用于预测原发性乳腺癌发生风险的DNA甲基化标记物及其筛选方法和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010181207.9 (22)申请日 2020.03.16 (71)申请人 武汉百药联科科技有限公司 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山1 号华中农业大学 申请人 华中农业大学 (72)发明人 张红雨全源佟馨宇李姜 黄清 (74)专利代理机构 广州三环专利商标代理有限 公司 44202 代理人 颜希文 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G16B 20/20(2019.01) G16B 40/。

2、20(2019.01) (54)发明名称 一种用于预测原发性乳腺癌发生风险的DNA 甲基化标记物及其筛选方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于预测原发性乳腺癌 发生风险的DNA甲基化标记物及其筛选方法和应 用。 所述方法包括以下步骤： (1)对样本数据进行 甲基化分析， 获得与预测原发性乳腺癌发生风险 相关的甲基化位点； (2)获得针对所述甲基化位 点的甲基化Beta值； (3)基于所述甲基化位点的 甲基化Beta值构建原发性乳腺癌发生风险预测 模型， 并通过计算比值比验证该模型的可行性； (4)采用机器学习方法构建基于所述甲基化位点 的原发性乳腺癌发生风险预测模型， 计算比值 比、 。

3、AUC、 召回率、 精确率和F1值， 与步骤(3)的预 测模型进行相互验证； (5)所述预测模型中甲基 化探针对应的甲基化位点即为DNA甲基化标记 物。 本发明可提高原发性乳腺癌的检出率， 适于 大规模推广应用。 权利要求书2页 说明书9页 CN 111440869 A 2020.07.24 CN 111440869 A 1.一种用于预测原发性乳腺癌发生风险的DNA甲基化标记物的筛选方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)对样本数据进行甲基化分析， 获得与预测原发性乳腺癌发生风险相关的甲基化位 点； (2)获得针对所述甲基化位点的甲基化Beta值； (3)基于所述甲基化位点的甲基化Beta。

4、值构建原发性乳腺癌发生风险预测模型， 并通 过计算比值比验证该模型的可行性； (4)采用机器学习方法构建基于所述甲基化位点的原发性乳腺癌发生风险预测模型， 计算比值比、 AUC、 召回率、 精确率和F1值， 与步骤(3)的预测模型进行相互验证； (5)所述步骤(3)和步骤(4)的预测模型中甲基化探针对应的甲基化位点即为DNA甲基 化标记物。 2.根据权利要求1所述的DNA甲基化标记物的筛选方法， 其特征在于， 与预测原发性乳 腺癌发生风险相关的甲基化位点及其对应的甲基化探针如下表所示： 3.根据权利要求1所述的DNA甲基化标记物的筛选方法， 其特征在于， 所述步骤(4)中， 权利要求书 1/2。

5、 页 2 CN 111440869 A 2 使用随机森林方法， 使用R语言平台及R studio工具进行数据分析， 结合交叉验证， 以混淆 矩阵作为可视化工具， 根据样本甲基化数据构建预测模型， 与基于所述甲基化位点的甲基 化Beta值构建原发性乳腺癌发生风险预测模型进行相互验证。 4.用于预测原发性乳腺癌发生风险的DNA甲基化标记物， 其特征在于， 选自以下CpG位 点中的至少一个： 10:12277929、 10:12277911、 10:12256556、 10:12278542、 10:12278166、 10:12277918、 10:12276839、 10:12277559、 1。

6、0:12249674、 10:12251484、 10:12278347、 10: 12277764、 10:12268313、 10:12275299、 10:12277961、 10:12277807、 10:12278371、 10: 12278305和10:12261333。 5.权利要求4所述的DNA甲基化标记物在制备预测或辅助预测原发性乳腺癌发生风险 的试剂盒中的应用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111440869 A 3 一种用于预测原发性乳腺癌发生风险的DNA甲基化标记物及 其筛选方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种用于预测原发性乳腺癌。

7、发生风险的DNA 甲基化标记物及其筛选方法和应用。 背景技术 0002 乳腺癌位居全球女性恶性肿瘤发病率首位， 是全世界女性最常见的恶性肿瘤之 一。 根据2012年数据， 乳腺癌发病共1,700,000例， 死亡超过500,000例。 在中国， 每年约268, 000名女性诊断为乳腺癌， 其中约70,000例患者死于乳腺癌， 约占全部女性新诊断恶性肿瘤 的15和女性癌症相关死亡人数的7(Torre L A,Bray F,Siegel R L,et al.Global cancer statistics,2012J.CA:a cancer journal for clinicians,2015,。

8、65(2):87- 108； J.A,Merino,Bonilla,et al.Breast cancer in the 21st century:From early detection to new therapiesJ.Radiologa(English Edition),2017.)。 乳腺癌没有真 正的低风险人群， 是典型的全球性癌症(Boyle P,Howell A.The globalisation of breast cancerJ.Breast Cancer Research,2010,12(4Supplement).)。 早期与中期乳腺 癌患者以手术治疗为主， 药物治疗和放。

9、射治疗为辅。 晚期或转移的乳腺癌患者， 大多以药物 治疗为主(Arsenault J,Parpia S,Reiter H,et al.Acute toxicity and quality of life of hypofractionated radiation therapy for breast cancerJ.International Journal of Radiation OncologyBiologyPhysics,2015,93(3):S59.)。 随着环境污染 和人口老龄化等因素影响， 乳腺癌发病率呈逐年升高的趋势， 是发病率最高的女性恶性肿 瘤。 因此早期发现并及时治疗对于。

10、防治原发性乳腺癌非常重要。 0003 肿瘤生物标记物是能够作为肿瘤征兆或判断肿瘤治疗应答的生物分子， 根据现有 治疗方案， 我们可以使用肿瘤生物标记物实现帮助诊断肿瘤、 确定治疗方案的选择并预测 治疗疗效(Califf R M .Biomarker definitions and their applicationsJ .Experimental Biology and Medicine,2018,243(3):213-221； Aronson J K,Ferner R E.Biomarkersa general reviewJ.Current protocols in pharmacolog。

11、y,2017,76 (1):9.23.1-9.23.17.)。 然而， 现有的肿瘤免疫治疗方法都存在一定程度的缺陷， 例如过程 耗时较长， 花费巨大等。 肿瘤生物标记物的作用贯串整个肿瘤诊疗过程， 从肿瘤风险预测、 诊断到治疗方案选择和疗效预测(Kim S H,Hoffmann U,Borggrefe M,et al.Advantages and limitations of current biomarker research:from experimental research to clinical applicationJ.Current pharmaceutical biotechn。

12、ology,2017,18(6):445- 455.)。 肿瘤生物标记物的发现和应用， 使得靶向治疗和免疫治疗成为可能并有效改善现有 的疗效方法(Lu M,Zhang J,Zhang L.Emerging concepts and methodologies in cancer biomarker discoveryJ.Critical ReviewsTMin Oncogenesis,2017,22(5-6).)。 因此， 找 到准确的生物标记物是肿瘤免疫治疗方法以及肿瘤风险预测中至关重要的一步。 0004 DNA甲基化(DNA methylation)是指DNA序列上特定序列(连续的胞嘧啶和。

13、鸟嘌呤) 说明书 1/9 页 4 CN 111440869 A 4 上的胞嘧啶有可能被甲基化。 甲基化程度的变化会通过改变染色质结构及稳定性、 改变转 录因子结合活性等方式改变基因的表达情况(Bouyer D,Kramdi A,Kassam M,et al.DNA methylation dynamics during early plant lifeJ.Genome biology,2017,18(1): 179.)。 一般来说， 低甲基化有利于基因的表达， 高甲基化会抑制基因的表达。 DNA甲基化异 常是肿瘤发生发展过程中的标志性事件之一， 异常的甲基化会导致一些基因的功能异常 (Pan 。

14、Y,Liu G,Zhou F,et al.DNA methylation profiles in cancer diagnosis and therapeuticsJ.Clinical and experimental medicine,2018,18(1):1-14.)。 目前有研 究证实DNA甲基化的状态与原发性乳腺癌的发生具有高度的相关性(Boyne D J ,O Sullivan D E,Olij B F,et al.Physical Activity,Global DNA Methylation,and Breast Cancer Risk:A Systematic Literatu。

15、re Review and Meta-analysisJ.Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers,2018,27(11):1320-1331.)。 研究显示， 到目 前为止， 已发现355个乳腺癌相关的标记物和276个与乳腺癌风险相关的CpG位点。 通过33个 研究对于标记物的评估， 发现大多数单个标记物的诊断价值相对中等， 14种标记物与乳腺 癌有相对较强的关联性(OR0.5或OR2)， 但大多数并未得到独立验证， 只有2个标记物 (HYAL2和S100P)被独立验证。 检测到的甲基化标记物不足以早期检测乳腺癌， 但是标记物 或标记物组合可。

16、能对乳腺癌风险分层有用。 利用甲基化定量的高通量方法， 未来的研究应 侧重于进一步挖掘信息性甲基化标记物(Guan Z,Yu H,Cuk K,et al.Whole-blood DNA methylation markers in early detection of breast cancer:a systematic literature reviewJ.Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers,2019,28 (3):496-505； Tang Q,Cheng J,Cao X,et al.Blood-based DNA methylati。

17、on as biomarker for breast cancer:a systematic reviewJ.Clinical epigenetics,2016, 8(1):115.)。 因此， 我们可通过DNA甲基化来预测肿瘤发生风险， 以及治疗措施对肿瘤的疗 效等； 通过对DNA甲基化数据分析， 发现与肿瘤风险预测相关的新的生物标记物。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种用于预测原发性乳腺癌 发生风险的DNA甲基化标记物及其筛选方法和应用。 0006 为实现上述目的， 本发明采取的技术方案如下： 0007 一种用于预测原发性乳腺癌发生风险的DNA甲基化标记。

18、物的筛选方法， 包括以下 步骤： 0008 (1)对样本数据进行甲基化分析， 获得与预测原发性乳腺癌发生风险相关的甲基 化位点； 0009 (2)获得针对所述甲基化位点的甲基化Beta值； 0010 (3)基于所述甲基化位点的甲基化Beta值构建原发性乳腺癌发生风险预测模型， 并通过计算比值比验证该模型的可行性； 0011 (4)采用机器学习方法构建基于所述甲基化位点的原发性乳腺癌发生风险预测模 型， 计算比值比、 AUC、 召回率、 精确率和F1值， 与步骤(3)的预测模型进行相互验证； 0012 (5)所述步骤(3)和步骤(4)的预测模型中甲基化探针对应的甲基化位点即为DNA 甲基化标记物。

19、。 说明书 2/9 页 5 CN 111440869 A 5 0013 本申请发明人通过下载并整合GEO数据库中原发性乳腺癌患者235例及非原发性 乳腺癌血液样本2484例的DNA甲基化数据， 并对所得到的DNA甲基化数据进行分析， 均一化 数据， 发现了用于预测原发性乳腺癌发生风险的DNA甲基化生物标记物， 获得与乳腺癌发病 相关的甲基化位点以及针对所述甲基化位点的甲基化Beta值； 并以甲基化位点构建了两种 原发性乳腺癌发生风险预测模型， 使用机器学习方法(随机森林、 交叉验证、 混淆矩阵)进行 验证。 0014 进一步地， 与预测原发性乳腺癌发生风险相关的甲基化位点及其对应的甲基化探 针。

20、如下表所示： 0015 0016 ， 本发明以上述甲基化位点构建原发性乳腺癌发生风险预测模型。 0017 进一步地， 所述步骤(4)中， 使用随机森林方法， 使用R语言平台及R studio工具进 行数据分析， 结合交叉验证， 以混淆矩阵作为可视化工具， 根据样本甲基化数据构建预测模 型， 与基于所述甲基化位点的甲基化Beta值构建原发性乳腺癌发生风险预测模型进行相互 验证。 0018 本发明还提供了用于预测原发性乳腺癌发生风险的DNA甲基化标记物， 选自以下 CpG位点(基于Chromosome_36/Coordinate_36版本位点在基因组的坐标)中的至少一个： 说明书 3/9 页 6 。

21、CN 111440869 A 6 10:12277929、 10:12277911、 10:12256556、 10:12278542、 10:12278166、 10:12277918、 10: 12276839、 10:12277559、 10:12249674、 10:12251484、 10:12278347、 10:12277764、 10: 12268313、 10:12275299、 10:12277961、 10:12277807、 10:12278371、 10:12278305和10: 12261333。 本发明利用上述与乳腺癌相关基因的甲基化标记物， 可检测原发性乳腺癌相。

22、关 DNA甲基化程度， 进一步还可以将这19个甲基化标记物联合起来检测多个原发性乳腺癌相 关DNA甲基化程度， 可以明显提高原发性乳腺癌的检出率， 适于大规模推广应用。 0019 本发明还提供了上述的DNA甲基化标记物在制备预测或辅助预测原发性乳腺癌发 生风险的试剂盒中的应用。 0020 以上述CpG位点作为生物标记物， 开发可以检测该19个位点的试剂盒对该19个位 点的基因进行检测与评估可以预测或辅助预测原发性乳腺癌发生风险， 该试剂盒可应用于 预判患者是否会发生原发性乳腺癌， 具有广泛的应用前景。 0021 与现有技术相比， 本发明的有益效果为： 0022 本发明筛选得到的原发性乳腺癌相关。

23、基因甲基化标记物， 可判断多个原发性乳腺 癌相关DNA甲基化程度， 筛选更易患原发性乳腺癌的个体， 提高原发性乳腺癌的检出率， 筛 选更易患原发性乳腺癌的个体， 节约成本， 适于推广应用， 具有较好的应用前景。 具体实施方式 0023 为更好地说明本发明的目的、 技术方案和优点， 下面将结合具体实施例对本发明 进一步说明。 本领域技术人员应当理解， 此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明， 并不 用于限定本发明。 0024 本申请发明人通过分析乳腺癌患者的 DNA甲基化数据 (源自https:/ www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/,NCBI的GEO DataSets数据库中的G。

24、SE51032、 GSE111629、 GSE85210、 GSE53045、 GSE50660和GSE115278数据集)， 共收集了2719个样本， 其中乳腺癌患 者235个， 正常血液样本2484个； 应用标准的Illumina Human 450k DNA methylation Chip 数据输出文件， 使用R语言平台(v3.6.0)及R studio工具(v3.6.0)进行数据分析， 所用工具 包为minfi(v1.32.0)； 通过对样本数据进行甲基化分析， 获得19个P值显著(P-value 0.05)、 可能与乳腺癌发病相关的甲基化位点(见表1)， 并计算出所述甲基化位点的甲。

25、基化 Beta值来确定DNA甲基化水平， Beta值来自甲基化珠粒类型的强度值/(来自甲基化的强 度值+来自未甲基化珠粒类型的强度值+100)。 上述位点即为用于预测原发性乳腺癌发生风 险的DNA甲基化标记物； 通过检测样本中所述甲基化位点的甲基化Beta值， 来预测样本未来 患原发性乳腺癌风险， Beta值越高， 则患原发性乳腺癌风险越大。 0025 表1与原发性乳腺癌风险预测显著相关的位点 0026 说明书 4/9 页 7 CN 111440869 A 7 0027 0028 以上述甲基化位点的甲基化Beta值构建预测模型， 通过计算Odds ratio值(比值 比)验证该模型的可行性， 。

26、Odds ratio值计算公式为： 0029 0030 其中， a为预测为原发性乳腺癌患者且实际也为原发性乳腺癌患者样本个数， b为 预测为原发性乳腺癌患者但实际为正常样本个数， c为预测为正常但实际为原发性乳腺癌 患者样本个数， d为预测为正常且实际也为正常样本个数。 0031 使用机器学习方法(随机森林、 交叉验证与混淆矩阵)同步对上述预测模型进行相 互验证： 0032 在机器学习方法中， 随机森林是一个包含多个决策树的分类器， 每棵决策树会根 据输入数据集产生相应预测输出， 算法采用投票机制选择类别众数作为预测结果。 适用于 存在大量特征的数据集， 能够评估单个特征在分类中的重要性， 且。

27、不用担心过拟合。 通过自 助法重采样技术， 从原始训练数据集N中， 有放回的应用bootstrap方法重复随机抽取k个样 本生成新的训练样本集合， 根据样本集构建k个分类树。 设有n个特征， 则在每一棵树的每个 节点处随机抽取mtry个特征， 通过计算每个特征蕴含的信息量， 特征中选择一个最具有分 类能力的特征进行节点分裂。 每棵树最大限度地生长， 不做任何剪裁， 生成的多棵树组成随 机森林。 每次未被抽到的样本组成了K个袋外数据(out-of-bag， BBB)。 新数据的分类结果由 各决策树分类结果的众数决定。 其实质是对决策树算法的改进， 将多个决策树合并在一起， 每棵树的建立依赖于一个。

28、独立抽取的样品。 单棵树的分类能力可能很小， 但在随机产生大 量决策树后， 一个测试样品可以通过每一棵树的分类结果投票后决定其最终分类。 本发明 说明书 5/9 页 8 CN 111440869 A 8 使用随机森林方法， 使用R语言平台(v3.6.0)及R studio工具(v3.6.0)进行数据分析， 所用 工具包为randomForest(v4.6-14)， 并结合交叉验证， 以混淆矩阵(confusion-matrix)作为 可视化工具， 根据样本甲基化数据构建预测模型， 与基于甲基化位点的甲基化Beta值构建 的预测模型进行相互验证。 0033 若一个实例是正类， 但是被预测成为正类。

29、， 即为真正类(True Positive， TP)； 0034 若一个实例是负类， 但是被预测成为负类， 即为真负类(True Negative， TN)； 0035 若一个实例是负类， 但是被预测成为正类， 即为假正类(False Positive， FP)； 0036 若一个实例是正类， 但是被预测成为负类， 即为假负类(False Negative； FN) 0037 根据预测模型的预测结果， 可得到的混淆矩阵如下： 0038 0039 根据混淆矩阵数值， 可以引入以下本领域通用的评价指标： Odds ratio值、 AUC、 召 回率、 精确率和F1值。 0040 Odds rati。

30、o值计算公式为： 0041 0042 其中， a为预测为原发性乳腺癌患者且实际也为原发性乳腺癌患者样本个数， b为 预测为原发性乳腺癌患者但实际为正常样本个数， c为预测为正常但实际为原发性乳腺癌 患者样本个数， d为预测为正常且实际也为正常样本个数。 0043 召回率Recall值， 即正确预测为正的占全部实际为正的比例， 计算公式为： 0044 0045 精确率Precision值， 即正确预测为正的占全部预测为正的比例， 计算公式为： 0046 0047 F1值(H-mean值)， 即模型精确率和召回率的一种加权平均， 计算公式为： 0048 0049 公式转化后为： 0050 0051。

31、 ROC(Receiver Operating Characteristic)即 “受试者工作特征” ， 其主要分析工 具是一个画在二维平面上的曲线ROC curve。 平面的横坐标是false positive rate (FPR)， 纵坐标是true positive rate(TPR)。 对某个分类器而言， 我们可以根据其在测试样 本上的表现得到一个TPR和FPR点对。 这样， 此分类器就可以映射成ROC平面上的一个点。 调 整这个分类器分类时候使用的阈值， 我们就可以得到一个经过(0,0)， (1,1)的曲线， 这就是 此分类器的ROC曲线。 一般情况下， 这个曲线都应该处于(0,0)。

32、和(1,1)连线的上方。 因为(0, 说明书 6/9 页 9 CN 111440869 A 9 0)和(1,1)连线形成的ROC曲线实际上代表的是一个随机分类器。 AUC(Area Under roc Curve)用来度量 “二分类问题” 机器学习算法性能(泛化能力)， ROC曲线的面积就是AUC， AUC 值通常介于0.5-1.0之间， AUC值越大， 该分类模型越好。 0052 AUC计算公式为： 即 0053 0054 其中， M为预测为正类样本的数目， N为预测为负类样本的数目。 0055 实施例1 0056 以DNA甲基化标记物10:12277929为例， 根据样本Beta值， 构建。

33、预测模型， 预测患原 发性乳腺癌病人为32个， 根据数据集信息， 预测患者中未患病样本14个， 得到如下结果： 0057 0058 0059 该模型中OR值为27.8114， P值为1.02E-24， 显著， 95置信区间为14.6042, 52.9625。 0060 实施例2 0061 以DNA甲基化标记物10:12277911为例， 根据样本Beta值， 构建预测模型， 预测患原 发性乳腺癌病人为30个， 根据数据集信息， 预测患者中未患病样本20个， 得到如下结果： 0062 0063 该模型中OR值为18.0293， P值为2.16E-20， 显著， 95置信区间为9.6865, 34。

34、.0422。 0064 实施例3 0065 以DNA甲基化标记物10:12256556为例， 根据样本Beta值， 构建预测模型， 预测患原 发性乳腺癌病人为26个， 根据数据集信息， 预测患者中未患病样本34个， 得到如下结果： 0066 0067 该模型中OR值为8 .9491， P值为2 .98E-13， 显著， 95置信区间为5 .0519 , 15.6948。 0068 实施例4 说明书 7/9 页 10 CN 111440869 A 10 0069 以DNA甲基化标记物10:12278542为例， 根据样本Beta值， 构建预测模型， 预测患原 发性乳腺癌病人为22个， 根据数据集。

35、信息， 预测患者中未患病样本21个， 得到如下结果： 0070 0071 0072 该模型中OR值为12.0889， P值为3.21E-13， 显著， 95置信区间为6.2288, 23.5211。 0073 实施例5 0074 以DNA甲基化标记物10:12278166为例， 根据样本Beta值， 构建预测模型， 预测患原 发性乳腺癌病人为21个， 根据数据集信息， 预测患者中未患病样本15个， 得到如下结果： 0075 0076 该模型中OR值为16.1141， P值为3.43E-14， 显著， 95置信区间为7.7875, 34.1605。 0077 实施例6 0078 使用随机森林方法。

36、， 使用R语言平台(v3.6.0)及R studio工具(v3.6.0)进行数据 分析， 所用工具包为randomForest(v4.6-14)， 并结合交叉验证， 以混淆矩阵作为可视化工 具， 根据样本甲基化数据构建预测模型， 得到如下结果： 0079 0080 该模型中OR值为26.6127， P值为3.96E-30， 显著， 95置信区间为15.1222, 46.8341， AUC值为0.9112， 召回率Recall值为0.1657， 精确率Precision值为0.6857， F1值 为0.2668(模型精确率和召回率的一种加权平均)。 0081 上述两种模型相互验证， 通过检测所选。

37、DNA甲基化标记物： 10:12277929、 10: 12277911、 10:12256556、 10:12278542、 10:12278166、 10:12277918、 10:12276839、 10: 12277559、 10:12249674、 10:12251484、 10:12278347、 10:12277764、 10:12268313、 10: 12275299、 10:12277961、 10:12277807、 10:12278371、 10:12278305和10:12261333(基于 Chromosome_36/Coordinate_36版本位点在基因组的坐标。

38、)， 可以很好的预测原发性乳腺癌 发生风险。 0082 本发明公开的预测原发性乳腺癌的DNA甲基化标志物包括上述19个原发性乳腺癌 说明书 8/9 页 11 CN 111440869 A 11 相关基因甲基化标记物中的至少一个， 可将该19个乳腺癌相关的基因甲基化标记物联合起 来检测多个原发性乳腺癌相关DNA甲基化程度， 可以明显地提高原发性乳腺癌的检出率， 节 约成本， 适于推广应用， 具有较好的应用前景。 0083 最后所应当说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制， 尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明， 本领域的普通技术人员应当 理解， 可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。 说明书 9/9 页 12 CN 111440869 A 12 。