菌酶共酵玉米秸秆生产微生物油脂的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010451634.4 (22)申请日 2020.05.26 (71)申请人 山东理工大学 地址 255086 山东省淄博市高新技术产业 技术开发区高创园A座313室 (72)发明人 张瑶宋元达王艳霞 (51)Int.Cl. C12P 39/00(2006.01) C12P 19/14(2006.01) C12P 7/64(2006.01) C12N 1/16(2006.01) C12N 1/14(2006.01) C12R 1/785(2006.01) C12R 1/64。

2、5(2006.01) (54)发明名称 一种菌酶共酵玉米秸秆生产微生物油脂的 方法 (57)摘要 本发明公开了一种菌酶共酵玉米秸秆生产 微生物油脂的方法， 属于微生物发酵领域。 本发 明利用卷枝毛霉、 解脂耶氏酵母和纤维素酶相互 协同作用发酵玉米秸秆， 其发酵条件为： 纤维素 酶粉添加量为1.5%， 卷枝毛霉与解脂耶氏酵母的 菌种配比为1:1.5， 总接种量为10%， 搅拌转速200 rpm/min， 发酵温度为31， 发酵时间为54h， 最 终每升玉米秸秆发酵液中可以获得微生物油脂 为1.24g。 本发明方法可直接转化木质纤维素， 一 步实现纤维素单糖油脂的同步化， 大大降低 生产成本并减少。

3、环境污染。 权利要求书1页 说明书3页 CN 111411141 A 2020.07.14 CN 111411141 A 1.一种菌酶共酵玉米秸秆生产微生物油脂的方法， 其特征在于利用卷枝毛霉WJ11、 解 脂耶氏酵母CICC1778和纤维素酶相互协同作用发酵玉米秸秆， 包括以下步骤： (1) 玉米秸秆预处理： 将玉米秸秆在80 烘箱中烘至质量不变， 碾碎， 过筛， 取介于50 目和100目之间的玉米秸秆试验； (2) 种子培养： 将-80 甘油管保存的卷枝毛霉WJ11和解 脂耶氏酵母CICC1778菌株分别接入种子培养基中， 使用回转恒温调速摇床进行培养， 控制 转速200 rpm/min，。

4、 培养温度28 ， 初始pH值6.0， 培养时间24小时获得种子液； (3) 发酵培 养： 称取经过预处理的玉米秸秆粉5 g放入含100 mL 基础营养液的三角瓶中， 在纤维素酶 粉 （蛋白含量为1 mg/mL） 的添加量为1.5%的条件下， 将培养好的种子液按卷枝毛霉： 解脂耶 氏酵母为1:1.5的菌种配比， 总接种量为10%接入， 搅拌转速200 rpm/min， 发酵温度为31 ， 发酵时间为54 h。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于所述种子培养基的组成为： 葡萄糖20 g/L， 蛋白胨20 g/L， 酵母提取物10 g/L。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于所述基。

5、础营养液的组成为： 葡萄糖 5 g/L， 酒石酸铵2 g/L， KH2PO4 7 g/L， Na2HPO4 2 g/L， MgSO47H2O 1.5 g/L， 酵母1.5 g/L， CaCl22H2O 0.1 g/L， FeCl36H2O 8 mg/L， ZnSO47H2O 1 mg/L， CuSO45H2O 0.1 mg/L， Co(NO3)26H2O 0.1 mg/L， MnSO45H2O 0.1 mg/L。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111411141 A 2 一种菌酶共酵玉米秸秆生产微生物油脂的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种菌酶共酵玉米秸秆生产微生物油脂的方法， 属于。

6、微生物发酵领 域。 本发明的发酵菌酶涉及卷枝毛霉、 解脂耶氏酵母及纤维素酶。 背景技术 0002 随着化石资源的日益紧缺， 多渠道开发可再生油脂资源已是大势所趋。 产油微生 物在细胞内能够积累大量甘油三酯， 通过微生物转化可再生资源生产油脂， 部分替代化石 资源， 将是可持续发展的必然。 此外， 少数真菌、 微藻、 细菌等还能合成对人类健康十分有益 的功能性多不饱和脂肪酸， 如花生四烯酸 （Arachidonic acid） 、 -亚麻酸 （-linolenic acid） 、 二十二碳六烯酸 （Docosahexaenoic acid） 、 二十碳五烯酸 （Eicosapentaenoic 。

7、acid） 等， 这些具有生物活性的脂肪酸已被认定为重要的营养食品资源。 因而开发利用产油 微生物合成油脂， 具有重要的社会价值和经济价值。 0003 木质纤维素是自然界中最丰富、 最廉价的可再生原料之一， 如我国仅农作物秸秆 每年产量达10亿吨， 约占全世界秸秆总量的20%30%。 秸秆多用作饲料、 燃料及有机肥料。 目 前我国普遍采用就地焚烧处理秸秆， 不仅污染了环境， 还影响群众健康， 因此如何优化处理 秸秆成为了社会性问题， 其中微生物发酵是近年来的研究热点。 目前普遍使用的秸秆微生 物油脂生产方法须先将秸秆中木质纤维素降解成小分子的可利用单糖 （六元糖或五元糖） ， 然后再经微生物发。

8、酵转化为油脂， 此前处理过程大多采用传统酸碱法， 但存在有毒副产物 抑制、 步骤繁琐、 过程成本高、 污染严重等一系列问题。 从长远意义看， 可以采用多种产油微 生物和纤维素酶共同发酵直接转化木质纤维素， 可一步实现纤维素单糖油脂的同步 化， 大大降低生产成本并减少环境污染。 0004 卷枝毛霉是-亚麻酸(GLA)的主要生产菌种之一， 最早被用于工业化生产GLA， 后 来因为成本问题被迫停产。 前期研究表明， 卷枝毛霉可以吸收利用六元糖和五元糖 （Lipid accumulation by pelletized culture of Mucor circinelloides on corn s。

9、tover hydrolysate, Appl Biochem Biotechnol, 2014, 174: 411-423） ， 并能分泌出纤维素酶 （Genomic , proteomic , and biochemical analyses of oleaginous Mucor circinelloides: evaluating its capability in utilizing cellulolytic substrates for lipid production, Plos One, 2013, 8(9): e71068） ， 因而可以充分利 用秸秆中纤维素和半纤维素， 在。

10、降低生产成本上具有突出优势。 解脂耶氏酵母 （Yarrowia lipolytica） 是生产单细胞油脂的最佳菌株， 它能够利用诸多廉价底物作为碳源， 在工业上 有极大的应用前景。 目前研究和应用较为广泛的产油菌有圆红冬孢酵母、 隐球酵母、 康宁木 霉和产黄纤维单孢菌， 还未有卷枝毛霉和解脂耶氏酵母共同作用玉米秸秆发酵生产微生物 油脂的报道。 综上所述， 通过菌酶共酵玉米秸秆生产微生物油脂能有效实现农业可持续发 展， 开辟绿色能源新途径。 说明书 1/3 页 3 CN 111411141 A 3 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是提供一种菌酶共酵玉米秸秆生产微生物油脂的方 法， 可。

11、直接转化木质纤维素， 一步实现纤维素单糖油脂的同步化， 大大降低生产成本并 减少环境污染。 0006 本发明的技术方案如下： 一种菌酶共酵玉米秸秆生产油脂的方法， 是利用卷枝毛霉WJ11 （Complete genome sequence of a high lipid-producing strain of Mucor circinelloides WJ11 and comparative genome analysis with a low lipid-producing strain CBS 277.49, PloS One, 2015, 10(9): e0137543） 、 解脂耶氏酵。

12、母CICC1778 （Metabolic flux analysis of lipid biosynthesis in the yeast Yarrowia lipolytica using 13C-labled glucose and gas chromatography-mass spectrometry, Plos One, 2016, 11(7): e0159187） 与纤维素酶处理玉米秸秆， 具体过程如下： (1) 玉米秸秆预处理： 将玉米秸秆在80 烘箱中烘至质量不变， 碾碎， 过筛， 取介于50 目和100目之间的玉米秸秆试验。 0007 (2) 种子培养： 将-80 甘油管保存。

13、的卷枝毛霉WJ11和解脂耶氏酵母CICC1778菌 株分别接入种子培养基中， 使用回转恒温调速摇床进行培养， 控制转速200 rpm/min， 培养 温度28 ， 初始pH值6.0， 培养时间24小时获得种子液。 0008 (3) 发酵培养： 称取经过预处理的玉米秸秆粉5 g放入含100 mL 基础营养液的三 角瓶中， 在纤维素酶粉 （蛋白含量为1 mg/mL） 的添加量为1.5%的条件下， 将培养好的种子液 按卷枝毛霉： 解脂耶氏酵母为1:1.5的菌种配比， 总接种量为10%接入， 搅拌转速200 rpm/ min， 发酵温度为31 ， 发酵时间为54 h。 0009 所述种子培养基的组成为。

14、： 葡萄糖20 g/L， 蛋白胨20 g/L， 酵母提取物10 g/L。 0010 所述基础营养液的组成为： 葡萄糖 5 g/L， 酒石酸铵2 g/L， KH2PO4 7 g/L， Na2HPO4 2 g/L， MgSO47H2O 1.5 g/L， 酵母1.5 g/L， CaCl22H2O 0.1 g/L， FeCl36H2O 8 mg/L， ZnSO47H2O 1 mg/L， CuSO45H2O 0.1 mg/L， Co(NO3)26H2O 0.1 mg/L， MnSO45H2O 0.1 mg/L。 0011 本发明的有益效果： 本发明提供了一种菌酶共酵玉米秸秆生产微生物油脂的方法， 利用卷。

15、枝毛霉、 解脂耶 氏酵母和纤维素酶相互协同作用， 每升玉米秸秆发酵液中可以获得微生物油脂为1.24g。 本 发明方法可直接转化木质纤维素， 一步实现纤维素单糖油脂的同步化， 大大降低生产 成本并减少环境污染。 具体实施方式 0012 菌种的准备： 本实验室保藏菌株卷枝毛霉WJ11 （Complete genome sequence of a high lipid- producing strain of Mucor circinelloides WJ11 and comparative genome analysis with a low lipid-producing strain CBS 。

16、277.49, PloS One, 2015, 10(9): e0137543） 和解脂耶氏酵母CICC1778 （Metabolic flux analysis of lipid biosynthesis in the yeast Yarrowia lipolytica using 13C-labled glucose and gas 说明书 2/3 页 4 CN 111411141 A 4 chromatography-mass spectrometry, Plos One, 2016, 11(7): e0159187） 。 0013 玉米秸秆预处理： 将玉米秸秆在80 烘箱中烘至质量不变。

17、， 碾碎， 过筛， 取介于50目和100目之间的玉米 秸秆试验。 0014 种子液培养： 将-80 甘油管保存的卷枝毛霉WJ11和解脂耶氏酵母CICC1778菌株分别接入种子培 养基中， 种子培养基配方为葡萄糖20 g/L， 蛋白胨20 g/L， 酵母提取物10 g/L， 使用回转恒 温调速摇床进行培养， 控制转速200 rpm/min， 培养温度28 ， 初始pH值6.0， 培养时间24小 时获得种子液。 0015 发酵培养： 称取经过预处理的玉米秸秆粉5 g放入含100 mL 基础营养液的三角瓶中， 基础营养液 配方为葡萄糖 5 g/L， 酒石酸铵2 g/L， KH2PO4 7 g/L， 。

18、Na2HPO4 2 g/L， MgSO47H2O 1.5 g/ L， 酵母1.5 g/L， CaCl22H2O 0.1 g/L， FeCl36H2O 8 mg/L， ZnSO47H2O 1 mg/L， CuSO4 5H2O 0.1 mg/L， Co(NO3)26H2O 0.1 mg/L， MnSO45H2O 0.1 mg/L。 在纤维素酶粉 （蛋白含 量为1 mg/mL） 的添加量为1.5%的条件下， 将培养好的种子液按卷枝毛霉： 解脂耶氏酵母为 1:1.5的菌种配比， 总接种量为10%接入， 搅拌转速200 rpm/min， 发酵温度为31 ， 发酵时 间为54 h。 0016 油脂含量测定。

19、： 利用超声波粉碎机将混合发酵液处理30 min， 促使卷枝毛霉和解脂耶氏酵母细胞破 碎， 细胞内油脂释放。 利用离心机将发酵混合液分离， 将上层液体倒入具塞量筒， 加入乙醚 （30 mL） 石油醚 （30 mL） ， 充分震荡混匀， 静置30 min， 将水相中的油脂萃取出来。 用吸管 将油层吸出至试管 （已干燥至恒重， 并测得质量为m1） ， 注意尽量不要吸到下面的水层。 然后 用水浴锅 （90 ） 将乙醚石油醚蒸干， 放入恒温干燥箱 （105 ） 干燥至恒重， 测得质量为 m2， 利用差值法即得油脂质量m。 0017 公式：m=m2-m1 (g) 则： 每升发酵液含油脂的质量为：M=1000m/250 (g) 结果表明， 每升玉米秸秆发酵液中可以获得微生物油脂为1.24g。 说明书 3/3 页 5 CN 111411141 A 5 。