对猪瘟野毒及其疫苗进行鉴别诊断的基因芯片以及检测方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010332260.4 (22)申请日 2020.04.24 (71)申请人 中国兽医药品监察所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街8 号 (72)发明人 张乾义徐璐夏应菊邹兴启 王琴赵启祖万建青李翠 郎洪武朱元源徐嫄王兆 (74)专利代理机构 北京唐颂永信知识产权代理 有限公司 11755 代理人 刘伟王维 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6837(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明。

2、名称 对猪瘟野毒及其疫苗进行鉴别诊断的基因 芯片以及检测方法 (57)摘要 本发明涉及一种探针组合物， 其是用于对猪 瘟野毒及其疫苗进行鉴别诊断的探针组合物。 本 发明还涉及包含该组合物的基因芯片和试剂盒。 权利要求书2页 说明书13页 序列表3页 附图3页 CN 111394521 A 2020.07.10 CN 111394521 A 1.一种探针组合物， 其是用于对猪瘟野毒及其疫苗(C株或T株)、 进行鉴别的探针组合 物， 其中的靶标探针包括： 针 对 猪 瘟 野 毒 的 探 针 C S F V - W - P ，其 序 列 如 S E Q . I D . N O . 1 ： CCCTG。

3、GGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAG所示， 针对猪瘟疫苗的探针CSFV-V-P， 其序列如SEQ.ID.NO.2： ATGCAGGAGGAGATAACCTTGCAGCC 所示。 2.一种基因芯片， 其是用于对猪瘟野毒及其疫苗进行鉴别的基因芯片， 其中， 该基因芯 片包括： 如权利要求1所述的探针组合物， 以及载体材料， 所述探针组合物固定在载体材料上。 3.根据权利要求2所述的基因芯片， 其中， 所述基因芯片的载体材料为改性硅胶膜。 4.根据权利要求3所述的基因芯片， 其中， 除了固定有如权利要求1所述的2条靶标探针 序列， 所述基因芯片的每个孔还固定有一条芯片反应质控探针和两条PC。

4、R反应质控探针。 5.一种引物组合物， 其是对猪瘟野毒及其疫苗进行鉴别时所使用的扩增引物， 其包括： 针对猪瘟野毒CSFV-W的5 UTR保守区域设计引物， 分别为CSFV-F1： SEQ.ID.NO.5： GGAGGGACTAGCCRTAGTG和CSFV-R1： SEQ.ID.NO.6： ACGTCGAACTACTGACGACTG； 针对猪瘟疫苗CSFV-V的NS5B保守区域设计引物， 分别为CSFV-F2： SEQ.ID.NO .7： CCTTCGGGGAGAAAGTAACGAT和CSFV-R2： SEQ.ID.NO.8： CCTACCACAGTCACGGCT。 6.一种试剂盒， 其包括：。

5、 如权利要求2-4中任一项所述的基因芯片； 以及 如权利要求5所述的引物组， 所述试剂盒用于对猪瘟野毒及其疫苗进行鉴别诊断。 7.根据权利要求6所述的试剂盒， 其还包括： 质控引物、 质控质粒、 阳性对照、 阴性对照、 热反应酶、 无菌无核酸酶水、 辣根过氧化物 酶、 变性液A、 洗脱液B、 洗涤液C以及TMB显色液。 8.一种对猪瘟野毒及其疫苗进行鉴别的方法， 该方法包括： -取得含有受试体RNA的样本， 所述样本优选为血液或组织样本； -对该样本进行RNA提取； -使用引物组合物对提取到的RNA进行扩增； -使用经扩增的RNA与探针组合物进行杂交； -通过显色反应显示杂交结果以判断是否存在。

6、/共同存在猪瘟野毒及其疫苗的阴性/阳 性。 9.根据权利要求8所示的方法， 其中， 所述引物组合物包括： 针对猪瘟野毒CSFV-W的5 UTR保守区域设计引物， 分别为CSFV-F1： SEQ.ID.NO.5： GGAGGGACTAGCCRTAGTG和CSFV-R1： SEQ.ID.NO.6： ACGTCGAACTACTGACGACTG； 针对猪瘟疫苗CSFV-V的NS5B保守区域设计引物， 分别为CSFV-F2： SEQ.ID.NO .7： CCTTCGGGGAGAAAGTAACGAT和CSFV-R2： SEQ.ID.NO.8： CCTACCACAGTCACGGCT。 10.根据权利要求8或。

7、9所示的方法， 其中， 所述探针组合物包括： 权利要求书 1/2 页 2 CN 111394521 A 2 针 对 猪 瘟 野 毒 C S F V - W 的 探 针 C S F V - W - P ， 其 序 列 如 S E Q .I D .N O .1 ： CCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAG所示， 针 对 猪 瘟 疫 苗 C S F V - V 的 探 针 C S F V - V - P ， 其 序 列 如 S E Q .I D .N O .2 ： ATGCAGGAGGAGATAACCTTGCAGCC所示。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111394521 A 3。

8、 对猪瘟野毒及其疫苗进行鉴别诊断的基因芯片以及检测方法 技术领域 0001 本发明涉及兽医诊断技术领域， 特别涉及一种对猪瘟病毒及其疫苗进行鉴别诊断 的基因芯片以及使用该基因芯片的检测方法。 背景技术 0002 猪瘟(Classical Swine Fever， CSF)是由猪瘟病毒引起的高度接触性、 致死性传 染病。 CSF被OIE列为必须报告的动物疫病之一， 在中国被列为 “一类动物疫病” 。 目前在我国 此疾病有流行， 所以对其进行流行病学检测及临床的快速诊断具有十分重要的意义。 目前 对于CSF的防控， 我国仍是以接种中国兽医药品监察所自主研发的C株疫苗为主， 且目前新 型的CSF疫苗。

9、研发也是基于C株疫苗开展研究。 尽管疫苗的接种对于CSF的预防取得了很大 的成果， 世界上很多国家也已经消灭了CSF， 但目前临床上缺少有效的诊断方法可以对CSF 疫苗接种与野毒感染予以鉴别区分。 0003 目前， 对于猪瘟病毒的检测方法例如病毒分离培养、 免疫荧光检测和酶联免疫吸 附试验等虽然有其成功的应用， 但在应对猪瘟病毒的野毒和疫苗的鉴别诊断问题上， 往往 一筹莫展。 分子生物学检测方法虽然能对猪瘟病毒的野毒和疫苗进行区分， 但这些方法比 较费时， 操作步骤较为复杂， 且难以适用于大量的样本检测。 因此， 建立一种临床上区分CSF 野毒感染和疫苗免疫的诊断方法十分必要。 发明内容 00。

10、04 近年来， 基因芯片技术被广泛应用于医学领域， 在基因功能表达、 致病机理、 临床 诊断、 药物开发、 生物学检测等研究方面取得突出成效。 本发明立足于基因芯片技术， 针对 CSF野毒及其疫苗的保守序列选取靶位基因分别设计了两对区分这两种不同病毒的检测引 物及相对应的探针， 建立了一种可靠、 快速的CSF野毒及其疫苗鉴别诊断基因芯片检测方 法， 并组装CSF野毒及其疫苗鉴别诊断基因芯片检测试剂盒， 为CSF野毒及其疫苗的快速鉴 别诊断和规模化猪场的疫病流行病学调查提供技术支撑。 0005 本申请因而提供了： 0006 1.一种探针组合物， 其是用于对CSF野毒及其疫苗进行鉴别的探针组合物，。

11、 其中的 靶标探针包括： 0007 针 对 C S F 野 毒 的 探 针 C S F V - W - P ， 其 序 列 如 S E Q . I D . N O . 1 ： CCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAG所示， 0008 针 对 C S F 疫 苗 的 探 针 C S F V - V - P ， 其 序 列 如 S E Q . I D . N O . 2 ： ATGCAGGAGGAGATAACCTTGCAGCC所示。 0009 2.一种基因芯片， 其是用于对CSF野毒及其疫苗进行鉴别的基因芯片， 其中， 该基 因芯片包括： 0010 权利要求1所述的探针组合物， 以。

12、及载体材料， 所述探针组合物固定在载体材料 上。 说明书 1/13 页 4 CN 111394521 A 4 0011 3.根据项2所述的基因芯片， 其中， 所述基因芯片的载体材料为改性硅胶膜。 0012 4.根据项3所述的基因芯片， 其中， 除了固定有如项1所述的4条靶标探针序列， 所 述基因芯片的每个孔还固定有一条芯片反应质控探针和两条PCR质控探针。 0013 5.一种引物组合物， 其是对CSF野毒及其疫苗进行鉴别时所使用的扩增引物， 其包 括： 0014 针对CSF野毒CSFV-W的5 UTR保守区域设计引物， 分别为CSFV-F1： SEQ.ID.NO.5： GGAGGGACTAGC。

13、CRTAGTG和CSFV-R1： SEQ.ID.NO.6： ACGTCGAACTACTGACGACTG； 0015 针对CSF疫苗CSFV-V的NS5B5 UTR保守区域设计引物， 分别为CSFV-F2： SEQ.ID.NO.7： CCTTCGGGGAGAAAGTAACGAT和CSFV-R2： SEQ.ID.NO.8： CCTACCACAGTCACGGCT。 0016 6.一种试剂盒， 其包括： 0017 项2-4中任一项所述的基因芯片； 以及项5所述的引物组， 0018 所示试剂盒用于对CSF野毒及其疫苗进行鉴别诊断。 0019 7.根据项6所述的试剂盒， 其还包括： 0020 质控引物、 。

14、质控质粒、 阳性对照、 阴性对照、 热反应酶、 无菌无核酸酶水、 辣根过氧 化物酶、 变性液A、 洗脱液B、 洗涤液C以及TMB显色液。 0021 8.一种对CSF野毒及其疫苗进行鉴别的方法， 该方法包括： 0022 -取得含有受试体RNA的样本， 优选血液样本； 0023 -对该样本进行RNA提取； 0024 -使用引物组合物对提取到的RNA进行扩增； 0025 -使用经扩增的RNA与探针组合物进行杂交； 0026 -通过显色反应显示杂交结果以判断是否存在/共同存在CSF野毒、 CSF疫苗的阴 性/阳性。 0027 9.根据项8所示的方法， 其中， 所述引物组合物包括： 0028 针对CSF。

15、野毒CSFV-W的5 UTR保守区域设计引物， 分别为CSFV-F1： SEQ.ID.NO.5： GGAGGGACTAGCCRTAGTG和CSFV-R1： SEQ.ID.NO.6： ACGTCGAACTACTGACGACTG； 0029 针对CSF疫苗CSFV-V的NS5B保守区域设计引物， 分别为CSFV-F2： SEQ.ID.NO.7： CCTTCGGGGAGAAAGTAACGA和CSFV-R2： SEQ.ID.NO.8： CCTACCACAGTCACGGCT。 0030 10.根据项8或9所示的方法， 其中， 0031 所述探针组合物包括： 0032 针 对 C S F 野 毒 C S 。

16、F V - W - P 的 探 针 ， 其 序 列 如 S E Q . I D . N O . 1 ： CCCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAG所示， 0033 针 对 C S F 疫 苗 C S F V - V - P 的 探 针 ， 其 序 列 如 S E Q . I D . N O . 2 ： ATGCAGGAGGAGATAACCTTGCAGCC所示。 附图说明 0034 图1为基因芯片检测技术路线图 0035 图2为PCR产物示意图， 图中， M表示Marker； 1： 表示SX4； 2:表示BJYQ1； 3:表示 Thiverval株； 4： 表示C-株； N表示阴性。

17、对照。 0036 图3为PCR产物示意图， 图中， M表示Marker； 1： 表示CSFV； 2:表示PCV-1； 3:表示PCV- 说明书 2/13 页 5 CN 111394521 A 5 2； 4:表示PPV； 5： 表示PRV； 6： 表示PRRSV； 7： 表示PEDV； 8： 表示TGEV； 9： 表示ASFV； 10： 表示 APPV； 11： 表示FMDV； 12： 表示JEV； 13： 表示BVDV； 14： 表示阴性对照。 0037 图4为芯片特异性实验示意图， 图中CSFV/Shimen、 CSFV/BJYQ1、 CSFV/SX4、 CSFV/ HeBHD2、 CSFV。

18、/HeBHH1、 CSFV/HeBBD1、 CSFV/TJNH1、 CSFV/HeBJZ1、 CSFV/HeBQHD1、 CSFV/ HeNZZ1、 CSFV/HBES2、 CSFV/ZJHZ1、 CSFV/HENZMD1、 CSFV/HeNXC3、 CSFV/JSXZ1、 CSFV/GXFL1、 CSFV/HeBCB2、 CSFV/HENZMD2、 CSFV/HeNXC1、 CSFV/HBHG1、 CSFV/HBHM1、 CSFV/HBJZ1、 CSFV/ LNCY1、 CSFV/SCMY1、 CSFV/HBXY4、 CSFV/HBXY5、 CSFV/ZYBJ1、 CSFV/HeBBD4表示。

19、为检测28株 CSF病毒野毒株芯片检测阳性结果图； CSFV/Thiverval、 CSFV/C株表示为检测2株CSF疫苗株 芯片检测阳性结果图； APPV、 ASFV、 FMDV、 BVDV、 PCV-1、 PCV-2、 PRV、 PPV、 PRRSV、 TGDV、 PEDV、 JEV分别表示为单一检测猪非典型瘟病毒株、 非洲猪瘟病毒株、 猪口蹄疫病毒株、 牛病毒性 腹泻毒株、 猪圆环病毒I型毒株、 猪圆环病毒II型毒株、 猪伪狂犬病毒株、 猪细小病毒株、 猪 繁殖与呼吸综合征病毒株、 猪传染性胃肠炎病毒株、 猪流行性腹泻病毒株、 猪乙型脑炎病毒 株等临床常见12种猪病芯片检测阴性结果图； 。

20、Negative表示为双蒸水作为实验阴性对照。 具体实施方式 0038 下面将结合附图所描述的具体实施方式对本申请的技术方案进行进一步的说明。 0039 0040 基因芯片(DNA/RNA芯片、 DNA/RNA微阵列和寡核苷酸微阵列)是生物芯片中的一 种。 该技术将已知序列信息的核苷酸探针固定于支持物表面， 然后与扩增标记的样品分子 进行特异性结合， 通过观测各探针分子与样品的杂交信号强度来分析样品的分子数量及核 苷酸序列信息。 基因芯片技术可以同时将大量的核酸探针固定于支持物上， 从而一次性检 测和分析样品中的大量核酸序列。 同时， 可视芯片与传统的芯片相比， 最大的优点是它不需 要其他复杂。

21、昂贵的设备， 可以直接通过肉眼观察探针点是否响应来判定样品中是否含有待 检病原核酸。 0041 通常由于芯片所采用的支持物材料的不同， 将其分为玻璃芯片、 硅片芯片、 尼龙膜 芯片等， 其中玻璃芯片较为常见。 根据制备方法的不同， 可分为两大类： 原位合成芯片 (synthetic gene chip)和DNA/RNA微阵列(DNA/RNA microarray)。 而根据其用途， 可以分 为表达谱芯片、 序列检测芯片、 诊断芯片、 指纹图谱芯片、 毒理芯片等。 整个基因芯片检测技 术包括四个流程： 芯片的制备、 待检样品的制备、 样品与芯片的生物反应以及反应后信号的 检测与分析。 目前， 芯。

22、片的制备主要采用表面化学方法来处理固相载体(如玻璃片或硅片)， 然后使核苷酸片段或蛋白质分子按特定顺序排列在载体上)。 目前， 已有将近400000种不同 的DNA/RNA核苷酸分子置于1cm2内的高密度基因芯片， 同时可以包含数百万个DNA/RNA探针 的人类基因芯片也正在制备中。 临床检测样品的制备则是第二个关键步骤， 一般来说， 临床 样品的成分比较复杂， 直接让其进行芯片反应， 很大程度上会影响芯片的检测效果。 故将样 品通过特定的条件处理后， 提取其核酸信息分子， 并在核酸扩增时加以生物素或荧光基团 的标记， 不仅可提高芯片检测灵敏度也可以提高芯片特异性。 第三步就是处理后的样品分 。

23、子与芯片的结合反应， 合适的反应条件是减少分子生物间错配的关键， 同时还可以使分子 生物间的反应处于最佳状态。 这样， 就可以获取最真实直接的反应信号。 反应信号的读取及 结果分析是基因芯片检测中最后也是最为关键的一步。 一般采用将反应后的芯片置于信号 说明书 3/13 页 6 CN 111394521 A 6 扫描仪中获取信号值， 然后再借助相对应的分析软件进行生物信号数据分析。 本实验中所 涉及的芯片检测技术可直接用肉眼来观测反应信号， 为检测人员带来更方便的操作并节约 大量检测成本。 0042 0043 基于基因芯片的试剂盒的基本工作原理是： 在取得生物样品后， 首先提取核酸； 其 次，。

24、 通过PCR反应对核酸样品进行扩增(在此步骤中用到经过标记的引物， 具体地， 引物标记 可以为生物素， 生物素在下文述及的最后一步可以用作显色反应， 以指示靶标核酸序列的 存在)； 再次， 在基因芯片上进行核酸的生物亲和反应， 最后， 利用生物素的显色反应(配合 辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(Streptavidin-Horseradish Peroxidase， SA-HRP)对反 应结果进行读取。 0044 在此， 在第二步中用到的靶标核酸序列引物和PCR反应质控引物、 在第三步中使用 到的安装有针对靶标核酸序列的探针的基因芯片以及促进生物亲和反应发生的杂交液、 以 及在最后一步中使用的洗。

25、脱液、 SA-HRP溶液、 显色液都应当在试剂盒产品中一起提供。 0045 在基因芯片上以及试剂盒配件中至少设有： 0046 1.芯片反应质控探针(在基因芯片上， 又称Biotin探针) 0047 在基因芯片上设有Biotin探针， 其由Biotin(生物素)序列构成， 也称芯片反应质 控探针， 在基因芯片上设置它的目的是判定在基因芯片上的显色反应(芯片上的杂交反应) 有效。 由于扩增时使用的引物都带有Biotin序列， 经扩增的靶标核酸都是带有生物素标记 物的。 所以， 如果Biotin探针有效显色， 则可以认为， 如果经扩增后存在靶标核酸， 其必将正 常显色。 0048 2.阴性对照 00。

26、49 阴性对照为无菌无核酸酶水， 在试剂盒中设置它是为了证实样品中没有特异性模 板因无任何显色。 0050 3.PCR反应质控探针(在基因芯片上， 又称IC)(配合使用PCR反应质控引物、 PCR反 应质控质粒) 0051 PCR反应质控探针与PCR反应质控引物互补， 经PCR反应后， PCR反应质控质粒在PCR 反应质控引物和探针的共同工作下得到扩增， 并在芯片上发生显色反应。 在基因芯片上设 置IC的目的是判定经由PCR的核酸扩增反应有效。 PCR反应质控引物及探针信息如表1所示， PCR反应质控质粒： 内置参照选择选择人源基因(beta-globin gene)序列(GenBank: A。

27、H001475.2) 0052 表1 PCR反应质控引物及探针信息 0053 0054 4.阳性对照(在试剂盒中， 为与芯片上的靶标探针互补的核酸对照品) 0055 除了上述的PCR反应质控质粒， 在试剂盒中的对照品还包括CSF-W株(CSF野毒)及 CSF-V株(CSF疫苗)的阳性质粒。 它们的作用是被用作阳性对照。 0056 5.靶标探针(在基因芯片上， 与样品中的待检测靶标核酸互补) 说明书 4/13 页 7 CN 111394521 A 7 0057 在基因芯片上共设有两条靶标探针， 它们分别为针对CSF野毒的探针(CSFV-W-P) 及疫苗的探针(CSFV-V-P)。 0058 00。

28、59 猪瘟俗称 “烂肠瘟” 也称 “猪霍乱” ， 是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒引起的一 种急性、 发热、 接触性传染传染病。 具有高度传染性和致死性。 本病在自然条件下只感染猪， 不同年龄、 性别、 品种的猪和野猪都易感， 一年四季均可发生。 该病症1885年首先在美国发 现， 以后传播到世界各大洲。 中国大部分省都有发生。 1903年美国兽医学家德希尼兹和多赛 特鉴定本病的病原是披盖病毒科的瘟病毒属(Pestivirus)中的猪瘟病毒。 主要通过直接接 触， 或由于接触污染的媒介物而发病。 消化道、 鼻腔粘膜和破裂的皮肤均是感染途径。 在此 选择病毒高度保守的5 非编码区作为检测的靶基因。

29、。 0060 CSF疫苗在此包括C株和T株， 其中， C株疫苗是由中国兽医药品监察所于1954年研 发的猪瘟兔化弱毒疫苗， 其全称为China株， 简称C株； 1956年开始在全国大范围推广应用， 是目前世界范围内最常用的猪瘟疫苗。 T株全称为Thiverval株， 为低温诱导的猪瘟弱毒疫 苗法国株。 C株和T株都是CSF的疫苗。 在此， 由于疫苗的NS5B基因与野毒相比存在一个碱基 差异， 因此， 能够设计仅扩增CSF疫苗的引物及其相应探针。 0061 0062 1.技术问题： 本申请旨在提供一种可对CSF野毒以及CSF疫苗进行鉴别诊断的基因 芯片检测试剂盒， 其主要用于疑似临床样本的CSF。

30、野毒以及CSF疫苗的快速鉴别检测。 0063 2.解决方案： 该CSF野毒以及CSF疫苗鉴别诊断基因芯片检测试剂盒的基本构成元 件为： 阳性对照、 阴性对照、 RT-PCR反应液、 引物溶液、 基因芯片杂交液、 基因芯片洗脱液、 基 因芯片淋洗液、 生物素溶液、 TMB显色液、 包装好的基因芯片(核心元件)、 无菌无核酸酶水， 其中： 0064 (1)阳性对照和阴性对照： 将CSFV-W野毒及CSFV-V疫苗的阳性质粒作为2件阳性对 照和IC质控质粒(PCR反应质控质粒)一起使用， 无菌无核酸酶水用作阴性对照； 0065 (2)RT-PCR反应液： 每个反应需要： PrimeScript 1s。

31、tep Enzyme Mix 1 L， 2x1 step Buffer 12.5 L(3)引物溶液： 每个反应需要： 5 L 0066 (4)基因芯片杂交液： 取10mL 20SSC和1mL 10SDS， 加纯水定容至200mL 0067 (5)基因芯片洗脱液： 取3mL 20SSC和1.2mL 10SDS， 加纯水定容至120mL 0068 (6)基因芯片淋洗液： 取10mL 1mol柠檬酸钠加纯水定容至100mL 0069 (7)辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(Streptavidin-Horseradish Peroxidase， SA-HRP)溶液： 使用时SA-HRP和杂交液以1 20。

32、00比例进行稀释， 充分混匀后待用 0070 (8)包装好的基因芯片： 将组装好的基因芯片置于铝箔袋中， 放入一包干燥剂， 抽 真空密封后于28冷藏保存。 在该基因芯片上固定有本申请要求保护的针对猪瘟病毒野 毒及其疫苗的探针组合物， 以及芯片反应质控探针(Biotin)和PCR反应质控探针(IC)。 0071 (9)无菌无核酸酶水： 超纯水高压灭菌后， 加入终浓度为0.1的焦碳酸二乙酯 (DEPC)， 处理过夜， 次日高压灭菌以去除DEPC。 0072 (10)TMB显色液： 直接使用 0073 在得到生物样品和上述试剂盒后， 如下进行使用： 0074 -取得含有受试体RNA的样本， 优选血液。

33、样本； 说明书 5/13 页 8 CN 111394521 A 8 0075 -对该样本进行RNA提取； 0076 -使用引物组合物对提取到的RNA进行扩增； 0077 -使用经扩增的RNA与位于基因芯片上的探针组合物进行杂交； 0078 -通过显色反应显示杂交结果以判断是否存在/共同存在猪瘟野毒及其疫苗的阴 性/阳性。 0079 0080 1.引物和探针的设计 0081 针对GenBank公布的猪瘟野毒株和猪瘟疫苗株序列的差异分析后发现5 UTR在所 有猪瘟病毒序列中保守性最高， 故以该区域作为猪瘟病毒通用型检测靶标； 而CSF疫苗与 CSF野毒相比在疫苗的NS5B基因存在1个碱基差异， 利。

34、用ARMS-PCR原理， 设计仅能扩增CSF疫 苗的引物探针， 即只能扩增猪瘟疫苗， 而不能扩增猪瘟野毒。 引物及探针信息见表2及表3。 0082 表2引物信息 0083 0084 表3探针信息 0085 0086 其中： biotin为生物素标记， 带有标记的引物扩增出目的基因片段后通过芯片反 应与芯片上探针杂交结合， 生物素与SA-HRP相结合后再经TMB液处理化学显色， 即可判定结 果。 0087 2.基因芯片的制备 0088 将2EDC(w/v， 1-3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和1.21NHS(w/v， N-羟基琥珀酰亚胺)置于超纯水中， 充分溶解， 配制活化液， 后。

35、将76mm65mm的改性硅胶膜 (购自苏州艾比拓生物技术有限公司， 该改性硅胶膜如下定义， 其具有： 1、 零背景能力： 即使 在较高的蛋白质浓度下也可以防止蛋白发生非特异性吸附； 2、 共价固定能力： COOH在EDC/ NHS活化的条件下， 可以固定带有氨基的探针， 包括但不限于核酸， 短肽， 蛋白， 细胞， 病毒等 等； 3、 超宽的负载区间： 例如固定的是短肽， 则以某个单抗为例在一系列点样浓度下检测出 的行为； 4、 三维呈现能力， 有利于prey-bait相互作用： 减少空间位阻； 5、 定制化生产的可能 性： 根据客户的具体项目要求， 可以对COOH密度， 三维空间的尺度等进行调。

36、整。 ) 0089 改性硅胶膜为高瓴生物反应基底材料作为高性能生物芯片基底材料， 在基因、 蛋 白质和多肽(小分子)等芯片的构建中， 可替代尼龙膜、 玻片等传统的基底材料。 它具有独特 说明书 6/13 页 9 CN 111394521 A 9 的微纳结构和表面化学性质， 可高密度地共价固定各种探针， 并实现三维空间展示； 可在无 需BSA封闭的情况下， 同时实现降低检测背景噪音和提升灵敏度； 简化清洗步骤， 节省操作 时间。 0090 将改性硅胶膜置于活化槽中， 正面朝上， 均匀倒入15ml/块活化液， 使膜表面完全 侵入， 浸泡30分钟。 活化结束后， 用超纯水冲洗膜3遍， 用氮气吹干， 。

37、保证膜表面干燥无异物。 将活化后膜装载于膜架上， 48孔板和装载膜的膜架装载于点样仪的相应位置。 将探针用液 稀释至终浓度为6 M， 每孔加入4 L， 设置点样仪参数为100drop， 按照事先安排的点样顺序 将探针点于48孔装配的SJ改性硅胶膜上， 温度为2025， 湿度为4070， 点击程序开 始点样。 点样完成后从点样仪中取出点样后的膜， 检查膜上有无缺点或拖尾。 将检查合格的 膜放于粘贴双面胶的膜底座上， 对准位置安装上盖， 组装成基因芯片， 确保每个孔的点在孔 中。 将组装好的基因芯片置于铝箔袋中， 放入一包干燥剂， 抽真空密封后于28冷藏保 存。 0091 芯片点样模式如下表所示：。

38、 0092 表4芯片点样模式 0093 Biotin CSFV-WCSFV-V IC-PIC-P 0094 Biotin为芯片反应质控探针， 其通过芯片反应与SA-HRP相结合后再经TMB液处理 化学显色， 即可判定结果， 该质控点保证着芯片杂交反应过程的有效性； 而IC-P为PCR反应 质控探针， 其保证了： 1)目的基因片段扩增反应的有效性， 同时2)由于探针点阵模式为正方 形， 此两条PCR反应质控探针可以为芯片结果的读取指示方向， 以方便反应结果的正确读 取。 0095 3.阳性对照的制备 0096 CSF野毒及C株疫苗的质粒2件阳性对照与0.5mL的IC质控质粒(PCR反应质控质粒)。

39、 一起、 与等量的冻干保护液混合后， 冻干后， -20保存。 使用时加入1mL的生理盐水复溶。 0097 CSF野毒质粒和CSF疫苗质粒是分别将CSFV/HeBHH1株高度保守区的5 UTR基因片 段和C株NS5B基因片段连接在pGEM-T载体上构建而成。 以上载体为中国兽医药品监察所国 家/OIE猪瘟参考实验室构建和制备。 0098 4.阴性对照背景信息 0099 取0.5ml无菌无核酸酶水-20保存。 0100 5.试剂 0101 PrimeScript 1step Enzyme Mix一步法反转录酶与2x1 step Buffer缓冲液购自 购自宝生物工程(大连)有限公司； 0102 6。

40、.引物及基因芯片 0103 由中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所合成组装。 0104 7.反应体系的建立 0105 按核酸提取试剂盒病毒RNA/DNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0， Cat： 9766)说明书提取样本猪瘟病毒RNA作为反应模板， 一步法 说明书 7/13 页 10 CN 111394521 A 10 PCR扩增靶标上基因片段， 反应体系为PrimeScript 1step Enzyme Mix 1 L， 2x1 step Buffer12.5 L， Primer Pool 5 L， RN。

41、A3 L， ddH2O Up to 25 L。 反应条件为5020min， 94 1min， 9410s， 5620s， 7220s， 35个循环， 4保存。 0106 8.芯片反应： 反应前准备： 配置杂交液A、 洗脱液B、 淋洗液C。 将芯片至于孔板孵育 器上47预热， B液47水浴预热。 取10 LPCR产物与110 L A液混合后加入芯片孔内， 120 L/孔， 47， 200r/min， 反应5min。 47预热好的B液(100ul)淋洗三遍， 辣根过氧化物酶标记 链霉亲和素(Streptavidin-Horseradish Peroxidase， SA-HRP)1:2000A液稀释。

42、， 100 L/孔， 200r/min， 47反应5min。 A液(100 L)室温淋洗2次， C液(100 L)室温淋洗2次， 加入60 L/孔 的TMB直接显色1分钟。 纯水(200ul)洗2次， 压缩空气罐轻轻吹干； 观察实验结果， 拍照并记 录。 0107 仪器： 0108 PCR基因扩增仪； 0109 基因芯片孔板孵育器。 0110 依上述1至6方面的描述共为验证实验生产了10个批次的试剂盒。 该十个批次的批 号分别为19071501、 19071502、 19071503、 19071504、 19071505、 19071506、 19071507、 19071508、 1907。

43、1509、 19071510； 这些试剂盒批次将用于下文的测试例。 而后， 选择测试优良 的批次19071502依照上述7至8方面的描述进行实验例。 0111 0112 针对GenBank公布的CSF野毒和CSF疫苗序列的差异分析后发现， 5 UTR在所有猪瘟 病毒序列中保守性最高， 故以该区域作为猪瘟病毒通用型检测靶标； 而猪瘟疫苗与野毒相 比， 疫苗的NS5B基因存在1个碱基差异， 利用ARMS-PCR原理， 设计仅能扩增猪瘟疫苗的引物 及其相应探针， 即可以实现只扩增疫苗， 而不扩增野毒。 经过反应条件的摸索和进一步优 化， 建立了可对猪瘟野毒及疫苗鉴别诊断基因芯片检测方法， 并组装了猪。

44、瘟野毒及疫苗鉴 别诊断基因芯片检测试剂盒。 通过对42个指控样本进行的特异性、 敏感性、 稳定性和重复性 试验， 证明该试剂盒只检测CSFV， 不扩增猪非典型瘟病毒(APPV)、 非洲猪瘟病毒(ASFV)、 猪 圆环病毒 型(PCV-1)、 猪圆环病毒型(PCV-2)、 猪细小病毒(PPV)、 伪狂犬病毒(PRV)、 日本 乙型脑炎病毒(JEV)、 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、 猪流行 性腹泻病毒(PEDV)、 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、 口蹄疫病毒(FMDV)共12种主要相关病毒 核酸， 显示良好的特异性； 灵敏度实验结果显示该方法将CSFV-。

45、W阳性质粒及CSFV-V阳性质 粒测定浓度后进行10倍梯度稀释， 用猪瘟野毒及其疫苗鉴别诊断基因芯片检测试剂盒检 测， 根据芯片反应结果计算芯片灵敏度。 利用道尔顿拷贝数计算公式 【拷贝数质粒浓度 6.021023/(660质粒长度)】 得出： 单一检测CSF野毒和疫苗检测时灵敏度可达1.98拷 贝/ L和13.7拷贝/ L； 混合联检时灵敏度为29拷贝/ L， 说明该检测方法灵敏度高， 优化的 各反应体系和反应参数完全能保证RNA模板的有效扩增。 6个月的稳定性试验及重复性实验 证实该试剂盒具有良好的重复性和稳定性。 该试剂盒操作简单， 自动化程度高。 可在1h内完 成对区分CSF野毒感染和。

46、疫苗接种后临床样本的鉴别诊断， 检测结果直观， 判定简便， 缩短 了检测周期， 节约生产成本， 从而产生更明显的经济和社会效益， 在CSF流行病学调查、 鉴别 诊断及净化等方面有良好的应用前景。 0113 本申请所设计探针长度均小于30bp， 靶位基因的目标片段长度均小于100bp， 这保 说明书 8/13 页 11 CN 111394521 A 11 证了响应信号的稳定与清晰。 为方便芯片检测结果判定， 本申请选用具有良好亲和性的生 物素来标记引物， 扩增出目的基因后与探针相结合再与HRP标记的链霉亲和素反应， 最后使 用底物显色液进行显色， 即可在探针位置显现出肉眼可见的蓝色响应点， 与传。

47、统基因芯片 结果读取需要专用仪器相比， 节约了大量成本。 传统基因芯片多使用醛基化玻片作为支撑， 其反应所需时间较长， 本芯片选择 “0+X” 纳米改性硅胶膜作为支撑， 与使用醛基化玻片的传 统基因芯片相比， 反应时间显著减少， 节省了大量检测时间。 0114 本申请的技术方案的优点可以归纳为： 1)特异性好： 通过设计特异性的引物及探 针， 对CSFV的保守序列和SNP位点进行甄别， 靶序列由特异引物和探针双重控制的准确性 高。 2)： 反应过程对模板的扩增在闭管的情况下一步完成， 减少了操作过程中污染的机会； 3)： 检测时间短： 与传统的方法相比较， 该方法只需要在1小时内即可完成临床样。

48、本的检测， 大大节省了时间成本； 4)操作简单： 只需要普通PCR仪及恒温摇床即可， 该芯片杂交过程操 作简便， 不需要昂贵的辅助设备； 5)结果判定直观： 不用扫描、 电泳等过程， 反应结束后只需 肉眼即可判定结果。 0115 0116 第一部分为测试例。 它们是为了对依上述开发出的试剂盒的特异性、 灵敏度、 批间 重复性等性能进行测试。 0117 验证实验样本信息： (CSFV-W、 CSFV-V株分别为CSFV野毒株和疫苗株的阳性对照) 0118 42份验证实验样本的背景信息见表5， 验证实验的目的是对试剂盒特异性、 重复 性、 灵敏度、 敏感性、 稳定性进行试验。 将所有验证实验样本灭。

49、活后进行定量分装， 200 L/ 管。 0119 表5验证实验样本信息 说明书 9/13 页 12 CN 111394521 A 12 0120 0121 测试例1.特异性试验 0122 采用同一批次的CSF野毒及疫苗鉴别诊断基因芯片检测试剂盒对42个验证实验样 本进行检测， 结果显示： 该试剂盒检测CSF野毒及疫苗均为阳性， 且能鉴别区分CSF野毒感染 以及疫苗， 其他病原均为阴性。 证实该方法与其他相关病毒无交叉反应， 具有良好的特异 性， 且能在检测诊断CSF病毒的同时区分野毒感染及疫苗接种。 具体结果请参见图4。 图4为 芯片特异性实验示意图， 图中CSFV/Shimen、 CSFV/。

50、BJYQ1、 CSFV/SX4、 CSFV/HeBHD2、 CSFV/ HeBHH1、 CSFV/HeBBD1、 CSFV/TJNH1、 CSFV/HeBJZ1、 CSFV/HeBQHD1、 CSFV/HeNZZ1、 CSFV/ HBES2、 CSFV/ZJHZ1、 CSFV/HENZMD1、 CSFV/HeNXC3、 CSFV/JSXZ1、 CSFV/GXFL1、 CSFV/HeBCB2、 CSFV/HENZMD2、 CSFV/HeNXC1、 CSFV/HBHG1、 CSFV/HBHM1、 CSFV/HBJZ1、 CSFV/LNCY1、 CSFV/ SCMY1、 CSFV/HBXY4、 CS。