来源于脂肪细胞外泌体的lncRNA标志物及其应用及产品.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010356179.X (22)申请日 2020.04.29 (71)申请人 余之刚 地址 250000 山东省济南市天桥区北园大 街247号山东大学第二医院乳腺外科 (72)发明人 余之刚黄淑亚周文重刘丽媛 王斐郭明明 (74)专利代理机构 济南舜昊专利代理事务所 (特殊普通合伙) 37249 代理人 宋玉霞 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) A61K 45/00(2006.01) A61K 31/7088(2006.01) A61P 35。

2、/00(2006.01) A61P 15/14(2006.01) (54)发明名称 一种来源于脂肪细胞外泌体的lncRNA标志 物及其应用及产品 (57)摘要 本发明公开了一种来源于脂肪细胞外泌体 的lncRNA标志物及其应用及产品， 所述的lncRNA 标志物为长链非编码RNATUG1基因或其同源物、 突变或同等型， lncRNATUG1来源于乳腺癌细胞、 肿瘤间质脂肪细胞或肿瘤间质成纤维细胞分泌 的外泌体、 或体液外泌体； lncRNATUG1在肥大脂 肪细胞及乳腺癌中高表达， 并可通过外泌体从脂 肪细胞传递至乳腺癌细胞。 该来源于脂肪细胞外 泌体的lncRNA标志物为一种检测肿瘤间质脂肪。

3、 细胞及肿瘤自身长链非编码RNATUG1的产品， 为 实现乳腺癌的早期诊断提供基础， 将长链非编码 RNATUG1作为治疗靶点， 作为疾病治疗的指标应 用于临床， 为乳腺癌的预防和机制研究提供了理 论依据。 权利要求书2页 说明书14页 附图16页 CN 111455056 A 2020.07.28 CN 111455056 A 1.一种来源于脂肪细胞外泌体的lncRNA标志物， 其特征在于， 所述的lncRNA标志物为 长链非编码RNA TUG1基因或其同源物、 突变或同等型， lncRNA TUG1来源于乳腺癌细胞、 肿 瘤间质脂肪细胞或肿瘤间质成纤维细胞分泌的外泌体、 或体液外泌体； l。

4、ncRNA TUG1在肥大脂肪细胞及乳腺癌中高表达， 并可通过外泌体从脂肪细胞传递至 乳腺癌细胞。 2.如权利要求1所述的一种来源于脂肪细胞外泌体的lncRNA标志物在制备诊断乳腺癌 产品中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述的诊断乳腺癌产品包括： (1)识别所述lncRNA TUG1序列的引物/引物组或探针； (2)识别所述lncRNA TUG1序列的小分子化合物或识别所述lncRNA TUG1序列的生物大 分子， 所述的生物大分子包括： RNA结合蛋白或其功能片段、 荧光标记的RNA结合蛋白或其功 能片段。 4.如权利要求1所述的一种来源于脂肪细胞外泌体的lncRN。

5、A标志物在制备治疗乳腺癌 产品中的应用。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述的治疗乳腺癌产品包括以下成分中的 至少一种： (1)抑制所述lncRNA TUG1序列的s iRNA、 shRNA、 sgRNA或功能类似的小干扰小RNA探 针； (2)抑制所述lncRNA TUG1序列的寡核苷酸片段， 所述的寡核苷酸片段包括： 反义寡核 苷酸ASO、 锁核酸LNA或功能类似的化学修饰的寡核苷酸； (3)抑制所述lncRNA TUG1序列的小分子化合物； (4)抑制所述lncRNA TUG1序列的生物大分子； (5)敲除或破坏所述lncRNA TUG1的工具分子。 6.根据权利要求5所。

6、述的应用， 其特征在于， 步骤(4)所述的生物大分子为高底物专一 性的酶或其功能片段； 步骤(5)所述的敲除或破坏所述lncRNA TUG1的工具分子， 包括DNA同源重组质粒、 TALEN-TALEA靶向基因敲除质粒系统、 Cre/Loxp质粒系统、 诱导性Cre/Loxp质粒系统、 CRISPR基因编辑质粒系统中的至少一种。 7.如权利要求2或4所述的应用， 其特征在于， 所述乳腺癌包含病理类型为浸润性导管 癌和浸润性小叶癌。 8.如权利要求2或4所述的应用， 其特征在于， 所述乳腺癌包括四种分子分型， 分别为 Luminal A型、 Luminal B型、 三阴型、 HER-2过表达型。。

7、 9.一种来源于脂肪细胞外泌体的lncRNA标志物在构建预测乳腺癌预后的计算模型中 的应用。 10.一种治疗乳腺癌产品， 其特征在于， 根据shRNA设计原则， 以lncRNA TUG1为靶序列， 设计了2条针对lncRNA TUG1的靶位点序列， 合成相对应的序列： LV3-homo-shTUG1-1 GCTTGGCTTCTATTCTGAATCCTTT LV3-homo-shTUG1-2 GCTCCATCCAAAGTGAATTAT； 这些序列接头设计退火后形成Bam H 和EcoR 的粘性末端； 经过酶切， 链接， 鉴定， 测序 权利要求书 1/2 页 2 CN 111455056 A 2 。

8、等步骤构建lncRNA TUG1的shRNA慢病毒表达载体。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111455056 A 3 一种来源于脂肪细胞外泌体的lncRNA标志物及其应用及产品 技术领域 0001 本发明涉及生物医药技术领域， 特别是涉及一种来源于脂肪细胞外泌体的lncRNA 标志物及其应用及产品。 背景技术 0002 乳腺癌在全世界范围内是女性最常见的恶性肿瘤之一。 近年来乳腺癌在我国女性 的发病率及死亡率均有上升趋势， 目前发病率高居我国女性恶性肿瘤首位， 且近年来发病 年龄有年轻化趋势。 目前对于乳腺癌的治疗方法主要有:手术治疗、 (新)辅助化疗、 辅助放 疗、 内分泌治疗及靶向治。

9、疗等方式， 在不同的阶段采取合理的治疗方式， 可获得较好的治疗 效果。 但是仍有部分患者出现复发和远处转移， 这是造成乳腺癌患者死亡的主要原因， 严重 影响着妇女身心健康甚至危及生命。 0003 最近的研究表明在哺乳动物基因组中只有不到2的基因能够编码蛋白， 其它大 约98的基因都编码成非编码RNA。 非编码RNA根据其长度， 一般分为两类， 一类为非编码小 RNA(sncRNA， Small non-coding RNA)， 其转录长度少于200个核苷酸， 另一类为长链非编码 RNA(Long non-coding RNA， lncRNA)， 被广泛的定义为转录长度超过200个核苷酸并且没有。

10、 表观编码能力的RNA。 LncRNA具有复杂的二级结构、 三级结构， 能够与蛋白质、 RNA、 DNA结合， 因此lncRNA为miRNA、 mRNA、 蛋白质或者其复合物进行复杂的相互作用提供了平台。 目前越 来越多的证据显示， lncRNA在基因转录、 转录后调控、 RNA剪切、 翻译、 表观遗传调控等过程 中都发挥着重要作用， 并与乳腺癌的生物学行为关系密切。 0004 长链非编码RNA TUG1位于人22号染色体上， 基因ID为55000， 该基因产生一个长的 非编码RNA， 在转录的表观遗传调控中发挥作用。 这种RNA促进细胞增殖， 并在肿瘤细胞中上 调。 0005 公开号为CN 。

11、108289906 A， 名称为抗肿瘤性药物递送制剂的专利申请公开了一种 抗肿瘤性药物递送制剂， 用于治疗具有与正常组织相比高表达TUG1基因的肿瘤的受试对象 或者预防肿瘤转移， 其特征在于， 含有高分子胶束作为有效成分， 所述高分子胶束含有抑制 所述TUG1基因高表达的核酸； 该高分子胶束含有： 具有阳离子性聚氨基酸链段和亲水性聚 合物链段的嵌段共聚物， 以及所述核酸； 该核酸与所述阳离子性聚氨基酸链段的阳离子基 团结合形成复合体和/或该核酸包载或附着于所述胶束内部； 以及该高分子胶束积聚于肿 瘤。 0006 目前现有技术中所研究的TUG1基因多是来源于肿瘤细胞， 且作用于肿瘤细胞， 并 未。

12、有TUG1基因外泌体的相关研究， 本发明通过研究乳腺癌自身以及肿瘤间质细胞来源外泌 体中的lncRNA的表达情况， 以及该lncRNA对乳腺癌生物学行为的调控， 提供一种来源于脂 肪细胞外泌体的lncRNA标志物及其应用及产品， 对于实现乳腺乳腺癌的精准诊断以及个性 化治疗具有重要的意义。 说明书 1/14 页 4 CN 111455056 A 4 发明内容 0007 本发明就是针对上述存在的缺陷而提供一种来源于脂肪细胞外泌体的lncRNA标 志物及其应用及产品， 该来源于脂肪细胞外泌体的lncRNA标志物为一种检测肿瘤间质脂肪 细胞及肿瘤自身长链非编码RNA TUG1的产品， 为实现乳腺癌的。

13、早期诊断提供基础， 将长链 非编码RNA TUG1作为治疗靶点， 作为疾病治疗的指标应用于临床， 为乳腺癌的预防和机制 研究提供了理论依据。 0008 本发明的技术方案为， 一种来源于脂肪细胞外泌体的lncRNA标志物及其应用及产 品， 所述的lncRNA标志物为长链非编码RNA TUG1基因或其同源物、 突变或同等型， lncRNA TUG1来源于乳腺癌细胞、 肿瘤间质脂肪细胞或肿瘤间质成纤维细胞分泌的外泌体、 或体液 外泌体； lncRNA TUG1在肥大脂肪细胞及乳腺癌中高表达， 并可通过外泌体从脂肪细胞传递 至乳腺癌细胞。 0009 lncRNA TUG1位于人22号染色体上， 基因I。

14、D为55000。 包括lncRNA TUG1基因及其同 源物， 突变和同等型。 该术语涵盖全长， 未加工的lncRNA TUG1， 以及源自细胞中加工、 分泌 到细胞外以及外泌体中的的任何形式的lncRNA TUG1。 该术语涵盖lncRNA TUG1的天然发生 变体。 该术语涵盖人lncRNA TUG1的基因序列， 以及来自任何其它脊椎动物来源的lncRNA TUG1基因序列。 目前在genebank数据库中公开的lncRNA TUG1存在8个转录本， 对测序结果 进行生物信息学分析时， 通常会将测序结果和已知的基因组进行比对， 只要测序片段可以 比对到相关的基因上， 就可以看做是该基因的表。

15、达， 因此， lncRNA TUG1的不同的转录产物 同样包含在本发明中。 0010 所述的一种来源于脂肪细胞外泌体的lncRNA标志物在制备诊断乳腺癌产品中的 应用， 具体为制备体外检测样本中lncRNA TUG1表达水平的产品， 为制剂、 芯片或试剂盒。 体 外检测样本包含细胞、 组织或体液， 包括但不限于乳腺癌、 肿瘤间质脂肪细胞、 肿瘤间质成 纤维细胞、 上述细胞分泌的细胞来源外泌体、 体液来源外泌体。 体液包括血液、 淋巴液、 尿 液、 唾液、 乳头抽吸液、 妇科液体、 或任何其它身体分泌液或其衍生物。 血液可以包括全血、 血浆、 血清或任何血液衍生物。 0011 所述的诊断乳腺癌产。

16、品包括： 0012 (1)识别所述lncRNA TUG1序列的引物/引物组或探针； 0013 (2)识别所述lncRNA TUG1序列的小分子化合物或识别所述lncRNA TUG1序列的生 物大分子， 所述的生物大分子包括： RNA结合蛋白或其功能片段、 荧光标记的RNA结合蛋白或 其功能片段。 0014 所述的一种来源于脂肪细胞外泌体的lncRNA标志物在制备治疗乳腺癌产品中的 应用。 0015 所述的治疗乳腺癌产品包括以下成分中的至少一种： 0016 (1)抑制所述lncRNA TUG1序列的siRNA、 shRNA、 sgRNA或功能类似的小干扰小RNA 探针； 0017 (2)抑制所述。

17、lncRNA TUG1序列的寡核苷酸片段， 所述的寡核苷酸片段包括： 反义 寡核苷酸ASO、 锁核酸LNA或功能类似的化学修饰的寡核苷酸； 0018 (3)抑制所述lncRNA TUG1序列的小分子化合物； 0019 (4)抑制所述lncRNA TUG1序列的生物大分子； 说明书 2/14 页 5 CN 111455056 A 5 0020 (5)敲除或破坏所述lncRNA TUG1的工具分子。 0021 步骤(4)所述的生物大分子为高底物专一性的酶或其功能片段。 0022 步骤(5)所述的敲除或破坏所述lncRNA TUG1的工具分子， 包括DNA同源重组质粒、 TALEN-TALEA靶向基。

18、因敲除质粒系统、 Cre/Loxp质粒系统、 四环素/干扰素等诱导性Cre/ Loxp质粒系统、 CRISPR/Cas9等CRISPR基因编辑质粒系统中的至少一种。 0023 在本发明中， 治疗试剂涉及的 “探针” 指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它 部分结合的分子。 除非另有指出， 术语 “探针” 通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸 (往往称为 “靶多核苷酸” )结合的多核苷酸探针。 0024 所述乳腺癌包含病理类型为浸润性导管癌和浸润性小叶癌。 0025 所述乳腺癌包括四种分子分型， 分别为Luminal A型、 Luminal B型、 三阴型、 HER-2 过表达型。 0026 。

19、一种来源于脂肪细胞外泌体的lncRNA标志物在构建预测乳腺癌预后的计算模型 中的应用。 0027 一种治疗乳腺癌产品， 根据shRNA设计原则， 以lncRNA TUG1为靶序列， 设计了2条 针对lncRNA TUG1的靶位点序列， 合成相对应的序列： 0028 LV3-homo-shTUG1-1 GCTTGGCTTCTATTCTGAATCCTTT 0029 LV3-homo-shTUG1-2 GCTCCATCCAAAGTGAATTAT； 0030 这些序列接头设计退火后形成Bam H 和EcoR 的粘性末端； 经过酶切， 链接， 鉴定， 测序等步骤构建lncRNA TUG1的shRNA慢病。

20、毒表达载体。 0031 在本发明中， 可以以不同方式实施和实现将lncRNA TUG1水平与某种可能性或风 险关联起来的步骤。 优选地， 在数学上组合基因和一种或多种其它标志物的测定浓度， 并将 组合值与根本的诊断问题关联起来。 可以通过任何适宜的现有技术数学方法将lncRNA TUG1值的测定组合。 根据诊断问题， 能容易地将此类值与个体关于乳腺癌的风险或与有助 于评估乳腺癌患者的其它有意诊断用途关联起来。 以一种优选的方式， 此类对数函数是如 下获得的： a)将个体分类入组， 例如正常人、 有乳腺癌风险的个体、 乳腺癌患者等等， b)通过 单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物， c。

21、)对数回归分析以评估标志物的可用 于评估这些不同组的独立差别值， 并d)构建对数函数来组合独立差别值。 在这种类型的分 析中， 标志物不再是独立的， 而是代表一个标志物组合。 0032 本发明的有益效果为： 0033 目前流行病学研究表明， 肥胖能够影响多种肿瘤的发生、 发展以及预后。 在乳腺癌 中， 肥胖与肿瘤的较差分期、 淋巴结阳性及复发或远处转移正相关。 与正常体重病人相比， 肥胖乳腺癌病人出现转移和死亡风险也明显增加。 0034 肿瘤微环境中的间质细胞能够与肿瘤细胞相互调控， 影响肿瘤的预后。 比如， 肿瘤 脂肪细胞能够分泌可溶性细胞因子和炎性趋化因子促进造血细胞向远处器官的定位， 从。

22、而 为循环肿瘤细胞营造促转移的微环境。 在正常乳腺组织中， 脂肪细胞是间质中含量最多的 细胞， 且和乳腺上皮细胞直接接触， 参与调控乳腺上皮细胞的生理活动。 而在乳腺癌的发生 及发展过程中， 肿瘤周围的脂肪细胞活化为肿瘤相关脂肪细胞(CAA)， 能够通过分泌多种细 胞因子形成炎性微环境促进肿瘤的生长和转移。 因此， 脂肪细胞在乳腺癌转移中的作用十 分关键。 说明书 3/14 页 6 CN 111455056 A 6 0035 除了可溶性细胞因子外， 细胞外囊泡也是细胞分泌的重要因子之一， 其中来源于 多泡体的脂质双层膜囊泡外泌体目前被认为是介导肿瘤细胞和微环境细胞通讯的关键 因素。 外泌体通过。

23、与细胞膜融合将包裹的蛋白、 核酸等成分传递到靶细胞， 影响靶细胞的生 物学行为。 研究表明， 不同细胞间外泌体的联系是引起肿瘤转移的一种广泛机制。 比如， 乳 腺癌能够引起CAF中RNA RN7SL1表达增加并与结合蛋白游离， 游离的RN7SL1通过外泌体进 入乳腺癌细胞后会激活视黄酸诱导基因(IRIG-I)通路促进肿瘤进展和转移。 0036 外泌体中除了携带蛋白质外， lncRNA也是外泌体中的重要成份之一。 本发明研究 乳腺癌自身以及肿瘤间质细胞来源外泌体中的lncRNA的表达情况， 以及该lncRNA对乳腺癌 生物学行为的调控， 对于实现乳腺乳腺癌的精准诊断以及个性化治疗具有重要的意义。。

24、 0037 本发明通过一种来源于脂肪细胞外泌体的可诊断及治疗乳腺癌的分子标志物， 通 过检测标志物lncRNA TUG1在组织、 体液中的表达水平即可对乳腺癌进行判断， 并利用靶向 制剂对其进行干预， 降低其水平， 从而实现疾病的早诊早治， 并改善患者的预后。 0038 本发明提供了一种发现与乳腺癌发生及预后密切相关基因的计算评估模型， 为乳 腺癌的科学研究提供了理论依据。 附图说明： 0039 图1所示为3T3-L1细胞诱导成脂后， 棕榈酸(PA)诱导肥大后油红O染色图； 0040 图2所示为3T3-L1细胞诱导成脂后， 无脂肪酸BSA诱导肥大后油红O染色图； 0041 图3所示为在PA诱导。

25、后的上清中， 电镜鉴定脂肪细胞来源外泌体图； 0042 图4所示为在BSA诱导后的上清中， 电镜鉴定脂肪细胞来源外泌体图； 0043 图5所示为在PA诱导后的上清中， 收集外泌体后， 纳米粒径仪分析鉴定脂肪细胞来 源外泌体颗粒粒径分布图； 0044 图6所示为在BSA诱导后的上清中， 收集外泌体后， 纳米粒径仪分析鉴定脂肪细胞 来源外泌体颗粒粒径分布图； 0045 图7所示为脂肪细胞来源外泌体进入乳腺癌细胞染色照片； 0046 图8所示为MDA-MB-231细胞加入外泌体后侵袭及迁移变化及空白对照照片； 0047 图9所示为MDA-MB-231细胞加入外泌体后侵袭及迁移变化及空白对照柱状图， 。

26、其 中*， p0.05， *， p0.01， *， p0.001； 0048 图10所示为4T1细胞加入外泌体后侵袭及迁移变化及空白对照照片； 0049 图11所示为4T1细胞加入外泌体后侵袭及迁移变化及空白对照柱状图， 0050 其中*， p0.05， *， p0.01， *， p0.001； 0051 图12所示为外泌体lncRNA芯片分析结果； 0052 图13所示为肥大脂肪细胞细胞内lncRNA TUG1表达柱状图， 其中， *， p0.05； 0053 图14所示为分泌的外泌体中lncRNA TUG1表达柱状图， 其中， *， p0.05； 0054 图15所示为人乳腺上皮细胞及乳腺。

27、癌细胞内lncRNA TUG1表达图； 0055 图16所示为人乳腺癌细胞MDA-MB-231采用靶点序列LV3-homo-shTUG1-1敲低 lncTUG1后效果验证， 其中， *， p0.001， ns， 没有意义； 0056 图17所示为人乳腺癌细胞MDA-MB-231采用靶点序列LV3-homo-shTUG1-2敲低 lncTUG1后效果验证， 其中， *， p0.001， ns， 没有意义； 说明书 4/14 页 7 CN 111455056 A 7 0057 图18所示为人乳腺癌细胞MDA-MB-231敲低lncRNA TUG1后迁移及侵袭能力改变 图； 0058 图19所示为l。

28、ncRNA TUG1在乳腺癌组织和正常组织中的表达差异比较图； 0059 图20所示为KaplanMeier Plotter分析TUG1(探针ID： 228397_at)与乳腺癌总生 存(OS)关系图； 0060 图21所示为KaplanMeier Plotter分析TUG1(探针ID： 212725_at)与乳腺癌总生 存(OS)关系图； 0061 图22所示为KaplanMeier Plotter分析TUG1(探针ID： 228397_at)与乳腺癌无远 处转移生存(DMFS)的关系； 0062 图23所示为KaplanMeier Plotter分析TUG1(探针ID： 212725_at。

29、)与乳腺癌无远 处转移生存(DMFS)的关系。 具体实施方式： 0063 为了更好地理解本发明， 下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案， 但是本 发明并不局限于此。 0064 lncRNA TUG1， 在乳腺癌及肥大脂肪细胞中均表达增加升高， 提示其具有诊断乳腺 癌的特征。 同时， lncRNA TUG1可由肥大脂肪细胞通过外泌体传递进入乳腺癌细胞， 显著的 促进乳腺癌癌细胞的侵袭和转移， 说明其具有治疗乳腺癌转移的重要潜能。 具体内容如下： 0065 1)体外诱导成脂， 并利用棕榈酸(PA)诱导脂滴变大， 模拟脂肪细胞肥大过程， 发现 肥大脂肪细胞来源外泌体能够进入乳腺癌细胞， 并明显促。

30、进肿瘤转移。 0066 2)肥大脂肪细胞来源外泌体中lncRNA TUG1明显上调。 0067 3)lncRNA TUG1在乳腺癌细胞中， 表达明显高于正常乳腺上皮细胞， 在利用慢病毒 降低lncRNA TUG1表达后， 乳腺癌细胞侵袭及迁移能力明显降低。 0068 4)通过TCGA数据库分析发现， lncRNA TUG1与乳腺癌患者无远处转移生存(DMFS) 明显相关。 0069 因此， 本发明通过一种来源于脂肪细胞外泌体的可诊断及治疗乳腺癌的分子标志 物， 通过检测标志物lncRNA TUG1在组织、 体液中的表达水平即可对乳腺癌进行判断， 并利 用靶向制剂对其进行干预， 降低其水平， 从。

31、而实现疾病的早诊早治， 并改善患者的预后。 0070 下面结合实施例对本发明作进一步说明。 0071 本发明所用3T3-L1脂肪前体细胞株、 MDA-MB-231细胞、 4T1细胞、 MCF-7细胞、 SK- BR-3细胞、 MCF-10A、 HEK293T细胞均为市购常规细胞株。 0072 实施例1 0073 体外诱导脂肪细胞形成， 并利用PA刺激脂滴肥大， 体外模拟脂肪细胞肥大过程。 0074 1.3T3-L1脂肪前体细胞株的诱导分化 0075 1)将3T3-L1脂肪前体细胞接种于培养板， 用含10胎牛血清的高糖DMEM培液在37 、 5CO2培养。 0076 2)待细胞长满至80-90，。

32、 融合2天(融合的意思是指让细胞接触抑制， 就是长满后 换液让其再长两天)后， 加含终浓度为0.5mmol/L IBMX(储存液浓度0.5mmol/L)、 终浓度为 1umol/L(储存液浓度为1mg/ml(2.5mmol/L)地塞米松和终浓度为10ug/ml的胰岛素的10 说明书 5/14 页 8 CN 111455056 A 8 胎牛血清高糖DMEM培养48h； (诱导剂临用时再加到培液中混匀)。 0077 3)48h后换含终浓度为10ug/ml的胰岛素的10胎牛血清高糖DMEM培养液再培养 48h， 48h后再换10胎牛血清高糖DMEM继续培养， 2天后换培养液一次， 诱导分化812天 。

33、3T3-L1细胞90多呈成熟脂肪细胞表型， 用于进一步实验。 0078 2.PA诱导脂滴增大 0079 1)天平秤取20mg NAOH溶解于5ml双蒸水中， 获得0.1M NAOH溶液。 称取12.8mg棕榈 酸(PA)， 加入0.1M NAOH 500ul， 70摄氏度水浴30min， 使PA充分溶解， PA浓度为100mM。 0080 2)称取1g无脂肪酸BSA粉末， 溶于10ml双蒸水中， 配置10BSA溶液。 0081 3)移液器吸取取100mM PA溶液500ul， 加入9.5ml 10BSA溶液中， 55摄氏度水浴 10min， 配制成5mM的棕榈酸储存液， 0.22um孔径滤器过。

34、滤后， 4摄氏度保存备用。 0082 4)诱导脂滴肥大时， 10胎牛血清高糖DMEM培养液稀释5mM的棕榈酸储存液至终 浓度为500 M， 终浓度为1的BSA溶液作为对照， 处理脂肪细胞24h。 0083 3.油红O染色 0084 油红O染色试剂盒购买于北京索莱宝公司(货号： G1262)。 0085 1)移除细胞培养基， 用PBS洗两次， 加ORO Fixative固定液固定20-30min。 0086 2)弃去固定液， 用蒸馏水洗2次。 0087 3)加入60异丙醇浸洗5min。 0088 4)弃去60异丙醇后加入新配制好的ORO Stain， 浸染10-20min。 0089 5)弃去染。

35、色液， 水洗2-5次， 直到无多余染液。 0090 6)加入Mayer苏木素染色液， 复染核1-2min。 弃去染液后水洗2-5次。 0091 7)入ORO Buffer 1min， 弃去。 0092 8)加入蒸馏水覆盖细胞并在显微镜下观察。 0093 实验结果： 0094 如说明书附图图1和图2所示， 油红O染色后， PA诱导后脂滴较BSA诱导脂滴数目明 显增多， 且脂滴大小较大。 0095 实施例2 0096 脂肪细胞上清提取外泌体后， 电镜下鉴定。 0097 1.上清收集 0098 1)3T3-L1脂肪前体细胞成脂后， 利用PA诱导24h， BSA作为对照。 0099 2)24h后， 更。

36、换培养液为无血清DMEM培养基。 0100 3)24h后， 收集上清， -80冰箱冻存， 备用。 0101 2.外泌体提取 0102 1)等体积PA和BSA诱导后上清自-80冰箱取出， 冰上融化。 0103 2)上清经过0.22um孔径滤器过滤后， 利用100K超滤管浓缩。 0104 3)向浓缩的上清中， 按照1:5比例加入ExoQuick-TC分离试剂， 颠倒混匀后， 4摄氏 度冰箱静置过夜。 0105 4)取出混有分离试剂的浓缩上清， 1500g离心30min， 移液器仔细去除上清， 见侧壁 上白色胶状外泌体沉淀。 0106 3.电镜下鉴定外泌体 说明书 6/14 页 9 CN 11145。

37、5056 A 9 0107 1)外泌体戊二醛固定。 0108 2)清洗： 用1mL PBS清洗3次， 每次静置15min。 0109 3)e酸固定： 加入0.5mL 2e酸溶液4度固定2h。 0110 4)清洗： 用1mL PBS清洗3次， 每次静置15min。 0111 5)脱水： 用50、 70、 80、 90乙醇各1mL梯度脱水分别静置15min， 再用1mL 100乙醇脱水2次， 每次20min。 0112 6)置换： 用1mL丙酮置换2次， 每次静置15min。 0113 7)浸渍。 0114 8)包埋： 将样品放入盛有纯包埋剂的包埋板中。 0115 9)聚合： 将包埋板置于65条件。

38、下聚合48h。 0116 10)染色： 醋酸双氧铀染色10min后清洗； 醋酸铅染色10min后清洗。 0117 11)上机检测。 0118 实验结果： 0119 如说明书附图图3和图4所示， 在PA和BSA诱导后的上清中， 均可检测到外泌体图 像， 外泌体直径均小于200nm。 0120 实施例3 0121 脂肪细胞上清提取外泌体后， 纳米颗粒跟踪分析鉴定。 0122 外泌体提取方法同实施例2 0123 纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle TrackingAnalysis， NTA)是对每个颗粒的布朗 运动进行追踪和分析， 结合Stockes-Einstein方程式计算出纳米颗粒的流。

39、体力学直径和浓 度。 NTA技术已被外泌体研究领域认可为外泌体表征手段之一； 本部分由山东大学化学院协 助完成。 0124 实验结果： 0125 如说明书附图图5和图6所示， 在PA和BSA诱导后的上清中， 收集外泌体后， 纳米粒 径分析显示， 颗粒粒径分布峰值在200nm以内， 符合外泌体生理学特征。 0126 实施例4 0127 脂肪细胞来源外泌体可以进入乳腺癌细胞。 0128 外泌体提取方法同实施例2 0129 1.细胞培养 0130 1)DMEM+10FBS血清培养MDA-MB-231细胞于6孔板中， 六孔板中放置细胞爬片， 部 分MDA-MB-231细胞于细胞爬片上生长， 备用。 0。

40、131 2)1640+10FBS血清培养4T1细胞于6孔板中， 六孔板中放置细胞爬片， 部分4T1细 胞于细胞爬片上生长， 备用。 0132 2.外泌体提取方法同实施例2 0133 3.外泌体染色 0134 1)向外泌体沉淀中加入100ul稀释液C(Catalog Number G8278)， 用移液管轻轻吹 打混匀， 制备外泌体悬液悬液。 0135 2)临染色之前， 将0.4 L PKH26乙醇溶液加入100uL稀释液C中， 充分混匀。 0136 3)快速将外泌体悬液(步骤1)加入染色液(步骤2)中， 立即用移液管混匀。 说明书 7/14 页 10 CN 111455056 A 10 013。

41、7 4)混匀后的染色的外泌体孵育10min。 0138 5)加入等体积的1BSA溶液终止反应。 0139 4.共培养及观察 0140 1)将染色好的外泌体加入到含有细胞爬片的6孔板中， 共培养6h。 0141 2)吸去培养液， 利用Hank s BSS清洗6孔板， 清洗3次， 每次5min。 0142 3)小心取出细胞爬片， 放置于载玻片上。 0143 4)滴加含有DAPI的防荧光淬灭试剂。 0144 5)盖玻片覆盖， 荧光显微镜下观察， 拍照。 0145 实验结果： 0146 如说明书附图图7所示， PKH26可以对外泌体进行染色(红色)， DAPI对细胞核染色 (蓝色)， 与细胞共培养后，。

42、 荧光显微镜下观察， 可以发现外泌体位于细胞核周围， 证实脂肪 细胞来源外泌体可以进入乳腺癌细胞。 由于提供的说明书附图为黑白色， 可参考PKH26和 DAPI单独染色图片来看Merge图片。 0147 实施例5 0148 脂肪细胞来源外泌体明显促进乳腺癌细胞侵袭及迁移。 0149 外泌体提取方法同实施例2 0150 1.细胞培养 0151 1)DMEM+10FBS血清培养MDA-MB-231， 备用。 0152 2)1640+10FBS血清培养4T1， 备用。 0153 2.外泌体提取方法同实施例2 0154 3.外泌体蛋白定量 0155 利用BCA法对外泌体中蛋白进行定量。 BCA试剂盒购。

43、买于碧云天生物科技公司， (产 品编号： P0010S) 0156 1)蛋白标准品的准备 0157 取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(20mg BSA)中， 充分溶解后配制成 25mg/ml的蛋白标准溶液。 取适量25mg/ml蛋白标准， 稀释至终浓度为0.5mg/ml。 0158 2)BCA工作液的配制 0159 根据样品数量， 按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液， 充分混匀。 BCA试剂B， 混匀， 配制成5.1ml BCA工作液。 0160 3)蛋白浓度检测 0161 将标准品按0、 1、 2、 4、 8、 12、 16、 20 l加到。

44、96孔板的标准品孔中， 加标准品稀释液补 足到20 l， 相当于标准品浓度分别为0、 0.025、 0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5mg/ml。 加适当体 积样品到96孔板的样品孔中。 如果样品不足20 l， 加标准品稀释液补足到20 l。 各孔加入 200 l BCA工作液， 37放置20-30分钟。 0162 4)读数及计算 0163 用酶标仪测定A562， 或540-595nm之间的波长的吸光度。 根据标准曲线和使用的样 品体积计算出样品的蛋白浓度。 0164 4.细胞迁移和侵袭能力检测 0165 利用transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力 说明书 8/。

45、14 页 11 CN 111455056 A 11 0166 1)侵袭实验 0167 a.以1:10浓度稀释基质胶， 并平铺于transwell小室上层， 37孵箱中静置6h。 0168 b.MDA-MB-231、 4T1细胞种于上层,每孔8104细胞， 并按照约20ug/ml量加入外泌 体， 种于孔径为8 m的tranwell培养板上层， 培养板下层盛装含有10血清的正常培养基， 然后继续培养细胞。 0169 c.细胞培养24h后， 用4多聚甲醛固定30min， 小心取出上室， 用湿棉签轻轻擦去 基质胶和聚碳酯膜上表面的细胞。 然后用0.5的结晶紫染色。 0170 2)迁移实验 0171 a。

46、.MDA-MB-231、 4T1细胞种于上层,每孔6104细胞， 并按照约20ug/ml量加入外泌 体， 种于孔径为8 m的tranwell培养板上层， 培养板下层盛装含有10血清的正常培养基， 然后继续培养细胞。 0172 b.细胞培养24h后， 用4多聚甲醛固定30min， 小心取出上室， 用湿棉签轻轻擦去 基质胶和聚碳酯膜上表面的细胞。 然后用0.5的结晶紫染色。 0173 3)计数及统计分析 0174 附着于聚碳酯膜下表面的细胞在高倍镜下(200倍)随机取6个视野计数， 取平均 数。 0175 实验结果： 0176 如说明书附图图8、 图9、 图10、 图11所示， 选用MDA-MB-。

47、231细胞以及4T1细胞， PA来 源外泌体与乳腺癌细胞共培养后， 乳腺癌细胞侵袭及迁移能力明显增强。 同时， BSA来源外 泌体较空白对照也能增强细胞侵袭及迁移能力。 0177 实施例6 0178 肥大脂肪细胞来源外泌体lncRNA芯片结果显示， lncRNA TUG1表达明显升高 0179 1.外泌体提取 0180 外泌体提取方法同实施例2 0181 2.芯片分析 0182 1)RNA质量控制 0183 使用NanoDrop ND-1000评估RNA量和质量。 RNA完整性通过标准变性凝胶电泳进行 评估。 0184 2)RNA标记和芯片杂交 0185 样品标记和芯片杂交根据Agilent 。

48、One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis实验方案(Agilent Technology)执行。 0186 a.从总RNA中移除rRNA后， 得到mRNA(mRNA-ONLYTM Eukaryotic mRNA Isolation Kit， Epicentre)。 0187 b.使用随机引物方法将每个样品放大并转录成带荧光的cRNA。 0188 c.使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)纯化标记的cRNAs， 并用NanoDrop ND-1000检测 浓度和活性。 0189 d.芯片杂交。 Arraystar小鼠LncRN。

49、A芯片V3.0芯片是为描述小鼠全局LncRNAs和蛋 白质编码转录本谱而设计的。 第三代LncRNA芯片能够检测约35,923个LncRNAs和24,881个 编码转录本。 说明书 9/14 页 12 CN 111455056 A 12 0190 e.洗涤、 固定并扫描杂交芯片(Agilent DNA Microarray Scanner(part number G2505C)。 0191 3.数据分析 0192 使用Agilent Feature Extraction软件(v11.0.1.1)获得芯片图， 并读值， 得到原 始数据。 使用GeneSpring GX v12.1软件(Agile。

50、nt Technologies)对原始数据进行 Quantile标准化和随后的数据处理。 原始数据标准化后经过筛选高质量探针(某探针在2个 样品中至少有1个被标记为Present或Marginal)进行进一步分析。 两组样品间具有统计学 意义的差异表达LncRNA或差异表达mRNA通过P-value/FDR筛选。 两个样品间差异表达 LncRNAs或差异表达mRNAs通过Fold Change筛选。 使用编写脚本进行层次聚类和关联分析。 0193 实验结果： 0194 如说明书附图图12所示， 肥大脂肪细胞来源外泌体中， lncRNA TUG1表达较正常脂 肪细胞来源外泌体表达明显升高， 升高。