, 触 发。
14、 Fenton反应, 从而驱动胶质瘤细胞进入铁死亡状态, 确定了铁代谢诱导胶质瘤细胞铁依 赖性 反应的独特机制, 为胶质瘤的相关药物的开发提供了详尽的证据及治疗依据。 0019 2.上述方案有力地证明自噬通过增加细胞内铁代谢和细胞ROS积累在调节铁死亡 中起着重 要作用。 当COPZ1的缺失诱导铁蛋白降解时, 铁死亡被激活, 通过NCOA4介导的途 径降 解细胞内铁储存蛋白和铁蛋白。 因此, 亚铁水平升高, 可通过触发Fenton反应引起ROS 的 急剧增加, 从而导致脂质过氧化的积累和进一步的铁死亡。 因此, COPZ1/NCOA4/FTH1轴 和由此引起的铁上调可能是治疗胶质瘤的新靶点。 。
15、附图说明 0020 构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解, 本发明的示 意性实 施例及其说明用于解释本发明, 并不构成对本发明的不当限定。 说明书 2/14 页 4 CN 111363820 A 4 0021 图1为实施例1中人胶质瘤患者和胶质瘤细胞中COPZ1表达相关性结果图; 0022 其中, (A)为基于2016年WHO从TCGA数据库分类获取的COPZ1 RNA表达(log2); 0023 (B)基于TCGA数据集COPZ1高表达和低表达的患者总体生存数据的Kaplan-Meier 生存 分析; 0024 (C)(D)依次为从人脑胶质瘤组织(n9)和非肿瘤性脑组织。
16、(n3)制备的裂解液 (20 微克)中COPZ1蛋白水平的代表性Western blottingting分析, 3个独立实验的western blottingting统计结果; 0025 (E)(F)依次为人脑胶质瘤和非肿瘤性脑组织样本中IHC染色的代表性图像(正常, n6; WHOII, n18; WHOIII, n18; WHOIV, n18), 比例尺, 50 m和100 m; 图形结果显 示 IHC分数; 0026 (G)(H)依次为正常人星形胶质细胞和人脑胶质瘤细胞系中COPZ1蛋白水平的代表 性 western blottingting分析, 图中显示了3个独立实验的western。
17、 blottingting统计结 果; 0027 (I)对U87MG和U251细胞的COPZ1进行免疫荧光染色, 荧光显微镜下分析, 用DAPI、 比例尺、 10 m进行细胞核染色, 单因素方差分析进行多组比较: *p0.05, *p0.01, *p 0.001; 对数秩检验: p0.05。 0028 图2为实施例1中所述伦勃朗数据集; 0029 其中, (A)为基于2016年世界卫生组织伦勃朗数据库分类的COPZ1 RNA表达 (log2); 0030 (B)为Kaplan-Meier生存曲线根据Rembrandt数据集COPZ1的表达分析患者的总体 生存 数据, 数据显示为平均值每组的平均。
18、值(SEM)的标准误差, 多组比较的单因素方 差 分析: NS无显著性, *p0.01; 对数秩检验: p0.05。 0031 图3为实施例2中COPZ1沉默抑制GBM恶性表型并诱导细胞死亡结果图; 0032 其中, (A)用qRT-PCR方法检测感染两个独立COPZ1 siRNAs, si-COPZ1#1和si- COPZ1#2 的U87MG、 U251和P3#GBM细胞中COPZ1的mRNA水平; 0033 (B)转染si-COPZ1和si-COPZ1-2的U87MG、 U251和P3-GBM细胞COPZ1蛋白水平的 Western blottingting分析; 0034 (C)用CCK。
19、8法检测U87MG、 U251和P3#GBM细胞的活性; 0035 (D)(E)依次为用EdU法测定感染si-COPZ1#1的U87MG和U251细胞的增殖率, 细胞 核用DAPI染色(比例尺, 100 m), 转染si-COPZ1#1的U87MG和U251细胞中EdU阳性 细胞比率 的图示; 0036 (F)(G)依次为转染si-COPZ1#1的U251和P3#GBM细胞集落形成分析的代表性图 像, ; 0037 (H)乳酸脱氢酶释放试验结果; 0038 (I)(J)依次为对转染si-COPZ1#1的U251和P3#GBM细胞进行活/死分析的代表性图 像, 以评估细胞死亡率, 转染si-CO。
20、PZ1#1的U251和P3#GBM细胞死亡细胞率的图示(比例尺, 100 m), 两组比较的样本t检验: *p0.05, *p0.01, *p0.001; 多组比较的单向方差分 析: *p0.05, *p0.01, *p0.001。 0039 图4为实施例2中用Western blottingting法分析转染sh-COPZ1和sh-COPZ1的 说明书 3/14 页 5 CN 111363820 A 5 U87MG、 U251 和P3-GBM细胞COPZ1蛋白水平。 0040 图5为实施例3中COPZ1基因敲除引起铁代谢变化结果图; 0041 其中, (A)在转染si-COPZ1细胞24小时。
21、后, COPZ1的缺失增加了U87MG、 U251和P3- GBM 胶质瘤细胞内的总铁含量; 0042 (B)铁含量测定试剂盒显示结果; 0043 (C)(D)依次为JC-1探针染色的U87MG和U251细胞的代表性荧光图像(比例尺, 25 m); (E)透射电镜图像显示感染si-COPZ1细胞的U87MG细胞膜密度增加(白色箭头), 线粒 体和自噬体缩小(黑色箭头), 持续24小时; 0044 (F)蛋白印迹分析显示COPZ1基因敲除上调TFR、 TF的表达, U87MG、 U251和P3#GBM 胶质瘤细胞中的FTH1; t检验: *p0.05, *p0.01, *p0.001。 0045。
22、 图6为实施例3中荧光成像检测细胞内TFR结果图; 0046 其中, (A)荧光图像检测U87MG和U251细胞TFR蛋白及含量直方图, DAPI染色细胞 核, phalodiin染色肌动蛋白, 用GSH和GSSG试剂盒检测25 m; 0047 (B)细胞内GSH水平, 两组t检验比较: *p0.05, *p0.01, *p0.001。 0048 图7为实施例4细胞内铁的上调通过引起ROS和脂质过氧化而导致COPZ1基因敲除 诱导的 胶质瘤细胞死亡结果图; 0049 (A)丙二醛含量测定结果: COPZ1缺失可使si-COPZ1转染后48h的U87MG、 U251和 P3-GBM胶质瘤细胞中丙。
23、二醛含量升高; 0050 (B)丙二醛含量测定结果: DFO、 Fer-1或GSH预处理可阻止COPZ1基因敲除诱导的丙 二醛过多产生, 而FAC可使之加重; 0051 (C)铁分析结果: 在DFO存在下, 亚铁含量降低; 0052 (D)LDH释放实验结果: DFO和Fer-1可降低COPZ1缺失引起的胶质瘤细胞死亡率, FAC 可加重其死亡率; 0053 (E)具有代表性的二氢乙醚(DHE)图像显示: 超氧物探针检测到的红色荧光在48h 后显 著增强, 与各自的对照细胞相比, 转染si-COPZ1#1的U87MG和U251胶质瘤细胞系的荧 光强度的统计分析, 每组2个细胞系, 计数3个三倍。
24、实验图像(比例尺, 75 m.); 0054 (F)二氢乙醚(DHE)图像中超氧化物含量直方图; 0055 (G)过氧化氢分析显示P3#GBM细胞中的过氧化氢积聚, 两组比较的Student t检 验: 0056 *p0.05, *p0.01, *p0.001; 多组比较的单因素方差分析: NS无显著性, *p 0.05, *p0.01, *p0.001。 0057 图8为实施例4中FAC、 FO处理对胶质瘤细胞的影响结果图; 0058 (A)(B)依次为U87MG及U251丙二醛水平测定结果: FO、 Fer-1或GSH预处理可阻 止 COPZ1基因敲除引起的丙二醛过多产生, 而FAC可加重。
25、U87MG和U251细胞的丙二醛 过多产 生; 0059 (C)(D)依次用铁试剂盒检测U87MG和U251细胞系结果: 当DFO存在时, 亚铁水平降 低; 0060 (E)(F)依次为U87MG和U251乳酸脱氢酶释放试验结果: DFO可降低COPZ1耗竭引起 的胶质瘤细胞死亡率, FAC可使之加重, 多组比较的单因素方差分析: NS无显著性, 说明书 4/14 页 6 CN 111363820 A 6 0061 *p0.05, *p0.01, *p0.001。 0062 图9为实施例6中COPZ1耗竭诱导体外GBM细胞自噬结果图; 0063 (A)(B)依次为U87MG细胞中GFP/mCh。
26、erry-LC3B点状荧光图像及含量直方图(比例 尺, 25 m); 0064 (C)western blottings显示COPZ1耗尽后U87MG、 u251和P3-GBM细胞中LC3B、 SQSTM1 (p62)、 ATG7和ACTB(负载控制)的蛋白水平; 0065 (D)western blotting显示COPZ1缺失后U87MG、 u251和P3#GBM细胞中FTH1、 NCOA4 和ACTB的蛋白水平; 0066 (E)荧光图像显示NCOA4和COPZ1的细胞内定位, Alexa-NCOA4在正常U87MG和U251 细胞中广泛定位于胞浆, 并与FITC-COPZ1大量共定位(。
27、比例尺, 10 m, 放大图像比例尺, 1 m); 0067 (F)western blottings显示, 经3-MA(10mM)和CQ(3 M)预处理1h后, U87MG-sh- COPZ1 细胞中NCOA4和LC3B的水平, 数据代表3个独立实验; 0068 (G)在U87MG-sh-COPZ1细胞中, 用3-MA(10mM)和CQ(3 M)预处理1h后的相 对铁水 平; 0069 (H)U87MG-sh-COPZ1细胞经3-MA(10mM)和CQ(3 M)预处理1h后的细胞死亡率; 0070 (I)U87MG-sh-COPZ1细胞经3-MA(10mM)和CQ(3 M)预处理1h后MDA。
28、水平的 变化, 两 组比较的t检验: *p0.01; 多组比较的单因素方差分析: NS无显著性, *p0.01, *p 0.001。 0071 图10为实施例6中所述western及自噬相关研究结果图; 0072 (A)(B)依次为U87MG-sh-COPZ1#1和U251-sh-COPZ1#1细胞中的NCOA4和LC3B水 平; 0073 (C)为U251细胞中亚铁水平; 0074 (D)为P3#GBM细胞中亚铁水平; 0075 (E)为U251细胞死亡率; 0076 (F)为P3#GBM细胞死亡率; 0077 (G)为U251细胞中丙二醛(MDA)水平; 0078 (H)为P3#GBM细胞。
29、中丙二醛(MDA)水平; 0079 多组比较的单因素方差分析: NS无显著性, *p0.05, *p0.01, *p0.001。 0080 图11为实施例7中所述NCOA4介导铁蛋白的自噬传递并控制铁稳态结果图; 0081 (A)western blottingting显示感染si-NCOA4#1和si-NCOA4#2 48小时的U87MG、 U251 和P3#GBM胶质瘤细胞的NCOA4和ACTB水平; 0082 (B)有代表性的western blottingting显示P3#GBM细胞的NCOA4、 FTH1和ACTB水 平, 稳定表达sh-COPZ1#1和两个独立的si-NCOA4(s。
30、i-NCOA4#1和si-NCOA4#2); 0083 (C)稳定表达sh-COPZ1的U87MG、 U251和P3#GBM细胞中NCOA4基因敲除后的亚 铁水 平; 0084 (D)转染si-NCOA4#1的U87MG-sh-COPZ1#1、 U251-sh-COPZ1#1和P3#GBM-sh-COPZ1# 1 细胞中FTH1和ACTB的典型蛋白印迹; 0085 (E)siRNAs敲除NCOA4对稳定表达sh-COPZ1的U87MG、 U251和P3-GBM胶质瘤细 胞活 说明书 5/14 页 7 CN 111363820 A 7 力的影响; 0086 (F)siRNAs敲除NCOA4对稳定。
31、表达sh-COPZ1的U87MG、 U251和P3-GBM胶质瘤细 胞 MDA水平的影响; 0087 (G)si-NCOA4#1敲除NCOA4对U87MG-sh-COPZ1细胞DHE的影响, t检验: *p0.01; 多 组比较单向方差分析: *p0.05, *p0.01, *p0.001。 0088 图12为实施例7中所述胶质瘤细胞中铁代谢相关靶点结果图; 0089 (A)western blottingting显示转染si-ATG7#1和si-ATG7#2 48h的U87MG、 U251和 P3#GBM 胶质瘤细胞的ATG7和ACTB水平; 0090 (B)稳定表达sh-COPZ1#1的U。
32、87MG、 U251和P3#GBM细胞的ATG7敲除后检测到的亚 铁水平; 0091 (C)(D)依次为siRNAs敲除ATG7对稳定表达sh-COPZ1的U87MG和P3-GBM胶质瘤 细 胞活力水平; 0092 (E)(F)依次为siRNAs敲除ATG7对稳定表达sh-COPZ1的U87MG和P3-GBM胶质瘤 细 胞中MDA水平, 两组比较的t检验: *p0.01; 多组比较的单因素方差分析: NS无显著 性, *p 0.05, *p0.01, *p0.001。 0093 图13为实施例8中下调COPZ1降低体内肿瘤生长结果图; 0094 (A)植入后第7、 14和21天用IVIS-20。
33、0成像系统监测表达荧光素酶的U87MG-sh- COPZ1#1 细胞或U87MG-NC细胞的颅内肿瘤生长成像; 0095 (B)第7、 14和21天植入U87MG-sh-COPZ1#1细胞或U87MG-NC细胞的小鼠原位肿瘤 生物发光信号的量化; 0096 (C)用Kaplan-Meier生存曲线测定总生存率, 用log-rank检验评定差异的统计学 意义; 0097 (D)裸鼠脑内植入U87MG-sh-COPZ1#1细胞或U87MG-NC细胞后苏木精和伊红染色切 片的代表性图像(比例尺, 100 m); 0098 (E)注射U87MG-sh-COPZ1细胞或U87MG-NC细胞的小鼠脑切片中。
34、NCOA4和Ki67的免 疫组化染色代表性图像, (比例尺第一和第三栏, 100 m, 比例尺第二和第四栏, 25 m) 0099 (F)注射U87MG-sh-COPZ1细胞或U87MG-NC细胞的小鼠原位异种移植标本中亚铁水 平 的比较; 0100 (G)注射U87MG-sh-COPZ1#1细胞或U87MG-NC细胞的小鼠原位异种移植标本中丙二 醛水平的比较; 0101 (H)GBM细胞内对铁代谢的影响流程图: 0102 COPZ1的敲除通过激活选择性受体NCOA4导致铁蛋白的自噬降解, 导致细胞内铁、 特别 是亚铁(Fe2+)的过量, 不稳定的亚铁会触发Fenton反应, 积累细胞毒脂质过。
35、氧化, 这是 铁 下垂的主要特征; t检验: *p0.05, *p0.01, *p0.001; 对数秩检验: p0.05。 具体实施方式 0103 应该指出, 以下详细说明都是例示性的, 旨在对本发明提供进一步的说明。 除非另 有指 明, 本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通 常理解的 相同含义。 说明书 6/14 页 8 CN 111363820 A 8 0104 需要注意的是, 这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式, 而非意图限制根 据本发 明的示例性实施方式。 如在这里所使用的, 除非上下文另外明确指出, 否则单数形 式也意图 包括复数形式, 此外, 。
36、还应当理解的是, 当在本说明书中使用术语 “包含” 和/或 “包括” 时, 其指明存在特征、 步骤、 操作、 器件、 组件和/或它们的组合。 0105 正如背景技术所介绍的, 针对现有技术中存在的不足, 为了解决如上的技术问题, 本发 明提出了COPZ1作为脑胶质瘤治疗/预后判断靶点的应用。 0106 本发明第一方面, 提供COPZ1作为脑胶质瘤治疗/预后判断靶点的应用。 0107 优选的, 所述治疗靶点的应用包括将COPZ1抑制剂作为抗脑胶质瘤活性成分, 或将 COPZ1抑制剂应用于抗脑胶质瘤药物制备的应用。 0108 优选的, 所述预后判断靶点的应用包括将COPZ1含量检测试剂应用于脑胶质。
37、瘤预 后判 断试剂的应用, 或预后判断试剂盒制备的应用。 0109 本发明第二方面, 提供COPZ1作为靶细胞铁调节剂的应用。 0110 所述铁包括靶细胞内铁离子(具体包括亚铁离子及三价铁离子)、 与铁结合的转铁 蛋白 (TF)、 将转铁蛋白铁复合物转移到细胞内的转铁蛋白受体(TFR)、 调节亚铁的铁蛋白 (FTH1)。 0111 优选的, 所述应用包括COPZ1抑制剂作为铁离子(具体包括亚铁离子及三价铁离 子)、 与铁结合的转铁蛋白(TF)、 将转铁蛋白铁复合物转移到细胞内的转铁蛋白受体(TFR) 激 动剂的应用。 0112 进一步优选的, 所述COPZ1抑制剂作为亚铁离子激动剂的应用。 0。
38、113 优选的, 所述应用COPZ1抑制剂作为调节亚铁的铁蛋白(FTH1)激动剂的应用。 0114 本发明第四方面, 提供COPZ1抑制剂作为脂质过氧化诱导剂或丙二醛激动剂的应 用。 0115 本发明第五方面, 提供COPZ1抑制剂作为活性氧激动剂的应用。 0116 优选的, 所述应用包括将COPZ1抑制剂作为过氧化氢及超氧化物激动剂的应用, 所 述 超氧化物包括超氧自由基(O2-)和高细胞毒性羟基自由基(OH)。 0117 本发明第六方面, 提供COPZ1抑制剂作为自噬诱导剂的应用。 0118 优选的, 所述应用包括COPZ1抑制剂作为LC3B-II激动剂、 或自噬底物SQSTM1(P62)。
39、 抑制剂, 或自噬相关蛋白7(ATG7)激动剂的应用。 0119 本发明第七方面, 提供COPZ1抑制剂作为NCOA4激动剂的应用。 0120 为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案, 以下将结合具 体的实 施例与对比例详细说明本发明的技术方案。 以下实施例中所用材料与方法说明如 下: 0121 伦理声明 0122 所有用人体样本进行的实验均经山东大学(山东)研究伦理委员会批准。 人胶质瘤 肿瘤 标本(WHO级, n60)取自齐鲁医院神经外科手术。 正常脑组织样本(n6)取自 同 一家医院接受重型颅脑损伤减压治疗的脑外伤患者。 所有患者均获得书面知情同意。 所 有的 动物程序。
40、都得到了山东大学动物保护和使用委员会(IACUC)的批准。 0123 细胞系和培养物 0124 人脑胶质瘤细胞系U87MG、 U251、 A172、 LN229和T98均购自中国科学院细胞库(上 说明书 7/14 页 9 CN 111363820 A 9 海)。 挪威卑尔根大学生物医学系Rolf Bjerkvig教授提供了正常人星形胶质细胞(NHA) 和 原代人GBM活检增殖的肿瘤细胞P3#GBM。 将U87MG、 U251、 A172、 LN229和T98 细胞培养在杜尔 贝科改良培养基(DMEM; Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA) 中,。
41、 添加10胎牛 血清(FBS; Thermo Fisher Scientific)并培养在5的二氧化碳, 37的 加湿培养箱中。 将P3-GBM细胞培养在Neurobase TM培养基(Gibco, Thermo Fisher Scientific), 添加2 B27神经混合物(Thermo Fisher Scientific)、 20ng/mL表皮生长因子 (EGF; Thermo Fisher Scientific)和10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF; PeproTech; Rocky Hill, NJ)置于5二氧化碳, 37的加湿培养箱中。 Accutase(Thermo 。
42、Fisher Scientific) 用于 消化肿瘤用于扩张GSC的球体。 0125 SiRNA转染 0126 基因制药公司(中国上海)合成了SiRNA转染基因(特异性SiRNA和阴性对照 SiRNA), 并按照制造商的方案, 用脂质体2000(Thermo Fisher Scientific)转染U87MG、 U251和 P3#GBM细胞48h。 细胞以3105细胞/孔的密度接种于6孔板中。 当细胞融合率为70- 80 时, siRNA双链被转染到细胞中。 0127 以下siRNA序列用于靶向所示的a: 0128 COPZ1#1and COPZ1#2: 5 -CCAUCGGACUGACAGU。
43、GAAATT-3 and 5 - CCGGCCTGTATACTGTCAAAGCCAT-3 ; 0129 NCOA4#1和NCOA4#2,: 5 -ACTCTTGTTTATCGAAGTATA-3 and 0130 5 -CTCTTATTCCAGTCCTATAAT-3 ; 0131 ATG7#1和ATG7#2: 5 -GGAGTCACAGCTCTTCCTT-3 和 0132 5 -CAGCTATTGGAACACTGTA-3 。 0133 Western blottingting用于评估siRNA敲除效率。 ShRNA转染短发夹: 将sh-COPZ1# 1 和sh-COPZ1#2(5 -ccaucc。
44、ggacugagugaaatt-3 和5 -ccggcctgtatactcaagcat-3 )连接 到pLKO.1 慢病毒载体上, 该载体具有嘌呤霉素抗性区(genefarma; 中国上海)。 分别感染荧 光素酶 稳定的U87MG、 U251和P3#GBM细胞。 48h后, 将U87MG、 U251和P3#GBM细胞暴露 于嘌呤 霉素(2g/mL; Thermo Fisher Scientific)中2周, 以富集含有该结构的细胞。 用Western 印迹法验证敲除效率, 并对细胞进行不同的分析。 Western印迹法检测shRNA基因敲除效 率。 0134 免疫组织化学 0135 所有标本均。
45、固定在4多聚甲醛磷酸盐缓冲液(PBS)中, 石蜡包埋, 切成4 m切片。 切片脱蜡再水化, 然后用0.01M柠檬酸缓冲液在95下孵育20分钟以获得抗原。 用3过 氧 化氢(ZSGB-Bio; 中国北京)阻断内源性过氧化物酶活性, 用10正常山羊血清 (ZSGB-Bio) 阻断非特异性抗原, 然后用原抗体在4孵育12h, 用兔抗COPZ1(20440-1-AP, 1:100; Proteintech, 中国武汉)和兔抗Ki67(ab15580,1:500; Abcam, 剑桥, 英国)。 切片 用PBS 3x5min洗涤, 用山羊抗兔二级抗体(ZSGB-Bio)处理, 然后用3,3 -二氨基联苯。
46、胺 (DAB, ZSGB-Bio)显色, 玻片用苏木精(Beyotime; Shanghai, China)在25复染2min, 阴性对照, 切片用正常羊血清代替原抗体孵育。 癌细胞染色分为: 0, 无染色; 1, 50细 胞弱染色; 2, 50细胞弱染色; 3, 50细胞强染色; 4, 50细胞强染色。 染色由两 位经验丰富的 神经病学家独立评估。 说明书 8/14 页 10 CN 111363820 A 10 0136 细胞活性和增殖分析 0137 根据制造商的方案, 使用细胞计数试剂盒-8分析(CCK-8)(Dojindo; Kumamoto, Japan) 评估细胞活力。 在96孔板中。
47、以2-103个细胞/孔的速度接种细胞, 并在含5二氧化 碳的加湿 培养箱中于37下培养24、 48和72小时。 将CCK-8溶液(10 L)加入各孔中, 培养皿 在 37下孵育1h。 每孔的光吸收率在450纳米(OD450)处用微型读板器读取(Bio-Rad; Hercules, CA, USA)。 根据制造商的方案(Rib bio; 中国广州), 使用EdU试验评估增 殖。 简言 之, eDU与增殖细胞结合并通过与荧光标记叠氮化物的催化反应检测。 在荧光显 微镜下观 察标记细胞, 在三个独立的实验中从500个细胞中计数EdU阳性细胞的数量。 0138 Western blottingting。
48、分析 0139 收集细胞和组织, 用RIPA裂解缓冲液(Thermo Fisher Scientific)和蛋白酶抑制 剂PMSF (Solarbio, 北京, 中国)以100:1(v/v)的比例进行裂解。 用BCA蛋白检测试剂盒 (Beyotime) 测定蛋白浓度。 等量的蛋白质提取物通过10的SDSPAGE分离并转移到PVDF膜 (Merck Millipore; Billerica, MA, USA)。 用脱脂乳将膜封闭1h, 然后在4下与一级抗体孵 育过 夜。 使用以下一级抗体: 兔抗 -肌动蛋白(ab8226, 1:2000, Abcam)、 兔抗COPZ1(20440- 1-AP,。
49、 1:1000, Proteintech)、 兔抗NCOA4(ab86707, 1:2000, Abcam)、 兔抗铁蛋白重链 (ab75972, 1:1000, Abcam), 兔抗LC3B(ab192890,1:2000), 兔抗SQSTM1/p62(ab109012,1: 10000, Abcam), 兔抗Atg7(8558,1:1000, 细胞信号技术)。 用辣根过氧化物酶结合二级抗体 (ZSGB-BIO; 北京, 中国)溶解于抗体稀释缓冲液(Beyotime)中室温孵育1h进行检测。 采用 增强化学发光法(ECL; Merck Millipore)制备膜, 并根据制造商方案, 使用化。
50、学发光 法 (Bio-Rad)进行可视化。 0140 乳酸脱氢酶释放细胞死亡测定 0141 根据制造商说明书, 使用乳酸脱氢酶细胞毒性试验试剂盒(Beyotine)检测细胞死 亡率。 处理完成后, 将细胞培养板在400g下离心5min, 尽可能除去上清液, 加入150微升试 剂盒 中提供的乳酸脱氢酶释放试剂, 用PBS稀释10倍, 摇匀后继续在细胞培养箱中培养1小 时。 在490nm(OD490)处的吸光度在microplate reader(Bio-Rad)中测量, 所有实验均进行 三 次。 计算结果如下: 细胞死亡率(加工样品吸光度-样品对照井吸光度)/(细胞最大 酶活 性吸光度-样品对照。
- 内容关键字: COPZ1 作为 胶质 治疗 预后 判断 应用
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