丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶及其制备方法.pdf

《丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶及其制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶及其制备方法.pdf（10页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010368334.X (22)申请日 2020.04.30 (71)申请人 苏州苏豪生物材料科技有限公司 地址 215168 江苏省苏州市吴中区经济开 发区田上江路105号 (72)发明人 郭志方陶伟 (74)专利代理机构 苏州创元专利商标事务所有 限公司 32103 代理人 陶海锋 (51)Int.Cl. C08J 3/24(2006.01) C08J 3/12(2006.01) A61L 27/52(2006.01) A61L 27/58(2006.01) A61L 。

2、27/22(2006.01) A61L 27/20(2006.01) C08L 89/00(2006.01) C08L 5/08(2006.01) (54)发明名称 一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶 及其制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种丝素蛋白-透明质酸钠交 联双网络凝胶及其制备方法。 利用蚕丝丝素蛋白 中酪氨酸残基含量较高的特点， 用酪氨酸酶催化 丝素蛋白大分子间发生交联反应,生成丝素蛋白 第一网络； 用碳化二亚胺介导透明质酸钠大分子 间的交联， 生成透明质酸钠第二网络； 将第一网 络和第二网络混合后， 依靠碳化二亚胺的介导， 生成第一网络与第二网络之间的交联键， 从而制 成丝。

3、素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶。 本发 明提供的凝胶具有三维网络结构稳定， 不易崩塌 和解体， 抗生物降解能力强， 生物相容性好的特 点， 可广泛用于组织填充、 引导组织再生、 组织工 程支架及药物载体等。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 111440340 A 2020.07.24 CN 111440340 A 1.一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶的制备方法， 将蚕丝经脱胶、 溶解、 透析 处理后得到丝素蛋白水溶液， 用纯化水调整丝素蛋白水溶液的浓度， 其特征在于再进行如 下步骤的加工： （1） 将酪氨酸酶溶液和双氧水分别滴加到温度为1550的丝素蛋白水溶液中， 边滴 加。

4、边缓慢搅拌， 在温度为1550的条件下， 搅拌反应60180分钟， 得到第一组分； （2） 将透明质酸钠溶解于50 mmol/L的2-吗啉乙磺酸溶液中， 再滴加N-羟基琥珀酰亚胺 和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液， 得到的透明质酸钠溶液中， N-羟基琥 珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度分别为520 mmol/L和10 40 mmol/L； 在温度为1550的条件下， 搅拌反应30120分钟， 得到第二组分； （3） 将第一组分与第二组分充分混合， 真空脱泡， 在温度为1550的条件下反应6 24小时， 得到丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶。

5、块； （4） 将丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块破碎造粒， 装入截留分子量为312 kDa的透析袋中， 用纯化水、 注射用水或生理盐水透析24天， 再经筛网过滤后， 得到颗粒状 丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶。 2.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶的制备方法， 其特 征在于： 所述丝素蛋白为桑蚕丝素蛋白或柞蚕丝素蛋白。 3.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶的制备方法， 其特 征在于： 步骤 （1） 中丝素蛋白水溶液的浓度为240 mg/mL。 4.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶的制备方法， 其特 征在于： 。

6、步骤 （1） 中， 酪氨酸酶溶液的浓度为500 U/mL； 每100 mL丝素蛋白水溶液中酪氨酸 酶溶液的滴加量为130 mL， 双氧水的滴加量为10500 L。 5.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶的制备方法， 其特 征在于： 步骤 （2） 中， 透明质酸钠的平均分子量为4002000 kDa； 透明质酸钠的2-吗啉乙磺 酸 （MES） 溶液浓度为120 mg/mL。 6.按权利要求1制备方法得到的一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶， 由经酶交 联形成的丝素蛋白第一网络和交联透明质酸钠第二网络组成， 第一网络和第二网络之间相 互交联。 权利要求书 1/1 页 2。

7、 CN 111440340 A 2 一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及生物医用高分子凝胶材料领域， 尤其涉及丝素蛋白-透明质酸钠交联 双网络凝胶及其制备方法， 可用于组织填充、 引导组织再生、 细胞培养载体、 组织工程支架 及药物控制释放载体等。 背景技术 0002 高分子水凝胶作为一类具备亲水性三维网络结构的高吸水、 高保水材料， 被广泛 用于美容整形领域的组织填充， 矫形外科的缺损组织引导再生、 组织工程支架， 以及药物控 制释放载体等。 0003 透明质酸钠是构成天然细胞外基质的主要成分之一， 广泛存在于脊椎动物的结缔 组织、 关节润滑液和。

8、软骨中。 透明质酸钠是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖通过 1-3键及 1-4键交替组成双糖单位， 再由双糖单位重复组成的线性多糖。 透明质酸钠凝胶 的吸水性强， 吸水后产生的膨胀压力使其可以支撑周围组织。 但是天然透明质酸钠在体内 很易被降解， 半衰期短， 且对骨髓间充质干细胞、 成纤维细胞、 血管内皮细胞等细胞的粘附 能力相对不足。 通过用1,4-丁二醇二缩水甘油醚、 二乙烯基砜等试剂交联， 虽然可以延缓透 明质酸钠凝胶的生物降解， 但在体内的停留时间仍然很短。 0004 蚕丝丝素蛋白材料具有良好的生物相容性， 对各种人类细胞的粘附能力强， 在体 内的生物降解速度较慢。 用蚕丝。

9、丝素蛋白与透明质酸钠共混制备复合凝胶， 既能具备透明 质酸钠凝胶的高吸水性， 又能具备蚕丝丝素蛋白凝胶的抗生物降解性能以及对细胞的较强 粘附能力。 0005 在本发明作出之前， 文献报道了一种丝素蛋白-透明质酸钠复合凝胶的制备方法 及性能 （Biomaterials,2020,233:119729） ， 所制备的凝胶是由辣根过氧化物酶和双氧水交 联而成。 中国发明专利CN106492279A公开了一种丝素蛋白-透明质酸复合凝胶的快速制备 方法， 采用碳化二亚胺盐、 N-羟基琥珀酰亚胺、 醛、 二缩水甘油醚或二乙烯砜中的一种或一 种以上交联剂制备而成。 中国发明专利CN110527116A公开了。

10、一种酶法制备丝素/透明质酸 复合外敷材料的方法， 以漆酶催化丝素蛋白和改性后的透明质酸发生交联， 制得复合水凝 胶敷料。 上述方法通过用丝素蛋白与透明质酸钠复合、 交联制备凝胶， 在一定程度上利用了 丝素蛋白和透明质酸钠各自的生物学性能优点。 但是， 由于凝胶内部的网络是由丝素蛋白 与透明质酸钠混合交联而成， 当透明质酸钠组份先被降解后易造成凝胶整体三维网络的崩 塌和解体， 使凝胶失去效用。 发明内容 0006 本发明针对现有技术中丝素蛋白-透明质酸钠凝胶结构及制备方法存在的不足， 提供一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络结构凝胶及其制备方法， 所制备的凝胶具有三 维网络结构牢固， 不易崩塌和解。

11、体， 抗生物降解能力强， 生物相容性好的特点。 0007 实现本发明目的的技术方案是提供一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶的 说明书 1/6 页 3 CN 111440340 A 3 制备方法， 蚕丝经脱胶、 溶解、 透析处理后， 得到丝素蛋白水溶液， 用纯化水调整丝素蛋白水 溶液的浓度， 再进行如下步骤的加工： （1） 将酪氨酸酶溶液和双氧水分别滴加到温度为1550的丝素蛋白水溶液中， 边滴 加边缓慢搅拌， 在温度为1550的条件下， 搅拌反应60180分钟， 得到第一组分； （2） 将透明质酸钠溶解于50 mmol/L的2-吗啉乙磺酸溶液中， 再在溶液中滴加N-羟基琥 珀酰亚胺和1-(。

12、3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液， 得到的透明质酸钠溶液中 N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度分别为520 mmol/L和1040 mmol/L， 在温度为1550的条件下， 搅拌反应30120分钟， 得到第二组 分； （3） 将第一组分与第二组分充分混合， 真空脱泡， 在温度为1550的条件下反应6 24小时， 得到丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块； （4） 将丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块破碎造粒， 装入截留分子量为312 kDa的透析袋中， 用纯化水、 注射用水或生理盐水透析24天， 再经筛网过滤后， 得到颗粒状 丝素蛋白-。

13、透明质酸钠交联双网络凝胶。 0008 本发明技术方案所述的丝素蛋白为桑蚕丝素蛋白或柞蚕丝素蛋白。 0009 本发明所述的一种丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶的制备方法， 步骤 （1） 中 丝素蛋白水溶液的浓度为240 mg/mL； 步骤 （1） 中， 酪氨酸酶溶液的浓度为500 U/mL； 每 100 mL丝素蛋白水溶液中酪氨酸酶溶液的滴加量为130 mL， 双氧水的滴加量为10500 L。 步骤 （2） 中， 透明质酸钠的平均分子量为4002000 kDa； 透明质酸钠的2-吗啉乙磺酸溶 液浓度为120 mg/mL。 0010 本发明技术方案还包括按上述制备方法得到的一种丝素蛋白-透明质酸。

14、钠交联双 网络凝胶， 由经酶交联形成的丝素蛋白第一网络和交联透明质酸钠第二网络组成， 第一网 络和第二网络之间相互交联。 0011 本发明的原理是： 利用丝素蛋白中酪氨酸残基含量较高的特点， 用酪氨酸酶催化 丝素蛋白大分子间发生交联反应, 生成丝素蛋白第一网络内部交联键， 并经酶交联形成的 丝素蛋白第一网络； 用碳化二亚胺介导透明质酸钠大分子间的交联， 生成透明质酸钠第二 网络内部交联键， 并形成透明质酸钠第二网络； 同时依靠碳化二亚胺的介导， 生成第一网络 与第二网络之间的交联键， 从而制成丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶。 0012 与现有技术相比， 本发明的显著优点在于： 1 本发明提。

15、供的凝胶由经交联形成的丝素蛋白第一网络和交联透明质酸钠第二网络 组成， 且第一网络和第二网络之间也经共价键交联， 网络结构牢固， 当部分透明质酸钠组份 先被降解后， 凝胶整体的三维网络结构不易崩塌和解体， 凝胶的抗生物降解能力强。 0013 2 本发明提供的凝胶既具备高吸水性能， 又具备对细胞的较强粘附能力。 0014 3 本发明提供的制备方法， 丝素蛋白第一网络和交联透明质酸钠第二网络各自利 用不同的可反应基团、 采用不同的反应原理进行交联后形成， 能够确保各自网络结构的稳 定。 0015 4 本发明以天然高分子为原料， 采用低毒性的试剂完成交联反应， 且经过纯化工 艺除去未反应物， 可保持。

16、凝胶优良的生物相容性。 说明书 2/6 页 4 CN 111440340 A 4 附图说明 0016 图1为本发明提供的丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶的结构示意图； 图2为本发明实施例提供的第一组分丝素蛋白网络的热水溶失率及酪氨酸含量的柱状 图； 图3为本发明实施例提供的丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶与对照样的降解率 对比的柱状图。 0017 图中， 1.丝素蛋白网络 （第一网络） ； 2.透明质酸钠网络 （第二网络） ； 3.丝素蛋白网 络 （第一网络） 内部交联键； 4. 透明质酸钠网络 （第二网络） 内部交联键； 5. 丝素蛋白网络 （第一网络） 与透明质酸钠网络 （第二网络） 。

17、之间交联键。 具体实施方式 0018 以下结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。 0019 实施例1 将桑蚕茧壳经清洗、 脱胶、 溶解、 透析后， 用纯化水稀释调整浓度， 得到浓度为20 mg/mL 的桑蚕丝素蛋白水溶液。 0020 将浓度为500 U/mL的酪氨酸酶溶液和双氧水分别缓慢滴加到温度为30的桑蚕 丝素蛋白水溶液中， 边滴加边缓慢搅拌， 每100 mL桑蚕丝素蛋白溶液中酪氨酸酶溶液的滴 加量为15 mL， 双氧水的滴加量为100 L。 温度维持在30， 搅拌反应60分钟， 得到第一组 分。 0021 在室温条件下， 将平均分子量为1000 kDa的透明质酸钠溶解于50 。

18、mmol/L的2-吗 啉乙磺酸 （MES） 溶液中， 边溶解边缓慢搅拌， 使溶液中透明质酸钠的浓度为8 mg/mL， 再在溶 液中滴加N-羟基琥珀酰亚胺 （NHS） 和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 （EDC） 溶 液， 使溶液中NHS和EDC的浓度分别为10 mmol/L和20 mmol/L。 温度维持在30， 搅拌反应90 分钟， 得到第二组分。 0022 将第一组分与第二组分按体积比10 20充分混合， 温度维持在30， 反应12小时， 得到桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块。 0023 将桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块破碎造粒后， 装入截留分子量为9 。

19、kDa的透析袋中， 用纯化水透析4天。 最后经筛网过滤， 得到桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联 双网络凝胶颗粒， 其粒径为300700 m。 0024 参见附图1， 为本发明提供的丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶的结构示意 图； 丝素蛋白中酪氨酸残基含量较高， 用酪氨酸酶催化丝素蛋白大分子间发生交联反应, 生成丝素蛋白网络 （第一网络） 内部交联键3， 并经酶交联形成的丝素蛋白网络 （第一网络） 1； 以碳化二亚胺介导透明质酸钠大分子间的交联， 生成透明质酸钠网络 （第二网络） 内部交 联键4， 并形成透明质酸钠网络 （第二网络） 2； 同时依靠碳化二亚胺的介导， 生成丝素蛋白网 络 （第一网络。

20、） 与透明质酸钠网络 （第二网络） 之间交联键5， 从而制成丝素蛋白-透明质酸钠 交联双网络凝胶。 0025 对得到的第一组分样品， 其酪氨酸含量及热水溶失率进行测试： 取一定数量的第 一组分样品， 经冷冻干燥后得到第一组分样品的固体。 取其中部分固体， 用氨基酸分析仪测 定其酪氨酸的含量 （mol%） 。 同时， 另取其中部分固体， 称得其质量W0（g） ， 加入锥形瓶中按浴 说明书 3/6 页 5 CN 111440340 A 5 比为1:100加入去离子水， 于37 ， 在水浴恒温振荡器中振荡24小时， 过滤， 将残留的第一 组分样品再经冷冻干燥后称得其质量W1（g） ， 按公式 （1）。

21、 计算得到第一组分样品的热水溶失 率 （%） 。 对未经交联反应的丝素蛋白溶液经冷冻干燥后作为交联前的样品， 进行相同步骤的 测试。 0026 参见附图2， 它是本实施例提供的第一组分的热水溶失率及酪氨酸含量的柱状图； 由图 2可见， 本实施例提供的经酪氨酸酶溶液和双氧水交联加工后， 第一组分样品中酪氨酸的含 量明显减少， 热水溶失率显著降低， 几乎不溶于水， 说明酪氨酸酶和双氧水有效催化了丝素 蛋白中酪氨酸间的交联反应， 形成第一网络丝素蛋白网络。 0027 桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠混合网络凝胶 （对照样凝胶） 的制备： 将MES溶解于20 mg/mL的桑蚕丝素蛋白水溶液中， 使其浓度达到5。

22、0 mmol/L。 再在溶液中滴加NHS和EDC溶液， 使溶液中NHS和EDC的浓度分别为10 mmol/L和20 mmol/L， 得到对照样第一组分。 第二组分 的制备方法与本实施例中第二组分相同。 将制备的对照样第一组分立即与第二组分按照体 积比10 20充分混合， 按照本实施例中所述相同的方法制备凝胶块， 并经破碎造粒、 透析、 筛 网过滤后， 得到桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联混合网络凝胶颗粒， 作为对照样凝胶。 0028 凝胶的抗降解性能测试： 取冷冻干燥后的蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝 胶颗粒约0.5 g， 准确称得其质量M0（g） ， 加300 U/mL的透明质酸酶溶液2mL。

23、， 37保温降解 65小时， 过滤， 将残留的凝胶冷冻干燥后称得其质量M1（g） ， 按公式 （2） 计算得到凝胶的降解 率 （%） 。 桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶 （双网络凝胶） 和对照样凝胶进行相同的 测试。 0029 参见附图3， 为本实施例提供的丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶与对照样的 降解率对比的柱状图； 由图3可见， 桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶的降解率显 著小于对照样， 抗降解能力显著强于对照样。 0030 实施例2 将桑蚕生丝经脱胶、 溶解、 透析后， 用纯化水稀释调整浓度， 得到浓度为2 mg/mL的桑蚕 丝素蛋白水溶液。 0031 在室温条件下， 。

24、将酪氨酸酶溶解于纯化水中， 边溶解边缓慢搅拌， 制备浓度为500 U/mL的酪氨酸酶溶液。 0032 将酪氨酸酶溶液和双氧水分别滴加到温度为15的桑蚕丝素蛋白水溶液中， 边滴 加边缓慢搅拌， 每100 mL桑蚕丝素蛋白溶液中酪氨酸酶溶液的滴加量为25 mL， 双氧水的滴 加量为450 L。 温度维持在15， 搅拌反应180分钟。 得到第一组分。 0033 在室温条件下， 将平均分子量为2000 kDa的透明质酸钠溶解于50 mmol/L的MES溶 液中， 边溶解边缓慢搅拌， 使溶液中透明质酸钠的浓度为5 mg/mL， 再在溶液中滴加NHS和 EDC溶液， 使溶液中NHS和EDC的浓度分别为5 。

25、mmol/L和10 mmol/L。 温度维持在15， 搅拌反 应30分钟。 得到第二组分。 0034 将第一组分与第二组分按照体积比10 15充分混合， 温度维持在15， 反应24小 说明书 4/6 页 6 CN 111440340 A 6 时， 得到桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块。 0035 将桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块粉碎造粒后， 装入截留分子量为 12 kDa的透析袋中， 用注射用水透析3天， 最后再经筛网过滤后得到桑蚕丝素蛋白-透明质 酸钠交联双网络凝胶颗粒。 0036 实施例3 将桑蚕生丝经脱胶、 溶解、 透析后， 用纯化水稀释调整浓度， 得到浓度为38 mg。

26、/mL的桑 蚕丝素蛋白水溶液。 0037 将浓度为500 U/mL的酪氨酸酶溶液和双氧水分别缓慢滴加到温度为50的桑蚕 丝素蛋白水溶液中， 边滴加边缓慢搅拌， 每100 mL桑蚕丝素蛋白溶液中酪氨酸酶溶液的滴 加量为2 mL， 双氧水的滴加量为15 L。 温度维持在50， 搅拌反应120分钟。 得到第一组分。 0038 在室温条件下， 将平均分子量为400 kDa的透明质酸钠溶解于50 mmol/L的MES溶 液中， 边溶解边缓慢搅拌， 使溶液中透明质酸钠的浓度为20 mg/mL， 再在溶液中滴加NHS和 EDC溶液， 使溶液中NHS和EDC的浓度分别为20 mmol/L和40 mmol/L。。

27、 温度维持在50， 搅拌 反应120分钟。 得到第二组分。 0039 将第一组分与第二组分按照体积比10 10充分混合， 温度维持在50， 反应6小时 后， 得到桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块。 0040 将桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块破碎造粒后， 装入截留分子量为3 kDa的透析袋中， 用生理盐水透析2天。 最后经筛网过滤， 得到桑蚕丝素蛋白-透明质酸钠交 联双网络凝胶颗粒。 0041 实施例4 将柞蚕生丝经脱胶、 溶解、 透析后， 用纯化水稀释调整浓度， 得到浓度为2 mg/mL的柞蚕 丝素蛋白水溶液。 0042 将浓度为500 U/mL的酪氨酸酶溶液和双氧水分别缓慢。

28、滴加到温度为20的柞蚕 丝素蛋白水溶液中， 边滴加边缓慢搅拌， 每100 mL柞蚕丝素蛋白溶液中酪氨酸酶溶液的滴 加量为28 mL， 双氧水的滴加量为480 L。 温度维持在20， 搅拌反应150分钟。 得到第一组 分。 0043 在室温条件下， 将平均分子量为1800 kDa的透明质酸钠溶解于50 mmol/L的MES溶 液中， 边溶解边缓慢搅拌， 使溶液中透明质酸钠的浓度为3 mg/mL， 再在溶液中滴加NHS和 EDC溶液， 使溶液中NHS和EDC的浓度分别为10 mmol/L和20 mmol/L。 温度维持在20， 搅拌 反应60分钟。 得到第二组分。 0044 将第一组分与第二组分按。

29、照体积比10 30充分混合， 温度维持在20， 反应20小时 后， 得到柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块。 0045 将柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块破碎造粒后， 装入截留分子量为5 kDa的透析袋中， 用生理盐水透析3天。 最后经筛网过滤， 得到柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交 联双网络凝胶颗粒。 0046 实施例5 将柞蚕茧壳经清洗、 脱胶、 溶解、 透析后， 用纯化水稀释调整浓度， 得到浓度为25 mg/mL 的柞蚕丝素蛋白水溶液。 0047 将浓度为500 U/mL的酪氨酸酶溶液和双氧水分别缓慢滴加到温度为25的柞蚕 说明书 5/6 页 7 CN 111440340 A 7。

30、 丝素蛋白水溶液中， 边滴加边缓慢搅拌， 每100 mL柞蚕丝素蛋白溶液中酪氨酸酶溶液的滴 加量为15 mL， 双氧水的滴加量为80 L。 温度维持在25， 搅拌反应90分钟。 得到第一组分。 0048 在室温条件下， 将平均分子量为800 kDa的透明质酸钠溶解于50 mmol/L的MES溶 液中， 边溶解边缓慢搅拌， 使溶液中透明质酸钠的浓度为10 mg/mL， 再在溶液中滴加NHS和 EDC溶液， 使溶液中NHS和EDC的浓度分别为15 mmol/L和30 mmol/L。 温度维持在25， 搅拌 反应110分钟。 得到第二组分。 0049 将第一组分与第二组分按照体积比10 20充分混合。

31、， 温度维持在25， 反应18小时 后， 得到柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块。 0050 将柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块破碎造粒后， 装入截留分子量为9 kDa的透析袋中， 用纯化水透析4天。 最后经筛网过滤， 得到柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联 双网络凝胶颗粒。 0051 将柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块粉碎、 造粒后， 得到柞蚕丝素蛋 白-透明质酸钠交联双网络凝胶颗粒半成品。 0052 将柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶颗粒半成品装入截留分子量为9 12 kDa的透析袋中， 用纯化水透析4天。 其后， 经过滤， 得到柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联 双网络凝。

32、胶颗粒。 0053 实施例6 将柞蚕生丝经脱胶、 溶解、 透析后， 用纯化水稀释调整浓度， 得到浓度为15 mg/mL的柞 蚕丝素蛋白水溶液。 0054 将浓度为500 U/mL的酪氨酸酶溶液和和双氧水分别缓慢滴加到温度为37的柞 蚕丝素蛋白水溶液中， 边滴加边缓慢搅拌， 每100 mL柞蚕丝素蛋白溶液中酪氨酸酶溶液的 滴加量为5 mL， 双氧水的滴加量为25 L。 温度维持在37， 搅拌反应60分钟。 得到第一组 分。 0055 在室温条件下， 将平均分子量为500 kDa的透明质酸钠溶解于50 mmol/L的MES溶 液中， 边溶解边缓慢搅拌， 使溶液中透明质酸钠的浓度为15 mg/mL，。

33、 再在溶液中滴加NHS和 EDC溶液， 使溶液中NHS和EDC的浓度分别为20 mmol/L和35 mmol/L。 温度维持在37， 搅拌 反应50分钟。 得到第二组分。 0056 将第一组分与第二组分按照体积比10 15充分混合， 温度维持在37， 反应8小时 后， 得到柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块。 0057 将柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠交联双网络凝胶块破碎造粒后， 装入截留分子量为 12 kDa的透析袋中， 用注射用水透析2天。 最后经筛网过滤， 得到柞蚕丝素蛋白-透明质酸钠 交联双网络凝胶颗粒。 说明书 6/6 页 8 CN 111440340 A 8 图1 图2 说明书附图 1/2 页 9 CN 111440340 A 9 图3 说明书附图 2/2 页 10 CN 111440340 A 10 。