NQO1激活型Combretastatin A4前药及其合成方法和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010205793.6 (22)申请日 2020.03.23 (71)申请人 新乡医学院 地址 453003 河南省新乡市红旗区金穗大 道601号新乡医学院 (72)发明人 张崇武利强屈艳马鑫 (74)专利代理机构 新乡市平原智汇知识产权代 理事务所(普通合伙) 41139 代理人 路宽 (51)Int.Cl. C07C 271/52(2006.01) C07C 269/04(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 31/27(2006.01) 。

2、(54)发明名称 一种NQO1激活型Combretastatin A4前药及 其合成方法和应用 (57)摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 N Q O 1 激 活 型 CombretastatinA4前药及其合成方法和应用， 其中NQO1激活型CombretastatinA4前药的结构 式为：， 本发明还 具体公开了该NQO1激活型CombretastatinA4前 药的合成方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。 该前药对NQO1显示了高度的亲和性， 可以在NQO1 高度表达的肿瘤细胞中快速、 高效的定向释放出 活性药物CombretastatinA4， 进而降低该药物 对正常细胞的毒副作用并提。

3、高对肿瘤治疗的靶 向效率， 为抗肿瘤药物的开发提供了更多新的思 路。 本发明提供的NQO1激活型前药的合成方法简 单， 原料廉价易得， 易于工业化生产和临床转化。 权利要求书1页 说明书5页 附图8页 CN 111362837 A 2020.07.03 CN 111362837 A 1.一种NQO1激活型Combretastatin A4前药 ， 其特征在于该NQO1激活型 Combretastatin A4前药的结构式如式I所示： 2.一种权利要求1所述的NQO1激活型Combretastatin A4前药的合成方法， 其特征在于 具体过程为： 步骤S1： 将3-甲基-3-(2,4,5-三甲。

4、基-3,6-二氧环己-1,4-二烯-1-基)丁酸和氯甲酸异 丁酯溶解于四氢呋喃中， 再于0加入N-甲基吗啉反应30分钟， 然后加入甲基(2-(甲基氨 基)乙基)氨基甲酸叔丁酯盐酸盐进行过夜反应， 反应结束后将反应液过滤、 浓缩、 纯化得到 化合物II； 步骤S2： 将步骤S1得到的化合物II与三氟乙酸溶解于二氯甲烷中， 于室温反应2小时， 反应结束后将反应液浓缩重新溶解于二氯甲烷中， 加入5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-2- 甲氧基苯基-4-硝基苯基碳酸酯、 二异丙基乙基胺和催化量的4-二甲氨基吡啶， 再于室温反 应24小时， 反应结束后将反应液依次进行水洗、 干燥、 纯化得到目标产物化。

5、合物I； 合成过程中对应的反应方程式为： 3.权利要求1所述的NQO1激活型Combretastatin A4前药在制备抗肿瘤药物中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111362837 A 2 一种NQO1激活型Combretastatin A4前药及其合成方法和 应用 技术领域 0001 本发明属于药物化学技术领域， 具体涉及一种NQO1激活型Combretastatin A4前 药及其合成方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。 背景技术 0002 恶性肿瘤是危害人类健康最严重的疾病之一， 现在较为成熟的治疗方法主要有手 术治疗、 放射治疗和药物治疗三类。 近几年来， 肿瘤化疗取得了很大。

6、的进步， 但对危害人类 生命健康最严重的、 占恶性肿瘤90以上的实体瘤的治疗效果还不尽人意， 并且绝大多数 抗肿瘤药物在抑制或杀灭肿瘤细胞的同时， 对正常组织和器官不可避免地产生损害或毒性 作用， 给患者带来极大的痛苦， 有的甚至导致死亡， 因此开发与研究新型有效的抗肿瘤药物 是生物医药科研领域的重大课题和长期任务。 0003 依赖还原型辅酶I(II)醌氧化还原酶1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase l， NQO1)是真核细胞内普遍存在的一类黄素蛋白酶， 它可以通过去电子还原反应参与体内多 种醌类的代谢和醌类药物的生物激活过程。 NQO1在多种实体肿瘤细胞中的表达远。

7、高于正常 细胞。 由于NQO1在肿瘤细胞的高表达及其生物活化的特性,它被认为是治疗多种肿瘤的潜 在分子靶标。 0004 近年来， 以苯醌、 吲哚醌为载体的NQO1激活型前药以其良好的选择性和高效的抗 癌活性引起人们的广泛关注， 在肿瘤治疗领域显示出广阔的应用前景。 NQO1激活型前药由 触发基团、 中间连接链和药效基团构成。 触发基团决定着药物与酶的亲和性， 其结构中的醌 可被NQO1催化还原成酚的结构， 继而引发一系列分解反应， 释放出活性药物； 中间连接链由 可自我分解的结构片段构成， 其决定药物的稳定性和释放度； 药效基团为活性药物， 决定着 药物的抗癌活性。 0005 Combreta。

8、statin A4(CA4)系从非洲灌木Combretum Caffrum的树皮中分离得到的 一种多羟基二苯乙烯类天然产物， 它是强效小分子抗有丝分裂剂和肿瘤血管破坏剂。 其磷 酸酯的二钠盐Combretastatin A-4phosphate(CA4P)作为CA4的前体药物， 极大地改善了 CA4的水溶性和药代动力学性质， 已于2013年7月被欧洲药品管理局授予孤儿药地位， 用于 治疗卵巢癌。 本发明设计合成的NQO1激活型CA4前药对于解决CA4毒副作用， 为其成为高效 化疗药物提供了可能。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供了一种NQO1激活型Combretastatin A4前药。

9、， 本发明的另 一目的在于提供了所述NQO1激活型Combretastatin A4前药的合成方法及其在制备抗肿瘤 药物中的应用。 0007 为了实现上述目的本发明采用如下技术方案， 一种NQO1激活型Combretastatin A4前药， 其特征在于该NQO1激活型Combretastatin A4前药的结构式如式I所示： 说明书 1/5 页 3 CN 111362837 A 3 0008 0009 本发明还提供了上述NQO1激活型Combretastatin A4前药的合成方法， 其特征在 于具体过程为： 0010 步骤S1： 将3-甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧环己-1,。

10、4-二烯-1-基)丁酸和氯甲 酸异丁酯溶解于四氢呋喃中， 再于0加入N-甲基吗啉反应30分钟， 然后加入甲基(2-(甲基 氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯盐酸盐进行过夜反应， 反应结束后将反应液过滤、 浓缩、 纯化得 到化合物II； 0011 步骤S2： 将步骤S1得到的化合物II与三氟乙酸溶解于二氯甲烷中， 于室温反应2小 时， 反应结束后将反应液浓缩重新溶解于二氯甲烷中， 加入5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)- 2-甲氧基苯基-4-硝基苯基碳酸酯、 二异丙基乙基胺和催化量的4-二甲氨基吡啶， 再于室温 反应24小时， 反应结束后将反应液依次进行水洗、 干燥、 纯化得到目标产物化合物I； 00。

11、12 合成过程中对应的反应方程式为： 0013 0014 本发明所述的NQO1激活型Combretastatin A4前药在制备抗肿瘤药物中的应用。 0015 本发明提供的NQO1激活型Combretastatin A4前药对NQO1显示了高度的亲和性， 可以在NQO1高度表达的肿瘤细胞中快速、 高效的定向释放出活性药物(图1)。 该NQO1激活型 Combretastatin A4前药对测试的两种肿瘤细胞(HepG2和A549)具有非常强的抑制作用， 其 IC50分别为10.4nM和26.2nM。 此外， 对乏氧细胞、 紫杉醇耐药肿瘤细胞、 埃坡霉素耐药肿瘤细 胞也同样有效， 有效的克服了微。

12、管蛋白抑制剂乏氧引起的耐受性， 具有抗紫杉醇和埃坡霉 素耐药活性。 更重要的是， 化合物对正常细胞HEK293和LO2具有较弱的毒性， 显示了高的安 全性(表1)。 此外， 在体内动物试验中， 该NQO1激活型Combretastatin A4前药能够提升原药 的体内抗肿瘤能力， 通过小鼠体重变化和肝脏组织学切片分析也表明该前药有太大的毒性 (图2)。 可作为基于NQO1激活的靶向秋水仙碱结合位点的微管蛋白抑制剂前药进一步开发。 附图说明 0016 图1为前药(简称XM4)的亲和性， 释放度， 酶活性研究结果， 其中(A)前药XM4释放原 药的过程； (B)XM4对接到NQO1活性位点； (C。

13、)NQO1催化下的XM4释放曲线； (D)NQO1催化下， 不 说明书 2/5 页 4 CN 111362837 A 4 同时间点XM4的高效液相色图； (E)XM4的米氏曲线； 0017 图2为前药(简称XM4)的体内抗癌活性研究结果， 其中(A)剥离肿瘤结构图； (B)肿 瘤重量； (C)肿瘤体积变化； (D)小鼠体重变化； (E)肝脏切片。 具体实施方式 0018 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0019 实施例1 0020 化合物的合成 0021 将3-甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧环己-1,4-二烯-1-基)丁酸和氯甲酸异丁 酯(1.5g,5.9。

14、9mmol)溶解于30mL四氢呋喃中， 再于0加入N-甲基吗啉(0.67g,6.59mmol)反 应30分钟， 然后加入甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯盐酸盐(1.45g,7.19mmol)进 行过夜反应， 反应结束后将反应液过滤、 浓缩， 再用柱层析分离得到黄色油状物II 1.44g， 收率75。 1H NMR(400Hz,CDCl3) :3.42-3.25(m,4H),3.02-2.83(m,8H),2.13(s,3H),1.94- 1.91(m,6H) ,1.49-1.42(m,15H)； HRMS-ESI(m/z):calcd for C23H36N2NaO5M+Na+ 44。

15、3.2516,found:443.2514。 0022 将到化合物II(421mg,1mmol)与5mL三氟乙酸溶解于20mL二氯甲烷中， 于室温反应 2小时， 反应结束后将反应液浓缩重新溶解于20mL二氯甲烷中， 加入5-(3,4,5-三甲氧基苯 乙烯基)-2-甲氧基苯基-4-硝基苯基碳酸酯(243mg,0.5mmol)、 二异丙基乙基胺(243mg, 0.5mmol)和催化量的4-二甲氨基吡啶(10mg,0.08mmol)， 再于室温反应24小时， 反应结束后 将反应液依次进行水洗、 干燥、 再用柱层析分离得到黄色油状物I185mg， 收率56。 1H NMR (400Hz,CDCl3) 。

16、:7.13-7.04(m,2H),6.84-6.80(m,1H),6.53(s,2H),6.45(s,2H),3.84(s, 3H),3.80(s,3H),3.72(s,6H),3.59-3.38(m,4H),3.06-2.97(m,6H),2.13-2.12(m,2H), 1.92-1.90(m,6H),1.70(m,3H),1.42-1.41(m,6H)； HRMS-ESI(m/z):calcd for C37H46N2NaO9 M+Na+685.3096,found:685.3098。 0023 实施例2 0024 抗增值活性试验 0025 取对数生长期的HepG2、 A549、 LO2。

17、和A549/Taxol细胞， 加0.25wt胰酶制成细胞悬 液,细胞浓度3104/mL， 接种于96孔板， 每孔100 L， 空白孔加100 L DMEM高糖培养基， 置于 37、 体积分数5CO2培养箱培养24小时， 实验组更换新的含不同浓度被测样品的培养基， 每个浓度3个复孔， 对照组则换含等体积溶剂的培养基,继续培养48小时， 加入MTT继续培养 4小时， DMSO溶解后， 全波长多功能读数仪570nm波长下检测各孔吸光度A值。 结果如表1所 示， 该前药对测试的两种肿瘤细胞(HepG2和A549)具有非常强的抑制作用， 其IC50分别为 10.4nM和26.2nM。 此外， 对乏氧细胞。

18、、 紫杉醇耐药肿瘤细胞、 埃坡霉素耐药肿瘤细胞也同样 有效， 有效的克服了微管蛋白抑制剂乏氧引起的耐受性， 具有抗紫杉醇和埃坡霉素耐药活 性。 0026 表1前药I的体外抗增值活性 说明书 3/5 页 5 CN 111362837 A 5 0027 0028 a耐紫杉醇A549细胞；b耐埃坡霉素A549细胞。 0029 实施例3 0030 分子对接研究 0031 采用Autodock vina 1.1.2进行分子对接研究。 我们采用ChemBio6-Draw Ultra 14.0画出化合物的结构， 然后用ChemBio3D Ultra 14.0转化为三维结构， 并使用MMFF94力 场进行优化。

19、。 人NQO1的三维结构(PDB ID:3JSX)从RCSB蛋白数据库(http:/ www.rcsb.org/)下载得到。 NQO1蛋白和化合物均使用AutodockTools 1.5.6转化为PDBQT格 式。 NQO1活性位点坐标设置为： center_x11.108， center_y-3.473， center_z30.598； size_x20， size_y20， size_z20。 为了增加计算的准确度， 我们将参数 exhaustiveness设置为20。 除了特别说明， 其他参数均采用默认值。 最后， 选取打分值最高 的构象用PyMoL 1.7.6进行结果分析。 0032 。

20、实施例4 0033 释放度试验 0034 100 L的反应体系中含有在10mmol磷酸盐缓冲液(pH 7.4)和10 g/mL NQO1和20 M 衍生物样品， 反应相应时间后， 加入100 L乙腈混合均匀， 离心机离心， 精密量取20 L上清液 注入液相色谱仪测定相应的色谱图。 0035 实施例5 0036 酶活性试验 0037 100 L的反应体系中含有在10mmol磷酸盐缓冲液(pH 7.4)， 100 M NADPH和10 g/ mL NQO1和40 M， 20 M， 10 M， 5 M， 2.5 M， 1.25 M， 0.625 M衍生物样品， 在37下于恒温振荡 器中反应30分钟，。

21、 加入100 L乙腈混合均匀， 离心机离心， 精密量取20 L上清液注入液相色 谱仪测定， Michaelise-Menten curves用Graphpad Prism 7获得。 0038 实施例3-5结果如图1所示， 前药对NQO1显示了高度的亲和性， 可以在NQO1高度表 达的肿瘤细胞中快速、 高效的定向释放出活性药物。 0039 实施例6 0040 体内活性研究 0041 常规培养人肝癌HepG2细胞至对数生长期时， 用0.25wt的胰酶消化并离心， 收集 细胞， 用PBS制成细胞悬液， 调整细胞浓度为2.5107/mL。 用带6号针头的注射器抽取0.2mL 人肝癌HepG2细胞悬液接。

22、种裸鼠右腋下部皮下(0.2mL/只， 4106细胞)。 用游标卡尺测量肿 瘤的最长径(a)和最短径(b)， 按公式计算裸鼠移植瘤体积： Vab2/2， 待移植瘤生长至约 70-100mm3时， 将裸鼠随机分为6组， 腹腔注射给药， 每隔1天测定肿瘤体积和小鼠的重量， 实 验结束后采用断颈法统一处死裸鼠， 剥离肿瘤， 称重， 拍照。 0042 结果如图2所示， 该前药能够提升原药的体内抗肿瘤能力， 通过小鼠体重变化和肝 脏组织学切片分析也表明该前药没有太大的毒性。 0043 以上实施例描述了本发明的基本原理、 主要特征及优点， 本行业的技术人员应该 说明书 4/5 页 6 CN 11136283。

23、7 A 6 了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原 理， 在不脱离本发明原理的范围下， 本发明还会有各种变化和改进， 这些变化和改进均落入 本发明保护的范围内。 说明书 5/5 页 7 CN 111362837 A 7 图1A 说明书附图 1/8 页 8 CN 111362837 A 8 图1B 说明书附图 2/8 页 9 CN 111362837 A 9 图1C 图1D 说明书附图 3/8 页 10 CN 111362837 A 10 图1E 说明书附图 4/8 页 11 CN 111362837 A 11 图2A 说明书附图 5/8 页 12 CN 111362837 A 12 图2B 图2C 说明书附图 6/8 页 13 CN 111362837 A 13 图2D 说明书附图 7/8 页 14 CN 111362837 A 14 图2E 说明书附图 8/8 页 15 CN 111362837 A 15 。