阿基瑞林的纯化方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010173514.2 (22)申请日 2020.03.13 (71)申请人 江苏吉泰肽业科技有限公司 地址 224500 江苏省盐城市滨海县滨海医 药产业园新安大道799-2号 (72)发明人 徐红岩秦敬国李阳王国军 (74)专利代理机构 上海浦东良风专利代理有限 责任公司 31113 代理人 张劲风 (51)Int.Cl. C07K 7/06(2006.01) C07K 1/20(2006.01) C07K 1/16(2006.01) (54)发明名称 一种阿基瑞林的纯。

2、化方法 (57)摘要 本发明涉及到一种阿基瑞林的纯化方法。 该 方法可以有效解决多肽上样量小、 成本高、 效率 低等问题， 技术方案如下： 一种阿基瑞林的纯化 方法， 包括如下步骤： 1） 将多肽产品进行预处理， 溶解过滤后为待纯化样品； 2)将上述样品进行第 一次纯化， 所述第一次纯化方法为中压色谱法， 其中以多糖凝胶、 聚合物微球或者硅胶中的一种 为固定相， 粒径为10-40m， 在流动相A和流动相 B中， 梯度洗脱收集目标馏分纯度90%以上备用； 3） 上述目标馏分进行第二次纯化， 所述第二次纯 化方法为反相高效液相色谱法， 其中以C18或者 C8键合硅胶为固定相， 粒径为7-10m， 。

3、在流动相 A和流动相B中， 梯度洗脱收集合格的馏分； 4） 用 旋转蒸发仪在32-38下旋蒸， 冻干后得到合格 得产品粉末。 权利要求书1页 说明书3页 附图4页 CN 111423490 A 2020.07.17 CN 111423490 A 1.一种阿基瑞林的纯化方法， 其特征在于： 包括如下步骤： 1） 将多肽阿基瑞林产品进行预处理， 溶解过滤后为待纯化样品； 2) 将上述样品进行第一次纯化， 所述第一次纯化方法为中压色谱法， 其中以多糖凝 胶、 聚合物微球或者硅胶中的一种为固定相， 粒径为10-40 m， 在流动相A和流动相B中， 梯度 洗脱收集目标馏分纯度90%以上备用； 3） 上述。

4、目标馏分进行第二次纯化， 所述第二次纯化方法为反相高效液相色谱法， 其中 以C18或者C8键合硅胶为固定相， 粒径为7-10 m， 在流动相A和流动相B中， 梯度洗脱收集合 格的馏分； 4） 用旋转蒸发仪在32-38下旋蒸， 冻干后得到合格得产品粉末。 2.根据权利要求1所述的一种阿基瑞林的纯化方法， 其特征在于： 所述步骤1） 样品的预 处理方法为将阿基瑞林样品溶解于甲醇水溶液， 过滤后待纯化。 3.根据权利要求1所述的一种多肽的纯化方法， 其特征在于： 所述步骤2） 粒径为15-25 m。 4.根据权利要求1所述的一种阿基瑞林的纯化方法， 其特征在于： 所述步骤2） 流动相A 为三氟乙酸、。

5、 甲酸铵、 甲酸吡啶或乙酸铵中的一种。 5.根据权利要求1所述的一种阿基瑞林的纯化方法， 其特征在于： 所述步骤2） 流动相B 为甲醇、 乙腈、 乙醇或二氯甲烷中的一种。 6.根据权利要求1所述的一种阿基瑞林的纯化方法， 其特征在于： 所述的步骤3） 流动相 A为体积百分比0.1%乙酸铵水溶液。 7.根据权利要求1所述的一种阿基瑞林的纯化方法， 其特征在于： 所述步骤3） 流动相B 为甲醇、 乙腈或乙醇中的一种。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111423490 A 2 一种阿基瑞林的纯化方法 技术领域 0001 本发明涉及多肽纯化方法， 特别涉及到一种阿基瑞林的纯化方法。 背景技术 00。

6、02 阿基瑞林(Argireline)， 又被称为类肉毒杆菌素， 是模仿SNAP-25蛋白N端6个氨基 酸的寡肽一。 多肽序列为Ac-Glu-Glu-Met-Glu-Arg-Arg-NH2， 分子式C46H56N12O6,分子量 为888.99， 结构式如下: 阿基瑞林为高端化妆品常用的原料之一， 功效主要是减少由面部表情肌收缩造成的皱 纹， 对额头或眼睛周围的皱纹有理想的祛除效果。 另外， 它还能促进胶原蛋白的生成， 有助 于肌肤组织重建。 0003 阿基瑞林是一种更安全、 更廉价、 温和的肉毒杆菌毒素替代品。 阿基瑞林参与竞争 SNAP-25在融泡复合体的位点， 从而影响融泡复合体的形成，。

7、 导致囊泡不能有效释放神经递 质， 使肌肉收缩减弱， 进而可以放松肌肉、 舒缓细纹使肌肤呈现清透无暇， 也可以促使细胞 再生使肌肤恢复柔软弹性， 因此被广泛应用于制备化妆品和保健品。 0004 近几年随着人们保健意识的增强， 化妆品和保健品市场越来越广阔， 阿基瑞林的 市场需求也越来越大。 0005 中国专利201310755456.公开了 “一种阿基瑞林的制备方法” ， 该方法通过固相合 成法制备阿基瑞林， 制备步骤较为繁琐， 纯化存在多肽上样量小、 成本高等技术问题。 发明内容 0006 本发明的目的是提供到一种阿基瑞林的纯化方法， 该方法可以有效解决多肽上样 量小、 成本高、 效率低等技。

8、术问题， 同时还可以保证收率和产品质量。 0007 为实现上述目的， 本发明的技术方案如下： 一种阿基瑞林的纯化方法， 包括如下步 骤： 1） 将多肽阿基瑞林产品进行预处理， 溶解过滤后为待纯化样品； 2) 将上述样品进行第一次纯化， 所述第一次纯化方法为中压色谱法， 其中以多糖凝 胶、 聚合物微球或者硅胶中的一种为固定相， 粒径为10-40 m， 在流动相A和流动相B中， 梯度 洗脱收集目标馏分纯度90%以上备用； 3） 上述目标馏分进行第二次纯化， 所述第二次纯化方法为反相高效液相色谱法， 其中 说明书 1/3 页 3 CN 111423490 A 3 以C18或者C8键合硅胶为固定相， 。

9、粒径为7-10 m， 在流动相A和流动相B中， 梯度洗脱收集合 格的馏分； 4） 用旋转蒸发仪在32-38下旋蒸， 冻干后得到合格得产品粉末。 0008 所述步骤1） 样品的预处理方法为将阿基瑞林样品溶解于甲醇水溶液， 过滤后待纯 化。 0009 优选的方案是： 所述步骤2） 中粒径为15-25 m。 0010 优选的方案是： 所述步骤2） 流动相A为三氟乙酸、 甲酸铵、 甲酸吡啶或乙酸铵中的 一种。 0011 优选的方案是： 所述步骤2） 流动相B为甲醇、 乙腈、 乙醇或二氯甲烷中的一种。 0012 优选的方案是： 流动相A为体积百分比0.1%乙酸铵水溶液； 所述步骤3） 流动相B为 甲醇、。

10、 乙腈或乙醇中的一种。 0013 本发明的有益效果是： 本发明涉及到一种阿基瑞林的纯化方法， 采用中压色谱法 和反相高效液相色谱法相结合， 可以增加上样量、 节省成本、 提高效率。 中压色谱填料价格 低、 上样量大， 用于第一次纯化既可以满足分离需求， 又可以提高效率。 粗纯之后第二次纯 化用反相高效液相色谱可以在原有基础上增加上样量， 提高工作效率， 收率由75%提高至 80%以上。 附图说明 0014 图1为实例1一次纯化馏分高效液相色谱检测图。 0015 图2为实例1二次纯化馏分高效液相色谱检测图。 0016 图3为实例2一次纯化馏分高效液相色谱检测图。 0017 图4为实例2二次纯化馏。

11、分高效液相色谱检测图。 0018 图5为实例3一次纯化馏分高效液相色谱检测图。 0019 图6为实例3二次纯化馏分高效液相色谱检测图。 0020 图7为冻干后产品质谱图。 具体实施方式 0021 实施例1 1） 称量50g多肽产品溶于甲醇水溶液中， 超声溶解过滤后得到阿基瑞林待纯化样品； 2) 样品进行第一次纯化， 采用中压色谱。 其中以聚合物微球为固定相， 粒径为20 m； 流 动相A为体积百分比0.1%三氟乙酸水溶液， 流动相B为100%甲醇； 洗脱梯度为0-80min， 流动 相B： 5-30%， 收集馏分检测90%纯度以上备用； 高效液相色谱见图1； 3） 上述方法多次收集目标馏分进行。

12、第二次纯化， 采用反相高效液相色谱法。 其中以C18 键合硅胶为固定相， 粒径为8 m； 流动相A为体积百分比0.1%乙酸铵水溶液， 流动相B为100% 乙腈； 洗脱梯度为0-80min， 流动相B： 5-25%， 收集馏分检测合格合并待处理； 高效液相色谱 见图2； 4） 收集馏分用旋转蒸发仪在32-38下旋蒸， 冻干后得到合格得产品粉末， 收率为85%。 产品质谱见图7。 0022 实施例2 说明书 2/3 页 4 CN 111423490 A 4 1） 称量50g多肽产品溶于甲醇水溶液中， 超声溶解过滤后得到阿基瑞林待纯化样品； 2) 样品进行第一次纯化， 采用中压色谱。 其中以硅胶为固。

13、定相， 粒径为15 m； 流动相A 为体积百分比0.1%甲酸铵水溶液， 流动相B为100%乙腈； 洗脱梯度为0-80min， 流动相B： 5- 30%， 收集馏分检测90%纯度以上备用； 高效液相色谱见图3； 3） 上述方法多次收集目标馏分进行第二次纯化， 采用反相高效液相色谱法。 其中以C18 键合硅胶为固定相， 粒径为10 m； 流动相A为体积百分比0.1%乙酸铵水溶液， 流动相B为100% 乙醇； 洗脱梯度为0-80min， 流动相B： 5-25%， 收集馏分检测合格合并待处理； 高效液相色谱 见图4； 4） 收集馏分用旋转蒸发仪在32-38下旋蒸， 冻干后得到合格得产品粉末， 收率为8。

14、2%。 0023 实施例3 1） 称量50g多肽产品溶于甲醇水溶液中， 超声溶解过滤后得到阿基瑞林待纯化样品； 2) 样品进行第一次纯化， 采用中压色谱。 其中以多糖凝胶为固定相， 粒径为25 m； 流动 相A为体积百分比0.1%乙酸铵水溶液， 流动相B为100%乙醇； 洗脱梯度为0-80min， 流动相B： 5-30%， 收集馏分检测90%纯度以上备用； 高效液相色谱见图5； 3） 上述方法多次收集目标馏分进行第二次纯化， 采用反相高效液相色谱法。 其中以C18 键合硅胶为固定相， 粒径为7 m； 流动相A为体积百分比0.1%乙酸铵水溶液， 流动相B为100% 甲醇； 洗脱梯度为0-80min， 流动相B： 5-25%， 收集馏分检测合格合并待处理； 高效液相色谱 见图6； 4） 收集馏分用旋转蒸发仪在32-38下旋蒸， 冻干后得到合格得产品粉末， 收率为80%。 说明书 3/3 页 5 CN 111423490 A 5 图1 图2 说明书附图 1/4 页 6 CN 111423490 A 6 图3 图4 说明书附图 2/4 页 7 CN 111423490 A 7 图5 图6 说明书附图 3/4 页 8 CN 111423490 A 8 图7 说明书附图 4/4 页 9 CN 111423490 A 9 。