稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010248590.5 (22)申请日 2020.04.01 (71)申请人 华南农业大学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483号 (72)发明人 林菲罗晓徐汉虹 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 刘瑜 (51)Int.Cl. C12N 15/82(2006.01) C12N 15/31(2006.01) C12N 15/66(2006.01) A01H 5/00(2018.01) A01H 6/46(2018.01。

2、) (54)发明名称 稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功 能中的应用 (57)摘要 本发明公开了一种稻瘟病菌基因MoHXT2在 调控植物糖转运功能中的应用。 本发明发现 MoHXT2编码的转运蛋白接受多种糖作为底物， 即 MoHXT2基因是稻瘟病菌的己糖转运蛋白， 利用 CRISPR/Cas9基因敲除系统敲除MoHXT2后， 发现 其突变体菌丝黑色素含量明显减少， 致病性大幅 度下降， 且根皮苷能对MoHXT2转运己糖产生一定 的抑制， 从而抑制稻瘟菌的生长。 因此， MoHXT2基 因可以用于调控植物糖转运功能、 调控稻瘟病菌 的致病能力和调控稻瘟病菌生长发育， 还可以作 为新型农药。

3、的药物靶标， 为合成靶向杀菌剂提供 了更可靠的方向。 权利要求书2页 说明书19页 序列表7页 附图11页 CN 111411122 A 2020.07.14 CN 111411122 A 1.一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用， 其特征在于， 所述的稻 瘟病菌基因MoHXT2的核苷酸序列为如下任一序列： (a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； (b)由如SEQ ID NO.2所示的上游同源臂核苷酸序列以及如SEQ ID NO.3所示的下游同 源臂核苷酸序列组成的序列。 2.根据权利要求1所述的稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用， 其特 征在于。

4、： 所述的植物为水稻； 所述的糖为葡萄糖， 半乳糖， 甘露糖和果糖中的至少一种。 3.根据权利要求1或2所述的稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用， 其 特征在于： 为通过基因敲除来降低糖转运能力， 或通过转入稻瘟病菌基因MoHXT2来恢复或 提高糖转运能力； 所述的基因敲除通过如下步骤实现： (1)利用Kpn I酶切pHPT1质粒， 得到酶切产物； 然后将酶切产物进行脱磷反应后纯化回 收， 得到pHPT1线性化产物； (2)将稻瘟病菌基因MoHXT2上游片段连接到pEASY-T1载体上， 得到pTA-MGGFlank1； 然 后使用接头引物Flank3 F和Flank3 R扩。

5、增pTA-MGGFlank1， 得到扩增产物I； 再用Infusion 连接酶连接扩增产物I和步骤(1)中得到的pHPT1线性化产物， 转化大肠杆菌， 提取质粒， 得 到质粒pTA-MGG Flank 1-hpt； 其中， 稻瘟病菌基因MoHXT2上游片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示； 接头引物Flank3 F和Flank3 R的核苷酸序列如SEQ ID NO.89所示； (3)利用XhoI酶切步骤(2)中得到的质粒pTA-MGG Flank 1-hpt， 得到线性化载体pTA- MGG Flank1-hpt； (4)将稻瘟病菌基因MoHXT2下游片段连接到pEASY-T1载体上，。

6、 得到pTA-MGGFlank2； 然 后使用接头引物Flank4 F和Flank4 R扩增pTA-MGGFlank2， 得到扩增产物II； 再用Infusion 连接酶连接扩增产物II和步骤(3)中得到的线性化载体pTA-MGG Flank 1-hpt， 转化大肠杆 菌， 提取质粒， 得到质粒pMoHXT2Flank1-hpt-Flank2； 其中， 稻瘟病菌基因MoHXT2下游片段 的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示； 接头引物Flank4 F和Flank4 R的核苷酸序列如SEQ ID NO.1011所示； (5)将Guide-it Recombinant Cas9与sgRNA混合。

7、后孵育， 得到复合物； 然后利用CRISPR Cas9系统， 将复合物和步骤(4)中得到的质粒pMoHXT2 Flank1-hpt-Flank2转入稻瘟菌原生 质体， 再转化真菌， 筛选得到基因敲除后的突变体Mohxt2； 其中， sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示； 步骤(2)所述的扩增产物I和pHPT1线性化产物的摩尔比为1： 46； 步骤(4)所述的扩增产物II和线性化载体pTA-MGG Flank 1-hpt的摩尔比为1： 46； 所述的转入稻瘟病菌基因MoHXT2为通过如下步骤实现： 将MoHXT2基因克隆至酵母异源 表达载体pDR195中， 构建pDR195:Mo。

8、HXT2载体； 然后将pDR195:MoHXT2载体转入酵母菌株 中， 以恢复或提高糖转运能力。 4.根据权利要求3所述的稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用， 其特 征在于， 在步骤(5)之后还包括进行验证的步骤， 具体为： 权利要求书 1/2 页 2 CN 111411122 A 2 利用使用如SEQ ID NO.1314所示的引物Mohxt2 F1和Hpt R进行扩增， 鉴定上游同 源臂是否插入以及是否含有标记基因Hpt片段； 使用如SEQ ID NO.1516所示的引物 Mohxt2 F2和Hpt F进行扩增， 鉴定下游同源臂是否插入以及是否含有标记基因Hpt片段； 使。

9、 用如SEQ ID NO.1718所示的引物Mohxt2CDS F和Mohxt2 CDS R进行扩增， 鉴定是否 含有CDS区域。 5.一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌致病力中的应用， 其特征在于， 所述的稻 瘟病菌基因MoHXT2的核苷酸序列为如下任一序列： (a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； (b)由如SEQ ID NO.2所示的上游同源臂核苷酸序列以及如SEQ ID NO.3所示的下游同 源臂核苷酸序列组成的序列。 6.根据权利要求5所述的稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌致病力中的应用， 其特 征在于： 为通过敲除稻瘟病菌基因MoHXT2来降低稻瘟病菌致病力。

10、， 或通过转入稻瘟病菌基 因MoHXT2来恢复或提高稻瘟病菌致病力。 7.一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌生长中的应用， 其特征在于， 所述的稻瘟 病菌基因MoHXT2的核苷酸序列为如下任一序列： (a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； (b)由如SEQ ID NO.2所示的上游同源臂核苷酸序列以及如SEQ ID NO.3所示的下游同 源臂核苷酸序列组成的序列。 8.根据权利要求7所述的稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌生长中的应用， 其特征 在于： 为通过敲除稻瘟病菌基因MoHXT2， 抑制稻瘟病菌的生长发育； 或通过转入稻瘟病菌基 因MoHXT2来促进稻瘟病菌的生长。

11、发育。 9.一种稻瘟病菌基因MoHXT2在农药基因靶标中的应用， 其特征在于， 所述的稻瘟病菌 基因MoHXT2的核苷酸序列为如下任一序列： (a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； (b)由如SEQ ID NO.2所示的上游同源臂核苷酸序列以及如SEQ ID NO.3所示的下游同 源臂核苷酸序列组成的序列。 10.阻断或抑制所述稻瘟病菌基因MoHXT2的表达的药物在制备防治稻瘟病的农药中的 应用， 其特征在于， 所述的稻瘟病菌基因MoHXT2的核苷酸序列为如下任一序列： (a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； (b)由如SEQ ID NO.2所示的上游同源臂核苷酸序列以及如。

12、SEQ ID NO.3所示的下游同 源臂核苷酸序列组成的序列； 所述的药物为根皮苷。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111411122 A 3 稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用 技术领域 0001 本发明属于真菌基因工程领域， 特别涉及一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖 转运功能中的应用。 背景技术 0002 稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)是一个复杂的、 异宗配合的子囊菌， 它能侵染包 括水稻、 麦类作物、 以及玉米等50多种禾本科植物。 在高湿度条件下， 稻瘟病菌分生孢子接 触水稻叶片后， 迅速萌发并产生称为附着胞的特化侵染结构。 附着孢通过黑。

13、化作用聚集甘 油类溶质从而产生高水平的内膨压帮助稻瘟病菌侵入水稻细胞1。 进入水稻细胞之后， 稻 瘟病菌开始形成厚球状的初生侵染菌丝， 持续35天之后才显示症状。 稻瘟病菌侵染水稻 具体过程如下： 1)越冬菌丝萌发产生分生大量的孢子， 在风力等介质帮助下最终接触到水 稻叶片， 此时孢子尖端产生的粘液帮助孢子吸附在叶片表面从而有利于下一步侵染； 2)孢 子萌发产生芽管， 芽管顶端也能产生粘液以便于进一步稳定的吸附在叶片表面； 3)形成附 着胞， 首先在芽管顶端卷曲形成钩状体， 紧接着逐渐膨大形成附着胞， 附着胞成熟后产生大 量黑色素沉积在细胞壁内形成黑色素层， 黑色素层有利于细胞内渗透物质的积累。

14、和膨压的 产生， 产生的膨压能侵染栓穿透水稻叶片角质层和表皮细胞壁； 4)侵染栓能分化形成次生 菌丝， 菌丝继续生长扩散侵染到相邻的表皮细胞中， 并进而深入到叶肉细胞， 最终形成大面 积的侵染病斑2-3。 有研究称， 稻瘟病菌侵染寄主依赖于稻瘟病菌中的6-P葡萄糖的传感器 Tpsl， 它可对葡萄糖做出反应， 并融合氮源和碳源代谢5-6。 0003 己糖转运蛋白是一种重要的糖转运蛋白， 用于吸收和转运己糖。 目前， 酿酒酵母己 糖载体蛋白的研究比较深入， 己鉴定出的有20个己糖载体蛋白， 发现酿酒酵母的hxtl-7基 因缺失突变体， 在葡萄糖、 甘露糖、 半乳糖和果糖培养基上无法生长， 将基因H。

15、xt1， Hxt2， Hxt3， Hxt4， Hxt6， Hxt7和Gal2分别互补hxtl-7基因缺失突变体后， 得到著名已经缺陷型酿 酒酵母菌株EBY.VW4000， 菌株恢复利用葡萄糖的能力7。 此外， 在Neurospora crcma， Aspergillusnidulans和Colletotrichum graminicola中也有数个己糖载体蛋白基因被鉴 定。 全基因扫描发现稻瘟病菌具有66个糖转运蛋白编码基因， 而这些基因在稻瘟病菌致病 过程中的作用仍然未知8。 Hiromasa Saitoh等首次发现了稻瘟病菌中的一个己糖载体蛋 白基因MoST14， MoST1对分生孢子和附。

16、着孢的黑化作用起必不可少的作用， 暗示了光合产 物糖营养的转移和输送也参与了水稻和稻瘟病菌的识别和互作。 进化分析表明， 在66个己 糖转运蛋白样基因中， MGG_01446、 MGG_00040和MGG_06203三个基因与MoST1的亲缘关系最 为密切， 由NCBI数据分析得知MoST1的氨基酸序列与MGG_00040的同源性为31.9。 将其命 名为MOHXT2。 0004 高等生物通常都有复杂的基因网络来确保细胞内的生物活动有条不紊地进行。 真 菌的多种性状如致病性、 复杂代谢合成途径、 重要信号传导途径、 重要功能的蛋白复合体等 都涉及到了多个基因的共同作用。 基因敲除技术是真菌功能。

17、基因组研究中必不可少的手 段。 建立一个核糖核蛋白CRISPR-Cas9(RNP-CRISPR-Cas9)系统， 该系统利用纯化的核定位 说明书 1/19 页 4 CN 111411122 A 4 Cas9(Cas9-NLS)和体外合成的sgRNA9， 当携带可选择标记序列并能修复DSB的供体DNA与 RNP共转化为真菌原生质体时10， 该过程在基因组靶序列上产生高效的稻瘟病菌突变率。 0005 传统化学合成杀菌剂不但对环境污染大， 还容易造成病原菌抗性的增加， 用药成 本增高。 因此， 利用CRISPR Cas9基因敲除技术， 明确病原菌糖转运蛋白的功能， 将病原菌和 植物中的糖互作关系运用。

18、于病害的控制， 有利于生态环境的发展且提高防治效率。 0006 参考文献 0007 1.Jong J C D.Mccormack B J.Smirnoff N,et al.Glycerol generates turgor in rice blastJ.Nature,1997,389(6648):244-244. 0008 2.Dean R.A.， Talbot N.J.， Ebbole D.J.， et al.The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea.Nature， 2005， 434:980-986. 0。

19、009 3刘海涛， 徐倩， 何炜， 等.水稻稻瘟病抗性变化及抗性基因克隆的研究进展.福 建农业学报， 2016， 31(5):545-552 0010 4.Saitoh,H.,et al.,MoST1encoding a hexose transporter-like protein is involved in both conidiation and mycelial melanization of Magnaporthe oryzae.FEMS Microbiology Letters,2014.352(1):p.104-113 0011 5.Foster,A.J.； Jenkinson。

20、,J.M.； Talbot,N.J.,Trehalose synthesis and metabolism are required at different stages of plant infection by Magnaporthe grisea.The EMBO Journal 2003,22,(2),225-235. 0012 6.Wilson,R.A.； Talbot,N.J.； Littlechild,J.A.； Wang,Z.； Jenkinson,J.M.； Gibson,R.P.,Tps1regulates the pentose phosphate pathway,ni。

21、trogen metabolism and fungal virulence.The EMBO Journal 2007， 26， (15)， 3673-3685. 0013 7.Reifenberger E,Freidel K,Ciriacy M.Identification of Novel Hxt Genes in Saccharomyces cerevisiae Reveals the Impact of Individual Hexose Transporters on Glycolytic FluxJ.Molecular Microbiology,1995,16(1):157-16。

22、7. 0014 8.许俊洁等,稻瘟病菌中己糖载体蛋白的生物信息学分析.武夷科学,2014.30 (00):第187-194页. 0015 9.Cho S W,Lee J ,Carroll D.,et al.Heritable Gene Knockout in Caenorhabditis Elegans by Direct Injection of Cas9-sgRNA Ribonucleoproteins J.Genetics,2013,195. 0016 10.Foster,A.J.,et al.,CRISPR-Cas9ribonucleoprotein-mediated co- edit。

23、ing and counterselection in the rice blast fungus.Scientific Reports, 2018.8(1). 发明内容 0017 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足， 提供一种稻瘟病菌基因 MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应用。 0018 本发明的另一目的在于提供一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌致病力中 的应用。 0019 本发明的又一目的在于提供一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌生长中的 说明书 2/19 页 5 CN 111411122 A 5 应用。 0020 本发明的再一目的在于提供一种稻瘟病菌基因Mo。

24、HXT2在杀菌剂靶标中的应用。 0021 本发明的目的通过下述技术方案实现： 一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转 运功能中的应用； 其中， 所述的稻瘟病菌基因MoHXT2的核苷酸序列为如下任一序列： 0022 (a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； 0023 (b)由如SEQ ID NO.2所示的上游同源臂核苷酸序列以及如SEQ ID NO.3所示的下 游同源臂核苷酸序列组成的序列。 0024 所述的植物优选为水稻。 0025 所述的糖为单糖； 优选为己糖； 包括葡萄糖， 半乳糖， 甘露糖和果糖中的至少一种。 0026 所述的稻瘟病菌基因MoHXT2在调控植物糖转运功能中的应。

25、用， 为通过基因敲除 (敲除稻瘟病菌基因MoHXT2)来降低糖转运能力(减少黑色素沉积)， 或通过转入稻瘟病菌基 因MoHXT2来恢复或提高糖转运能力。 0027 所述的基因敲除的载体为CRISPR Cas9载体。 0028 所述的基因敲除优选为通过如下步骤实现： 0029 (1)利用Kpn I酶切pHPT1质粒， 得到酶切产物； 然后将酶切产物进行脱磷反应后纯 化回收， 得到pHPT1线性化产物； 0030(2)将稻瘟病菌基因MoHXT2上游片段连接到pEASY-T1载体(Cloning vector)上， 得到pTA-MGGFlank1； 然后使用接头引物Flank3F和Flank3R扩增。

26、pTA- MGGFlank1， 得到扩增产物I； 再用Infusion连接酶连接扩增产物I和步骤(1)中得到的pHPT1 线性化产物， 转化大肠杆菌， 提取质粒， 得到质粒pTA-MGG Flank 1-hpt； 其中， 稻瘟病菌基 因MoHXT2上游片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示； 接头引物Flank3F和Flank3R的核苷 酸序列如SEQ ID NO.89所示； 0031 (3)利用XhoI酶切步骤(2)中得到的质粒pTA-MGG Flank 1-hpt， 得到线性化载体 pTA-MGG Flank1-hpt； 0032(4)将稻瘟病菌基因MoHXT2下游片段连接到pEAS。

27、Y-T1载体(Cloning vector)上， 得到pTA-MGGFlank2； 然后使用接头引物Flank4F和Flank4R扩增pTA- MGGFlank2， 得到扩增产物II； 再用Infusion连接酶连接扩增产物II和步骤(3)中得到的线 性化载体pTA-MGG Flank 1-hpt， 转化大肠杆菌， 提取质粒， 得到质粒pMoHXT2Flank1-hpt- Flank2(作为donor DNA)； 其中， 稻瘟病菌基因MoHXT2下游片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示； 接头引物Flank4F和Flank4R的核苷酸序列如SEQ ID NO.1011所示； 0033 。

28、(5)将Guide-it Recombinant Cas9与sgRNA混合后孵育， 得到复合物； 然后利用 CRISPR Cas9系统， 将复合物和步骤(4)中得到的质粒pMoHXT2Flank1-hpt-Flank2转入稻瘟 菌原生质体， 再转化真菌， 筛选得到基因敲除后的突变体Mohxt2； 其中， sgRNA的核苷酸序列 如SEQ ID NO.12所示。 0034 步骤(1)和(3)中所述的酶切的条件为： 37酶切3h。 0035 步骤(1)所述的脱磷反应的反应体系为： 2.5mL 10Alkaline Phosphatase Buffer， 1 L Alkaline Phosphata。

29、se(CIAP)， 去离子H2O补足至25 L。 0036 步骤(1)所述的脱磷反应的条件为： 50、 15min； 37、 5min。 0037 步骤(2)所述的扩增产物I和pHPT1线性化产物的摩尔比为1： 46； 优选为1： 4。 说明书 3/19 页 6 CN 111411122 A 6 0038 步骤(2)和(4)中所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌DH5 。 0039 步骤(4)所述的扩增产物II和线性化载体pTA-MGG Flank 1-hpt的摩尔比为1： 4 6； 优选为1： 4。 0040 步骤(4)所述的孵育的条件优选为： 37下孵育5分钟。 0041 所述的基因敲除， 在步骤。

30、(5)之后还包括进行验证的步骤， 具体为： 利用使用引物 Mohxt2F1和Hpt R(SEQ ID NO.1314)进行扩增， 鉴定上游同源臂是否插入以及是否含 有标记基因Hpt片段； 使用引物Mohxt2F2和Hpt F(SEQ ID NO.1516)进行扩增， 鉴定下 游同源臂是否插入以及是否含有标记基因Hpt片段； 使用引物Mohxt2CDS F和 Mohxt2CDS R(SEQ ID NO.1718)进行扩增， 鉴定是否含有CDS区域， 选择能够扩增出条带 (含有潮霉素片段)且无CDS区域的转化子， 即为敲除成功的突变体。 0042 所述的转入稻瘟病菌基因MoHXT2为通过如下步骤实。

31、现： 将MoHXT2基因克隆至酵母 异源表达载体pDR195中， 构建pDR195:MoHXT2载体； 然后将pDR195:MoHXT2载体转入酵母 菌株中， 以恢复或提高糖转运能力。 0043 所述的酵母菌株优选为糖转运蛋白缺失突变体EBY.VW4000。 0044 一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌致病力中的应用； 其中， 所述的稻瘟病 菌基因MoHXT2的核苷酸序列为如下任一序列： 0045 (a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； 0046 (b)由如SEQ ID NO.2所示的上游同源臂核苷酸序列以及如SEQ ID NO.3所示的下 游同源臂核苷酸序列组成的序列。 0。

32、047 所述的稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌致病力中的应用， 为通过基因敲除 (敲除稻瘟病菌基因MoHXT2)来降低稻瘟病菌致病力， 或通过转入稻瘟病菌基因MoHXT2来恢 复或提高稻瘟病菌致病力。 0048 所述的基因敲除的载体为CRISPR Cas9载体。 0049 一种稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌生长中的应用； 其中， 所述的稻瘟病菌 基因MoHXT2的核苷酸序列为如下任一序列： 0050 (a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； 0051 (b)由如SEQ ID NO.2所示的上游同源臂核苷酸序列以及如SEQ ID NO.3所示的下 游同源臂核苷酸序列组成的序。

33、列。 0052 所述的稻瘟病菌基因MoHXT2在调控稻瘟病菌生长中的应用， 为通过基因敲除(敲 除稻瘟病菌基因MoHXT2)后， 稻瘟病菌的昼夜节律受到干扰， 抑制稻瘟病菌(菌丝)的生长发 育； 或通过转入稻瘟病菌基因MoHXT2来促进稻瘟病菌(菌丝)的生长发育。 0053 一种稻瘟病菌基因MoHXT2在农药基因靶标中的应用； 其中， 所述的稻瘟病菌基因 MoHXT2的核苷酸序列为如下任一序列： 0054 (a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； 0055 (b)由如SEQ ID NO.2所示的上游同源臂核苷酸序列以及如SEQ ID NO.3所示的下 游同源臂核苷酸序列组成的序列。 0。

34、056 所述的农药包括杀菌剂等； 该稻瘟病菌基因MoHXT2能够作为杀菌剂的作用靶标位 点。 0057 阻断或抑制所述稻瘟病菌基因MoHXT2的表达的药物在制备防治稻瘟病的农药中 说明书 4/19 页 7 CN 111411122 A 7 的应用； 其中， 所述的稻瘟病菌基因MoHXT2的核苷酸序列为如下任一序列： 0058 (a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； 0059 (b)由如SEQ ID NO.2所示的上游同源臂核苷酸序列以及如SEQ ID NO.3所示的下 游同源臂核苷酸序列组成的序列。 0060 所述的药物优选为己糖竞争性抑制剂； 更优选为根皮苷， 该根皮苷能对MoHX。

35、T2转 运己糖产生抑制， 从而抑制稻瘟病菌的生长。 0061 所述的根皮苷的有效浓度优选为10mol/L。 0062 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果： 0063 (1)本发明针对现有化学试剂防治水稻稻瘟菌的不足， 基于CRISPR/Cas9基因敲除 系统研究稻瘟病菌基因MoHXT2的糖转运功能， 提供一种新的杀菌剂靶标， 为有效防治稻瘟 病提供新型农药合成方向。 0064 (2)本发明通过CRISPR Cas9敲除系统可实现快速敲除， 并高效的筛选到突变体， 基于CRISPR/Cas9基因敲除系统研究稻瘟病菌基因MoHXT2的糖转运功能， 是基于本发明发 现MoHXT2基因是稻瘟病菌。

36、的己糖转运蛋白， 利用CRISPR/Cas9基因敲除系统敲除MoHXT2后， 发现其突变体菌丝黑色素含量明显减少， 致病性大幅度下降， 其分子结构可为新型农药提 供靶标。 附图说明 0065 图1为已糖转运蛋白进化树分析结果图。 0066 图2为PCR扩增鉴定Mohxt2的凝胶电泳结果图； 其中， A、 B、 C分别为上游同源臂扩 增鉴定凝胶电泳图， 下游同源臂扩增凝胶电泳图以及CDS区域扩增鉴定凝胶电泳图(泳道M 为marker， 泳道1-16为敲除转化子， 泳道H20为阴性对照， 泳道WT为阳性对照)； D为MUT与WT 的核苷酸序列图谱(P1和P3:MOHXT2.6MUT F/HPT 5。

37、 R(A)； P2和P4:MOHXT2.6MUT R/HPT 3 F (B)； P5和P6:MOHXT2.6CDS mut F/MOHXT2.6CDS mut R(C)。 0067 图3为PCR扩增鉴定Mohxt1的凝胶电泳结果图； 其中， A、 B、 C分别为上游同源臂扩 增鉴定凝胶电泳图， 下游同源臂扩增凝胶电泳图以及CDS区域扩增鉴定凝胶电泳图(泳道M 为marker， 泳道1-9为敲除转化子， 泳道H20为阴性对照， 泳道WT为阳性对照)； D为MUT与WT的 核苷酸序列图谱。 0068 图4为Mohxt2在不同碳源培养基上的生长情况结果图。 0069 图5为野生型菌株WT、 Mohx。

38、t2以及Mohxt1在液体CM培养基培养50h后黑色素差 异结果图。 0070 图6为Mohxt2在不同碳源培养基上的生长情况结果图(A： 野生型菌株WT； B： Mohxt2)。 0071 图7为Mohxt1与Mohxt2在不同碳源上黑色素浓度测定结果图。 0072 图8为野生型菌株WT与Mohxt2分生孢子梗拍摄结果图； 其中， A为野生型菌株WT； B为Mohxt2。 0073 图9为野生型菌株WT与Mohxt2水稻(CO39品种)叶片离体接种孢子后的致病性结 果图。 0074 图10为野生型菌株WT与Mohxt2水稻(CO39品种)叶片活体接种结果的致病性结 说明书 5/19 页 8 。

39、CN 111411122 A 8 果图。 0075 图11为Mohxt2的酵母互补菌株在不同碳源上的生长结果图； 其中， A为接种模式 图(与B对应)； B为酵母互补菌株生长结果。 0076 图12为野生型菌株WT与Mohxt2的菌丝带模式结果图(A： 野生型菌株WT； B： Mohxt2)。 0077 图13为MoHXT2同源建模结果图； 其中， A为MoHXT2的同源性模型； B为MoHXT2的 Ramachandran图(深绿色的点表示在有利区域中的残基； 黄点表示允许区域中的残基， 红叉 表示非理性区域中的残基)； C为MoHXT2模型结构和模板结构叠加的结果(MoHXT2结构以紫 色。

40、显示， 模板结构以橙色显示， 覆盖层的平均RMSD值为)； D为MoHXT2和模板结构之间 基于结构的序列比较(相同或相似的残基以蓝色突出显示， 不相似的残基以红色突出显示， 较深的颜色表示更多相似或不相似的残基； 对应于 -螺旋的序列用红线标记； 图中MGG_ 00040即本发明中的MoHXT2)。 0078 图14为MoHXT2和D(+)-葡萄糖-50-99-7之间的结合模型图； 其中， A为MoHXT2和D (+)-Glucose-50-99-7之间的2D绑定模型； B为MoHXT2和D(+)-葡萄糖50-99-7之间的3D绑定 模型(D(+)-葡萄糖-50-99-7为青色， 结合袋中周。

41、围的残基为黄色； 受体的骨架被描绘为淡 黄色卡通； 氢键描绘为红色虚线)； C为D(+)-葡萄糖-50-99-7在MoHXT2分子表面上的结合模 型(D(+)-葡萄糖-50-99-7为青色)。 0079 图15为MoHXT2与D-(-)-果糖57-48-7之间的结合模型图； 其中， A为MoHXT2和D- (-)-果糖-57-48-7之间的2D绑定模型； B为MoHXT2和D-(-)-果糖-57-48-7之间的3D绑定模 型(D-(-)-果糖57-48-7为青色， 结合袋中周围的残基为黄色； 受体的骨架被描绘为淡黄色 卡通； 氢键描绘为红色虚线)； C为D-(-)-果糖-57-48-7在MoH。

42、XT2分子表面上的结合模型(D- (-)-果糖-57-48-7为青色)。 0080 图16为MoHXT2和D-半乳糖-59-23-4之间的结合模型图； 其中， A为MoHXT2和D- Galactose-59-23-4之间的2D绑定模型； B为MoHXT2和D-Galactose-59-23-4之间的3D绑定 模型(D-Galactose-59-23-4为青色， 结合袋中周围的残基为黄色； 受体的骨架被描绘为淡 黄色卡通； 氢键描绘为红色虚线)； C为D-半乳糖-59-23-4在MoHXT2分子表面上的结合模型 (D-Galactose-59-23-4为青色)。 0081 图17为MoHXT2。

43、和D-甘露糖3458-28-4之间的结合模型图； 其中， A为MoHXT2和D-甘 露糖3458-28-4之间的2D绑定模型； B为MoHXT2和D-甘露糖3458-28-4之间的3D绑定模型(D- 甘露糖3458-28-4为青色， 结合袋中周围的残基为黄色； 受体的骨架被描绘为淡黄色卡通； 氢键描绘为红色虚线)； C为D-甘露糖-3458-28-4在MoHXT2分子表面上的结合模型(D-甘露 糖3458-28-4为青色)。 0082 图18为野生型菌株WT在含10mM根皮苷的CM的生长图； 其中， 图A为野生型菌株WT在 单糖上的生长表型； 图B为数据统计图。 0083 图19为MoHXT2。

44、和根皮苷-7061-54-3之间的结合模型图； 其中， A为MoHXT2与根皮 苷-7061-54-3之间的2D结合模型； B为MoHXT2和根皮苷-7061-54-3之间的3D结合模型(根皮 苷-7061-54-3被染成青色， 结合袋中周围的残基被染成黄色； 受体的骨架被描绘成淡黄色 卡通； 氢键描绘为红色虚线)； C为在水合物MoHXT2的分子表面上的水合根皮苷-7061-54-3 的结合模型(根皮苷-7061-54-3被染成青色)。 说明书 6/19 页 9 CN 111411122 A 9 具体实施方式 0084 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的实施方式不限于此。。

45、 下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法， 通常按照常规实验条件或按照制造厂所建 议的实验条件。 所使用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 皆为从商业途径得到的试剂和材料。 0085 本发明实施例中涉及的大肠杆菌DH5 购自全式金生物科技有限公司； 稻瘟菌为普 通野生型菌株稻瘟病菌70-15(购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心)(简称WT)； 酵母 己糖转运蛋白缺失突变体EBY.VW4000(即己糖缺陷型酵母菌株EBY.VW4000)。 pHPT1质粒购 买于上海柯雷生物科技有限公司； 酵母异源表达载体pDR195(空载体pDR195)购买于优宝生 物公司。 0086 本发明实施例中所使用。

46、的化学试剂均为进口或国产分析纯。 0087 本发明实施例中所使用的引物由深圳华大基因公司合成， 测序在深圳华大基因公 司进行。 0088 本发明中涉及的CM培养基的配方如下： 0089 CM培养基配方 0090 0091 1mol NaOH调pH值至6.5， 加水至1000mL； 若配固体培养基， 则加入15g/mL琼脂粉， 高压灭菌。 0092 其中， 表中涉及的 “20 x Nitrate Salts” 、“1000 x Vitamin Solution” 和 “1000 x Trace elements” 的配方如下： 0093 Nitrate Salts母液的配方 0094 20Nit。

47、rate Salts1000mL NaNO3120g KCI10.4g MgSO4 7H2O10.4g KH2PO430.4g 0095 用灭菌蒸馏水配制， 逐个溶解后定容至1000mL， 4黑暗保存。 0096 Trace elements母液的配方 0097 1000Trace elements80mL ZnSO47H2O2.2g H3BO3硼酸1.1g MnCl2 4H2O0.5g 说明书 7/19 页 10 CN 111411122 A 10 FeSO4 7H2O0.5g CoCl2 6H2O0.17g CuSO4 5H2O0.16g 0098 以上药品逐个加入溶解后， 单独溶解0.1。

48、3g的Na2MoO42H2O加入； 再加入4.45g的 Na2EDTA， 少量多次加， 混匀。 用细菌过滤器除菌。 刚配完的溶液为墨绿色， 4黑喑保存后逐 渐变为红色。 溶液配成后会有沉淀， 属正常现象， 取上清使用即可。 0099 Vitamin Solution母液的配培养 0100 1000Vitamin Solution100mL 生物素(Biotin)0.01g(用热水溶解) VB6(Pyridoxin)0.01g VB1(Thiamine)0.01g VB2(Riboflavin)0.01g 对氨基苯甲酸(PABA)0.01g 烟酸(Nicotinie acid)0.01g 010。

49、1 以上药品逐个溶解后加水定容至100mL， 用细菌过滤器除菌， 4黑暗保存。 0102 实施例1 MoHXT2基因突变体的敲除与鉴定 0103 (1)扩增目的片段 0104 将野生型稻瘟病菌WT接种到CM固体培养基中， 置于28培养箱中黑暗生长5d， 收 集菌丝， 然后将菌丝切成碎块均匀分装到50mL CM液体培养基中， 28， 160rpm， 培养48小时 后， 收集菌丝， 无菌水清洗后提取野生型稻瘟病菌WT的基因组DNA(DNA提取为真菌基因组 DNA提取试剂盒M5Fungal Genomic DNA Kit真菌基因组DNA提取试剂盒购买于北京聚合美 生物科技有限公司)， 保存于-20。。

50、 将其作为模板， 分别使用引物Flank1F/R及Flank2F/R对 MoHXT2基因(SEQ ID NO.1)上下游同源臂序列进行PCR扩增， 基因组DNA(gDNA)扩增浓度为 5ng/ L， 使用以下反应混合物： 2 l 1Taq缓冲液； 2 l 0.25mM dNTPs； 10 M每种引物各1 L； 0.15 L 0.4U Taq聚合酶； 1 L gDNA(5ng)； 补H2O至20 L。 其中， 0105 上游同源臂扩增引物序列如下： 0106 Flank1F:5 -accgaatttctcccttcttgtt-3 (SEQ ID NO.4)； 0107 Flank1R:5 -ca。