多肽及其制备方法和用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010286269.6 (22)申请日 2020.04.13 (71)申请人 滨州医学院 地址 264003 山东省烟台市莱山区观海路 346号 (72)发明人 王少平张加余代龙杨爱琳 姜珊董萍萍于盈盈 (74)专利代理机构 北京悦成知识产权代理事务 所(普通合伙) 11527 代理人 高艳丽 (51)Int.Cl. C07K 7/08(2006.01) A61K 38/10(2006.01) A61P 3/06(2006.01) A61P 9/10(2006.01) C1。

2、2P 21/06(2006.01) C07K 1/22(2006.01) C07K 1/20(2006.01) C07K 1/16(2006.01) (54)发明名称 多肽及其制备方法和用途 (57)摘要 本发明公开了一种多肽及其制备方法和用 途。 该多肽具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。 该多肽具有活血化瘀的功效。 本发明还公开了上 述多肽的制备方法， 该方法包括： (1)酶解； (2)吸 附层析； (3)分子筛层析等步骤。 该方法得到的产 物中多肽纯度高。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图4页 CN 111423494 A 2020.07.17 CN 111423494 。

3、A 1.一种多肽或其药学上可接受的盐， 其特征在于， 所述多肽具有SEQ ID NO:1所示的氨 基酸序列。 2.一种分离的核酸分子， 其特征在于， 所述的核酸分子编码如权利要求1所述的多肽。 3.一种药物组合物， 其特征在于， 包括有： (1)权利要求1所述的多肽或其药学上可接受的盐； 和 (2)药学上可接受的辅料。 4.根据权利要求1所述的多肽的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤： (1)将土鳖虫浆液在胃蛋白酶的作用下酶解， 得到第一酶解产物； 将第一酶解产物在胰 蛋白的作用下酶解， 得到第二酶解产物； (2)将第二酶解产物采用DA201-C树脂柱吸附层析， 吸附完毕后对DA201-C。

4、树脂柱进行 洗脱， 得到第一洗脱液； (3)将第一洗脱液采用葡聚糖凝胶G25柱分子筛层析， 然后对葡聚糖凝胶G25柱进行洗 脱， 得到第二洗脱液； 将第二洗脱液中的固体物质分离得到产物。 5.根据权利要求1所述的多肽的制备方法， 其特征在于， 包括如下步骤： (1)将土鳖虫浆液在胃蛋白酶的作用下酶解， 得到第一酶解产物； 将第一酶解产物在胰 蛋白的作用下酶解， 得到第二酶解产物； (2)将第二酶解产物采用DA201-C树脂柱吸附层析， 吸附完毕后对DA201-C树脂柱进行 洗脱， 得到第一洗脱液； (3)将第一洗脱液采用葡聚糖凝胶G25柱分子筛层析， 然后对葡聚糖凝胶G25柱进行洗 脱， 得到。

5、第二洗脱液； (4)将第二洗脱液经过反相高效液相色谱仪进行分离， 然后对色谱柱进行洗脱， 得到第 三洗脱液； 色谱柱为C18色谱柱， 流动相A为三氟乙酸水溶液， 流动相B为三氟乙酸水溶液和 乙腈； 将第三洗脱液中的固体物质分离得到产物。 6.根据权利要求45任一项所述的制备方法， 其特征在于： 步骤(2)中， DA201-C树脂与第二酶解产物的质量体积比为520:1g/ml， 采用乙醇对 DA201-C树脂柱进行洗脱； 步骤(3)中， 第一洗脱液分多次加入葡聚糖凝胶G25柱中， 葡聚糖凝胶G25柱中葡聚糖凝 胶G25的填充质量与每次加入葡聚糖凝胶G25柱的第一洗脱液的体积比为0.212kg/m。

6、l， 采 用去离子水对葡聚糖凝胶G25柱进行洗脱。 7.根据权利要求5所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(4)中色谱柱为Waters ZOBRX- 300SB C18色谱柱， 检测器为紫外检测器， 检测波长为200240nm和260300nm。 8.根据权利要求5所述的制备方法， 其特征在于， 产物中， 如权利要求1所述的多肽的含 量大于92wt。 9.根据权利要求1所述的多肽或药学上可接受的盐在制备用于活血化瘀的药物中的用 途。 10.根据权利要求1所述的多肽或药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防高血脂药 物中的用途。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111423494 A 2 多肽及其。

7、制备方法和用途 技术领域 0001 本发明涉及一种多肽及其制备方法和用途， 特别涉及一种从土鳖虫中提取的多肽 及其制备方法和用途。 背景技术 0002 土鳖虫为传统中药， 具有破血逐瘀， 续筋接骨之功效， 用于跌打损伤， 筋伤骨折， 血 瘀经闭， 产后瘀阻腹痛， 瘾瘕痞块。 现代研究得出土鳖虫具有治疗血脑血管疾病的作用， 例 如动脉粥样硬化、 高血脂、 脑血栓等。 传统中药通常采用原料药材粉水煎后直接服用或水提 后服用， 药材利用率较低， 副作用大。 0003 CN104055800A公开了一种土鳖虫蛋白酶酶解物， 该酶解产物通过以下方法制备得 到： (1)净选土鳖虫， 粉碎成细粉； (2)将。

8、土鳖虫细粉置于人工胃液中， 然后加入胃蛋白酶水 解， 得到胃蛋白酶酶解液， 离心； (3)取上清液， 干燥， 得到土鳖虫胃蛋白酶酶解物； (4)取残 渣转入人工肠液， 加入胰蛋白酶水解， 得到土鳖虫胰蛋白酶酶解物。 步骤(3)所得胃蛋白酶 酶解物与步骤(4)所得胰蛋白酶酶解物即为土鳖虫蛋白酶酶解物。 该蛋白酶解物虽然在一 定程度上提高了药材的利用率， 但其蛋白酶解物中的有效成分纯度仍不高。 0004 CN101647822A公开了一种土鳖虫的仿生酶解产物， 该产物通过如下方法制备得 到： 取土鳖虫， 加水匀浆， 调节pH至1.03.0， 加入胃蛋白酶于3545保温酶解0.54小 时， 再调节p。

9、H至7.58.5， 加入胰酶或胰蛋白酶于4050保温酶解28小时， 即得。 该方 法得到的酶解产物中有效成分的纯度不高。 发明内容 0005 有鉴于此， 本发明的一个目的在于提供一种多肽， 该多肽具有活血化瘀的功效。 0006 本发明的另一个目的在于提供一种编码上述多肽的核酸分子。 0007 本发明的再一个目的在于提供一种含有上述多肽的药物组合物。 0008 本发明的又一个目的在于提供上述多肽的制备方法， 该方法得到的产物纯度高。 0009 本发明的又一个目的在于提供上述多肽的用途。 0010 本发明一方面提供了一种多肽或其药学上可接受的盐， 所述多肽具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序。

10、列。 0011 本发明另一方面提供了一种分离的核酸分子， 该核酸分子编码上述的多肽。 0012 本发明的再一方面提供了一种药物组合物， 包括有： 0013 (1)上述多肽或其药学上可接受的盐； 和 0014 (2)药学上可接受的辅料。 0015 本发明又一方面提供了上述多肽的制备方法， 包括如下步骤： 0016 (1)将土鳖虫浆液在胃蛋白酶的作用下酶解， 得到第一酶解产物； 将第一酶解产物 在胰蛋白的作用下酶解， 得到第二酶解产物； 0017 (2)将第二酶解产物采用DA201-C树脂柱吸附层析， 吸附完毕后对DA201-C树脂柱 说明书 1/7 页 3 CN 111423494 A 3 进行。

11、洗脱， 得到第一洗脱液； 0018 (3)将第一洗脱液采用葡聚糖凝胶G25柱分子筛层析， 然后对葡聚糖凝胶G25柱进 行洗脱， 得到第二洗脱液； 将第二洗脱液中的固体物质分离得到产物。 0019 本发明的多肽的制备方法， 还可以为包括如下步骤： 0020 (1)将土鳖虫浆液在胃蛋白酶的作用下酶解， 得到第一酶解产物； 将第一酶解产物 在胰蛋白的作用下酶解， 得到第二酶解产物； 0021 (2)将第二酶解产物采用DA201-C树脂柱吸附层析， 吸附完毕后对DA201-C树脂柱 进行洗脱， 得到第一洗脱液； 0022 (3)将第一洗脱液采用葡聚糖凝胶G25柱分子筛层析， 然后对葡聚糖凝胶G25柱进。

12、 行洗脱， 得到第二洗脱液； 0023 (4)将第二洗脱液经过反相高效液相色谱仪进行分离， 然后对色谱柱进行洗脱， 得 到第三洗脱液； 色谱柱为C18色谱柱， 流动相A为三氟乙酸水溶液， 流动相B为三氟乙酸水溶 液和乙腈； 将第三洗脱液中的固体物质分离得到产物。 0024 根据本发明的制备方法， 优选地， 步骤(2)中， DA201-C树脂与第二酶解产物的质量 体积比为520:1g/ml， 采用乙醇对DA201-C树脂柱进行洗脱； 步骤(3)中， 第一洗脱液分多 次加入葡聚糖凝胶G25柱中， 葡聚糖凝胶G25柱中葡聚糖凝胶G25的填充质量与每次加入葡 聚糖凝胶G25柱的第一洗脱液的体积比为0.。

13、212kg/ml， 采用去离子水对葡聚糖凝胶G25柱 进行洗脱。 0025 根据本发明的制备方法， 优选地， 步骤(4)中色谱柱为Waters ZOBRX-300SB C18色 谱柱， 检测器为紫外检测器， 检测波长为200240nm和260300nm。 0026 根据本发明的制备方法， 优选地， 产物中， 上述多肽的含量大于92wt。 0027 本发明的又一方面提供了上述多肽或其药学上可接受的盐在制备用于活血化瘀 的药物中的用途。 0028 本发明还提供了上述多肽或其药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防高血脂 药物中的用途。 0029 本发明提供了一种具有活血化瘀作用的多肽， 其安全有效， 。

14、副作用小。 本发明还提 供了上述多肽的制备方法， 该方法制得的产物中活性多肽纯度高。 附图说明 0030 图1为检测波长为220nm的层析结果图。 0031 图2为反相高效液相色谱仪半制备分离结果图。 0032 图3为液相一级质谱图。 0033 图4为基质辅助激光解吸电离-液相二级质谱图。 0034 图5为血小板计数图。 0035 图6为血粘度图。 0036 图7为血红蛋白和血细胞压积图。 具体实施方式 0037 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明， 但本发明的保护范围并不限于 说明书 2/7 页 4 CN 111423494 A 4 此。 0038 本发明人通过对土鳖虫药用机理的长期研。

15、究， 确定土鳖虫中具有活血化瘀作用的 多肽结构， 并通过合适的方法高纯度地将该活性物质从土鳖中原料药中分离出来。 0039 0040 本发明的多肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其变异形式。 所述的变异形 式包括但不限于15个氨基酸的缺失、 插入和/或取代； 优选为13个氨基酸的缺失、 插入 和/或取代； 更优选为12个氨基酸的缺失、 插入和/或取代。 根据本发明的一个实施方式， 本发明的多肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。 0041 本发明的多肽的分子质量可以为13001600Da； 优选为14001500Da； 更优选为 1431Da。 0042 本发明的多肽还可以。

16、以药学上可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。 这些盐包括但 不限于与如下酸形成的盐： 氢氯酸、 氢溴酸、 硫酸、 柠檬酸、 酒石酸、 磷酸、 乳酸、 丙酮酸、 乙 酸、 琥珀酸、 草酸、 富马酸、 马来酸、 草酰乙酸、 甲磺酸、 乙磺酸、 苯磺酸或羟乙磺酸； 与如下碱 金属或碱土金属形成的盐： 钠、 钾、 钙或镁。 0043 0044 本发明提供一种核酸分子， 该核酸分子能够编码具有如SEQ ID NO:1所示的氨基 酸序列。 0045 本发明的药物组合物包括有： (1)本发明的多肽或其药学上可接受的盐； 和(2)药 学上可接受的辅料。 本发明多肽的用量通常为0.00110克/剂； 优选为0.01。

17、1克/剂； 更优 选为0.050.5克/剂。 0046 药学上可接受的辅料其本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体， 且给 药后没有过分的毒性。 本领域技术人员熟知这些辅料， 例如溶剂、 pH调节剂、 表面活性剂、 助 悬剂、 防腐剂、 抗氧化剂、 等渗调节剂、 局部止痛剂、 崩解剂、 粘合剂、 润滑剂、 稀释剂等。 溶剂 的实例包括但不限于水、 盐水、 葡萄糖、 甘油、 乙醇或其组合。 pH调节剂的实例包括但不限于 盐酸、 氢氧化钠、 碳酸氢钠、 枸橼酸缓冲液、 酒石酸缓冲液、 盐酸缓冲液或其组合。 表面活性 剂的实例包括但不限于吐温-80、 聚氧乙烯蓖麻油、 泊洛沙姆188、 卵磷脂。

18、或其组合。 助悬剂 的实例包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、 明胶、 甲基纤维素、 羟甲基纤维素钠或其组合。 防腐 剂的实例包括但不限于苯酚、 三氯叔丁醇、 硫柳汞、 甲酚、 苯甲醇或其组合。 抗氧化剂的实例 包括但不限于亚硫酸钠、 亚硫酸氢钠、 焦亚硫酸钠、 硫代硫酸钠或其组合。 等渗调节剂的实 例包括但不限于氯化钠、 葡萄糖或其组合。 局部止痛剂的实例包括但不限于苯甲醇、 三氯叔 丁醇、 盐酸普鲁卡因、 利多卡因或其组合。 崩解剂的实例包括但不限交联羧甲基纤维素钠、 交联聚维酮、 淀粉、 羧甲基淀粉钠、 羟丙基淀粉、 低取代羟丙基纤维素或其组合。 粘合剂的实 例包括但不限于淀粉浆、 聚维酮、 聚。

19、乙二醇、 羧甲基纤维素钠或其组合。 润滑剂的实例包括 但不限于硬脂酸镁、 聚乙二醇、 月桂醇硫酸镁、 微粉硅胶、 滑石粉或其组合。 稀释剂的实例包 括但不限于淀粉、 可压性淀粉、 糊精、 乳糖、 甘露醇、 微晶纤维素或其组合。 0047 本发明的药物组合物被用于实际治疗时， 可根据使用情况而采用各种不同剂型的 药物组合物。 优选地， 可以为注射剂、 粉针剂。 0048 根据本发明的一个实施方式， 药物组合物为注射剂， 包括本发明的多肽、 溶剂和防 腐剂。 多肽的用量为1.05.0wt； 优选为2.04.0wt； 更优选为3.0wt。 溶剂的用量为 说明书 3/7 页 5 CN 11142349。

20、4 A 5 4099wt； 优选为5099wt； 更优选为6099wt。 防腐剂的用量为0.011.20wt； 优选为0.401.0wt； 更优选为0.5wt。 溶剂可以选自水、 盐水、 葡萄糖、 甘油、 乙醇或其 组合； 优选为水。 防腐剂可以选自苯酚、 三氯叔丁醇、 硫柳汞、 甲酚、 苯甲醇或其组合； 优选为 三氯叔丁醇。 0049 根据本发明的另一个实施方式， 药物组合物为粉针剂， 将本发明的多肽采用冷冻 干燥机冻干即得。 0050 0051 本发明的多肽的制备方法包括如下步骤： (1)酶解； (2)吸附层析； (3)分子筛层析； 和任选地(4)反相高效液相色谱仪分离。 0052 酶解 。

21、0053 将土鳖虫浆液在胃蛋白酶的作用下酶解， 得到第一酶解产物； 将第一酶解产物在 胰蛋白的作用下酶解， 得到第二酶解产物。 0054 本发明的土鳖中优选为中华冀土鳖虫。 土鳖虫浆液中土鳖虫的含量可以为0.01 1kg/L； 优选为0.050.5kg/L； 更优选为0.070.3kg/L。 根据本发明的一个实施方式， 土鳖 虫浆液采用如下方法制得： 土鳖虫粉碎后与水混合制得均浆， 将均浆在80130下灭菌10 40min得到。 0055 胃蛋白酶的用量为土鳖虫重量的0.53wt； 优选为0.52.5wt； 更优选为0.5 2wt。 胃蛋白酶酶解的温度可以为3050； 优选为3545； 更优选。

22、为3842。 胃蛋 白酶酶解的pH可以为13； 优选为1.52.5； 更优选为3。 胃蛋白酶酶解的时间可以为40 90min； 优选为5080min； 更优选为5070min。 pH值可以采用盐酸溶液进行调整。 盐酸溶液 的浓度可以为0.011mol/L； 优选为0.050.5mol/L。 0056 胰蛋白酶的用量为土鳖虫重量的0.53wt； 优选为0.52.5wt； 更优选为0.5 2wt。 胰蛋白酶酶解的温度可以为3050； 优选为3545； 更优选为3842。 胰蛋 白酶酶解的pH可以为810； 优选为8.59.5； 更优选为9。 胰蛋白酶酶解的时间可以为150 240min； 优选为1。

23、50200min； 更优选为160190min。 pH值可以采用氢氧化钠溶液进行调 整。 氢氧化钠溶液的浓度可以为15wt； 优选为13wt。 0057 在胰蛋白的作用下酶解后的产物可以进行浓缩， 以使第二酶解产物中具有适当浓 度的固体物质， 这些固体物质中含有经过胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解后的多肽。 第二酶解产 物中固体物质的浓度可以为2080mg/ml； 优选为3070mg/ml； 更优选为4060mg/ml。 这 样有利于后续的分离。 0058 胃蛋白酶酶解和胰蛋白酶酶解可以在恒温酶解仪中进行。 0059 吸附层析 0060 将第二酶解产物采用DA201-C树脂柱吸附层析， 吸附完毕后对DA。

24、201-C树脂柱进行 洗脱， 得到第一洗脱液。 0061 DA201-C树脂与第二酶解产物的质量体积比为520:1g/ml； 优选为615:1g/ml； 更优选为812:1g/ml。 0062 在本发明中可以采用乙醇溶液对DA201-C树脂柱进行洗脱。 乙醇溶液的浓度可以 为3080vol； 优选为3070vol； 更优选为4060vol。 0063 分子筛层析 说明书 4/7 页 6 CN 111423494 A 6 0064 将第一洗脱液采用葡聚糖凝胶G25柱分子筛层析， 然后对葡聚糖凝胶G25柱进行洗 脱， 得到第二洗脱液。 在某些方式中， 将第二洗脱液中的固体物质分离得到产物。 在另一。

25、些 实施方式中， 还需要将第二洗脱液经过反相高效液相色谱仪分离。 0065 在本发明中， 第一洗脱液可以分多次加入葡聚糖凝胶G25柱中， 葡聚糖凝胶G25柱 中葡聚糖凝胶G25的填充质量与每次加入葡聚糖凝胶G25柱的第一洗脱液的体积比为0.2 12kg/ml； 优选为110kg/ml； 更优选为14kg/ml。 在本发明中可以采用去离子水对葡聚糖 凝胶G25柱进行洗脱。 0066 葡聚糖凝胶G25柱可以采用如下方法制得： 将葡聚糖凝胶G25依次用无水乙醇和去 离子水洗涤完毕后装入柱内， 得到葡聚糖凝胶G25柱。 0067 反相高效液相色谱仪分离 0068 将第二洗脱液经过反相高效液相色谱仪(R。

26、P-HPLC)进行分离， 对色谱柱进行洗脱， 得到第三洗脱液。 将第三洗脱液中的固体物质分离得到产物。 0069 色谱柱为C18色谱柱。 色谱柱长度可以为120200mm， 内径可以为35.5mm。 优选 地， 色谱柱的长度为130170mm， 内径为45mm。 根据本发明的一个实施方式， 色谱柱为 Waters ZOBRX-300SB C18色谱柱。 0070 流动相A可以为三氟乙酸水溶液， 流动相B可以为三氟乙酸水溶液和乙腈。 优选地， 三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的体积含量为0.1vol。 0071 检测器为紫外检测器， 检测波长为200240nm和260300nm。 优选地， 检测波长为 。

27、210230nm和270290nm。 。 更优选地， 检测波长为220nm和280nm。 0072 本发明的制备方法所得产物中， 具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽的含 量大于92wt； 优选为大于93wt； 更优选地大于95wt。 0073 0074 本发明的多肽具有活血化瘀的功效， 因此本发明的多肽可以用于制备具有活血化 瘀功效的药物。 本发明的多肽还可以用于制备预防或治疗高血脂的药物。 0075 实验例1 0076 (1)取中华冀土鳖虫鲜品1kg， 采用高压剪切机进行粉粹， 再加10L去离子水充分混 合， 得到均浆。 将均浆在100灭菌15min， 得到土鳖虫浆液。 将土鳖。

28、虫浆液降温至40， 并采 用0.1mol/L HCl调节pH至2.0， 然后向土鳖虫浆液中加入10g胃蛋白酶， 在恒温酶解仪上酶 解60min， 得到第一酶解产物。 向第一酶解产物中加入浓度为2wt的氢氧化钠溶液调节第 一酶解产物的pH至9.0， 调节第一酶解产物的温度为40， 然后向第一酶解产物中加入10g 胰蛋白酶， 在恒温酶解仪上酶解180min， 然后过滤， 收集滤液， 将滤液浓缩至固体物质浓度 为50mg/ml， 得到第二酶解产物。 0077 (2)将第二酶解产物加入DA201-C树脂柱内， DA201-C树脂的重量与第二酶解产物 的体积比例为10:1g/ml， 吸附完毕后采用50v。

29、ol乙醇对DA201-C树脂柱进行洗脱， 得到第 一洗脱液。 0078 (3)采用葡聚糖凝胶G25柱对第一洗脱液进行分子筛层析， 葡聚糖凝胶G25柱中葡 聚糖凝胶G25的填充量为1000g， 第一洗脱液分多次加入葡聚糖凝胶G25柱中， 每次加入量为 0.5ml， 吸附完毕后用去离子水对葡聚糖凝胶G25柱进行洗脱， 得到第二洗脱液； 将第二洗脱 液中的固体物质分离得到产物。 产物中具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽的含量 说明书 5/7 页 7 CN 111423494 A 7 为69.23wt。 0079 实施例1 0080 (1)取中华冀土鳖虫鲜品1kg， 采用高压剪切机进行粉。

30、粹， 再加10L去离子水充分混 合， 得到均浆。 将均浆在100灭菌15min， 得到土鳖虫浆液。 将土鳖虫浆液降温至40， 并采 用0.1mol/L HCl调节pH至2.0， 然后向土鳖虫浆液中加入10g胃蛋白酶， 在恒温酶解仪上酶 解60min， 得到第一酶解产物。 向第一酶解产物中加入浓度为2wt的氢氧化钠溶液调节第 一酶解产物的pH至9.0， 调节第一酶解产物的温度为40， 然后向第一酶解产物中加入10g 胰蛋白酶， 在恒温酶解仪上酶解180min， 然后过滤， 收集滤液， 将滤液浓缩至固体物质浓度 为50mg/ml， 得到第二酶解产物。 0081 (2)将第二酶解产物加入DA201-。

31、C树脂柱内， DA201-C树脂的重量与第二酶解产物 的体积比例为10:1g/ml， 吸附完毕后采用50vol乙醇对DA201-C树脂柱进行洗脱， 得到第 一洗脱液。 0082 (3)采用葡聚糖凝胶G25柱对第一洗脱液进行分子筛层析， 葡聚糖凝胶G25柱中葡 聚糖凝胶G25的填充量为1000g， 第一洗脱液分多次加入葡聚糖凝胶G25柱中， 每次加入量为 0.5ml， 吸附完毕后用去离子水对葡聚糖凝胶G25柱进行洗脱， 得到第二洗脱液。 检测波长为 220nm的层析结果图如图1所示。 0083 (4)将第二洗脱液经过反相高效液相色谱仪进行分离， 色谱柱为waters ZOBRX- 300SB C。

32、18色谱柱(色谱柱长度为150mm， 内径为4.6mm)， 流动相A为0.1vol三氟乙酸水溶 液， 流动相B为0.1vol三氟乙酸水溶液和乙腈， 检测器为紫外检测器， 检测波长为220nm和 280nm。 对waters ZOBRX-300SB C18色谱柱进行洗脱， 得到第三洗脱液。 将第三洗脱液中的 固体物质分离得到产物。 产物中具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽的含量为 95.8wt。 反相高效液相色谱仪半制备分离结果图如图2所示。 0084 实施例2 0085 (1)除步骤(1)中华冀土鳖虫鲜品的用量为500g， 去离子水的用量为5L， 胃蛋白酶 的用量为5g， 胰蛋白。

33、酶的用量为5g外， 其余同实施例2。 产物中具有SEQ ID NO:1所示的氨基 酸序列的多肽的含量为95.8wt。 0086 实施例3 0087 将3wt实施例1制得的产物， 0.5wt三氯叔丁醇和96.5wt无菌用水混合得到 注射剂。 0088 实施例4 0089 将实施例2制得的产物采用冷冻干燥机制得冻干粉， 每0.1g进行分装制得粉针剂。 0090 实验例2 0091 采用液相色谱-飞行时间-质谱联用(LC-TOF-MS)仪进行多肽结构分析。 液相色谱- 飞行时间-质谱联用(LC-TOF-MS)仪采用正离子线性模式与数据自动采集系统分析。 以 0.1vol的三氟乙酸的水、 乙腈(水和乙。

34、腈的体积比为5:5)溶液作为溶剂。 分别将图2中所 示的F2、 F3样品溶解于溶剂中。 将空白溶剂1 l点样在MALDI靶板上， 待干燥后将样品板放入 质谱仪进行分析， 去掉干扰后再分别点样F2、 F3样品， 待干燥后送入质谱仪分析， 连续分析 10次， 累加信号作为一级图谱。 工作条件如下： smartbeam-II激光器： 波长330nm； 加速电压： 30kV； 工作时间： 0.5min。 说明书 6/7 页 8 CN 111423494 A 8 0092 进行完一级质谱分离后， 选择具有最高信号的肽段离子进入再一次分析， 采用仪 器自带软件De NOVO explorer分析二级质谱，。

35、 并标出主要的a、 b、 y、 z等系列离子(由母核裂 解产生)， 进行氨基酸序列的计算。 液相一级质谱图如图3所示。 基质辅助激光解吸电离-液 相二级质谱图如图4所示。 证明实施例1确实分离得到了具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序 列的多肽。 0093 实验例3 0094 SD大鼠90只， 雄性， 适应性饲养7天， 然后分为六组， 即空白组， 模型组、 血栓通胶囊 组、 土鳖虫药材组、 多肽高剂量组、 多肽低剂量组。 除空白组以外， 其他组每只老鼠每天定量 给予50g高脂饲料， 同时除空白组大鼠， 每天上午9:00给予每只大鼠高脂乳剂4.0mL， 高脂乳 剂饲养方式： 灌胃口服， 空白。

36、组大鼠持续给予普通饲料， 连续45天， 给予高脂饲料、 高脂乳剂 15天后， 除空白组大鼠外， 第16天开始每天下午2点给予每只老鼠0.2mL盐酸肾上腺素注射 液(除空白组外)， 给药方式： 肌内注射， 注射后30min除空白组外， 其他各组进行大鼠冷水 浴， 温度： 4， 冷水浴15min， 持续30天， 即可造成 “血瘀证” 模型。 0095 空白组： 给予等体积去离子水。 0096 模型组： 给予等体积生理盐水。 0097 血栓通胶囊组： 将血栓通胶囊内的药物粉末采用生理盐水进行溶解， 剂量为0.1g/ kg， 口服给药。 0098 土鳖虫药材组： 将土鳖虫粉末采用生理盐水混匀， 口服给。

37、药， 剂量为3.0g/kg。 0099 多肽高剂量组： 多肽采用生理盐水进行溶液， 口服给药， 给药剂量50mg/kg。 0100 多肽低剂量组： 多肽采用生理盐水进行溶液， 口服给药， 给药剂量： 12.5mg/kg。 0101 采用上述方式连续给药16天， 于第16天末次给药后皮下注射5.0戊巴本妥钠溶 液进行麻醉， 待大鼠被完全麻醉后， 在腹主动脉取血3.0mL， 注入肝素钠抗凝剂润洗后的玻 璃硅化管内。 采用全血液自动分析仪， 血流变分析仪对各个组别大鼠进行血常规、 血流变指 标测定， 所得结果如图57所示(与空白组相比， +P0.01,+P0.05， *P0.01,*P0.05)。 。

38、0102 根据结果发现， 血细胞、 血流变两项指标结果得出： 在全血分析中发现， 经过造模 后发现与空白组进行比较得出， 模型组大鼠中红细胞压积、 血小板计数、 血粘度增加， 说明 经过造模过程， 大鼠血液性质发生变化， 血液具有发生血栓的危险潜在性。 多肽高剂量组、 多肽低剂量组与模型组进行比较得出多肽可以明显改善由于高脂饮食和冰水刺激导致的 大鼠血小板升高现象， 并且与模型组相比， 具有显著性差异。 说明多肽确实具有活血化瘀功 效。 0103 本发明并不限于上述实施方式， 在不背离本发明的实质内容的情况下， 本领域技 术人员可以想到的任何变形、 改进、 替换均落入本发明的范围。 说明书 7。

39、/7 页 9 CN 111423494 A 9 序列表 多肽及其制备方法和用途 1 SIPOSequenceListing 1.0 1 17 PRT 土鳖虫(Steleophaga plancyi Boleny) 1 Asp Ala Val Pro Gly Ala Gly Pro Ala Gly Cys His Pro Gly Ala Gly 1 5 10 15 Pro 序列表 1/1 页 10 CN 111423494 A 10 图1 图2 说明书附图 1/4 页 11 CN 111423494 A 11 图3 图4 说明书附图 2/4 页 12 CN 111423494 A 12 图5 图6 说明书附图 3/4 页 13 CN 111423494 A 13 图7 说明书附图 4/4 页 14 CN 111423494 A 14 。