一株米曲霉及其微生物菌剂和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010108147.8 (22)申请日 2020.02.21 (83)生物保藏信息 CGMCC No. 19262 2019.12.17 (71)申请人 山东省食品发酵工业研究设计院 地址 250013 山东省济南市历下区解放路 41号 (72)发明人 黄艳红张兴荣黄婧李峰 徐慧韩延雷李瑞国贺连智 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 郑平 (51)Int.Cl. C12N 1/14(2006.01) C12N 9/10(2006.01)。

2、 A23L 27/50(2016.01) C12R 1/69(2006.01) (54)发明名称 一株米曲霉及其微生物菌剂和应用 (57)摘要 本发明提供一株米曲霉及其微生物菌剂和 应用， 属于微生物技术领域。 该菌株已于2019年 12月17日保藏中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中 心 ， 其生物保藏号为CGMCC No.19262。 其可直接表达出-环糊精葡萄糖基 转移酶， 保证了食品工业发酵特别是酱油酿造的 工业化生产， 同时本发明生产-环糊精葡萄糖 基转移酶的方法还具有原料生物体生长周期短， 生产规模大， 成本低廉， 稳定性好等优点， 因此具 有重要的工业化应用前景和实际意义。。

3、 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图3页 CN 111304094 A 2020.06.19 CN 111304094 A 1.一株米曲霉(Aspergillus oryzae)D5， 该菌株已于2019年12月17日保藏中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 其生物保藏号为CGMCC No.19262。 2.一种微生物菌剂， 其特征在于， 所述微生物菌剂包括权利要求1所述米曲霉 (Aspergillus oryzae)D5或米曲霉(Aspergillus oryzae)D5的代谢物。 3.如权利要求2所述的微生物菌剂， 其特征在于， 微生物菌剂的剂型为水剂、 粉剂、 颗粒 。

4、剂。 4.如权利要求3所述的微生物菌剂， 其特征在于， 所述微生物菌剂的剂型为可湿性粉 剂、 水分散粒剂、 水悬浮剂。 5.如权利要求2所述的微生物菌剂， 其特征在于， 所述微生物菌剂中还包括食品加工工 业上可接受的辅料。 6.如权利要求5所述的微生物菌剂， 其特征在于， 所述食品加工工业上可接受的辅料选 自分散剂、 润湿剂、 崩解剂、 粘结剂、 抗冻剂、 增稠剂、 填料和溶剂中的一种或多种。 7.权利要求1所述米曲霉(Aspergillus oryzae)D5和/或权利要求2-6任一项所述微生 物菌剂在制备 -环糊精葡萄糖基转移酶中的应用。 8.一种生产 -环糊精葡萄糖基转移酶的方法， 其特。

5、征在于， 所述方法包括： 发酵权利要 求1所述米曲霉(Aspergillus oryzae)D5， 收集发酵产物， 纯化即得 -环糊精葡萄糖基转移 酶。 9.权利要求1所述米曲霉(Aspergillus oryzae)D5和/或权利要求2-6任一项所述微生 物菌剂在食品加工中的应用。 10.如权利要求9所述应用， 其特征在于， 所述食品加工包括但不限于酱油酿造。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111304094 A 2 一株米曲霉及其微生物菌剂和应用 技术领域 0001 本发明属于微生物技术领域， 具体涉及一株米曲霉及其微生物菌剂和应用。 背景技术 0002 本发明背景技术中公开的信息仅仅。

6、旨在增加对本发明的总体背景的理解， 而不必 然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有 技术。 0003 环糊精(Cyclodextrin， 简称CD)是由D-吡喃葡萄糖通过 -1， 4-糖苷键首尾相连而 成的环状低聚糖的总称， 通常含有6-12个葡萄糖基单元， 含量较多的为 -环糊精、 -环糊 精、 -环糊精。 其中 -环糊精的独特分子囊结构， 近年来在食品领域中得到广泛的开拓与 应用， 它可以转化食品的形态、 控制食品中香料及香味的挥发释放速度、 掩盖不良气味、 改 善食品的口感等。 0004 在调味品中 -环糊精的应用也得到了较多的关注， 特别是在酱油中。

7、 -环糊精同其 他糖类等共同构成酱油的体态和甜味， 同时能与酱油中香气成分、 维生素、 色素等形成相对 稳定的复合物， 在一定程度上减少其挥发和氧化， 还能够掩盖酱油发酵过程中产生的不快 气味， 改善酱油的气味和风味。 在酱油自然的发酵过程中 -环糊精的形成离不开 -环糊精 葡萄糖基转移酶， 该酶是由微生物产生， 目前进行研究并进行工业化生产常用的产酶菌株 多为芽孢杆菌， 如嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、 嗜碱芽胞杆菌 (B.alcalophilus)、 浸麻芽孢杆菌(B.macerans)、 凝结芽孢杆菌(B.coagulans)等等， 然而， 。

8、由于单一菌株的局限性和工业化生产复杂性等原因， 还需要寻找新的菌株用于高效生产 - 环糊精葡萄糖基转移酶。 发明内容 0005 针对现有技术中的不足， 本发明提供一株米曲霉及其微生物菌剂和应用， 经试验 验证， 本发明筛选分离获得的米曲霉D5具有良好的 -环糊精葡萄糖基转移酶产酶活性， 因 此极具大规模工业化生产及实际应用之价值。 0006 为实现上述技术目的， 本发明的技术方案如下： 0007 本发明的第一个方面， 提供一株米曲霉(Aspergillus oryzae)D5， 该菌株已于 2019年12月17日保藏中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址： 中国北京市 朝阳区北辰西路。

9、1号院3号)， 其生物保藏号为CGMCC No.19262。 0008 本发明的第二个方面， 提供一种微生物菌剂， 所述微生物菌剂包括上述米曲霉 (Aspergillus oryzae)D5或米曲霉(Aspergillus oryzae)D5的代谢物， 所述微生物菌剂具 有制备 -环糊精葡萄糖基转移酶的能力。 0009 作为优选， 微生物菌剂的剂型为水剂、 粉剂、 颗粒剂， 进一步优选为可湿性粉剂、 水 分散粒剂、 水悬浮剂； 0010 作为优选， 微生物菌剂中还包括食品加工工业上可接受的辅料， 所述食品加工工 说明书 1/5 页 3 CN 111304094 A 3 业上可接受的辅料选自分散。

10、剂、 润湿剂、 崩解剂、 粘结剂、 抗冻剂、 增稠剂、 填料和溶剂中的 一种或多种。 本发明对所述食品加工工业上可接受的辅料的来源等没有特殊限制， 一般采 用市售产品即可。 0011 本发明的第三个方面， 提供上述米曲霉(Aspergillus oryzae)D5和/或微生物菌 剂在制备 -环糊精葡萄糖基转移酶中的应用。 0012 本发明的第四个方面， 提供一种生产 -环糊精葡萄糖基转移酶的方法， 所述方法 包括： 发酵上述米曲霉(Aspergillus oryzae)D5， 收集发酵产物， 纯化即得 -环糊精葡萄糖 基转移酶。 0013 本发明的第五个方面， 提供上述米曲霉(Aspergil。

11、lus oryzae)D5和/或微生物菌 剂在食品加工中的应用， 所述食品加工包括但不限于酱油酿造。 0014 以上一个或多个技术方案的有益技术效果： 0015 首次筛选获得一株米曲霉(Aspergillus oryzae)D5， 其可直接表达出 -环糊精葡 萄糖基转移酶， 保证了食品工业发酵特别是酱油酿造的工业化生产， 同时生产 -环糊精葡 萄糖基转移酶的方法还具有原料生物体生长周期短， 生产规模大， 成本低廉， 稳定性好等优 点， 因此具有重要的工业化应用前景和实际意义。 附图说明 0016 构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解， 本发明的示 意性实施例及其说明用于解。

12、释本发明， 并不构成对本发明的不当限定。 0017 图1为本发明实施例中不同菌株酶活结果比较图。 0018 图2为本发明实施例中米曲霉D5的察氏培养基平板图和光镜图。 0019 图3为本发明实施例中米曲霉D5的系统发育树。 0020 图4为本发明实施例中PH对酶活的影响图。 0021 图5为本发明实施例中反应温度对酶活的影响图。 0022 图6为本发明实施例中金属离子对酶活的影响图。 具体实施方式 0023 应该指出， 以下详细说明都是例示性的， 旨在对本申请提供进一步的说明。 除非另 有指明， 本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常 理解的相同含义。 0024。

13、 需要注意的是， 这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式， 而非意图限制根 据本申请的示例性实施方式。 如在这里所使用的， 除非上下文另外明确指出， 否则单数形式 也意图包括复数形式， 此外， 还应当理解的是， 当在本说明书中使用术语 “包含” 和/或 “包 括” 时， 其指明存在特征、 步骤、 操作、 器件、 组件和/或它们的组合。 0025 现结合具体实例对本发明作进一步的说明， 以下实例仅是为了解释本发明， 并不 对其内容进行限定。 如果实施例中未注明的实验具体条件， 通常按照常规条件， 或按照试剂 公司所推荐的条件； 下述实施例中所用的试剂、 耗材等， 如无特殊说明， 均可从商业途径。

14、得 到。 0026 如前所述， 虽然 -环糊精葡萄糖基转移酶的产酶菌株已有报道， 然而， 由于单一菌 说明书 2/5 页 4 CN 111304094 A 4 株的局限性和工业化生产复杂性等原因， 还需要寻找新的菌株用于高效生产 -环糊精葡萄 糖基转移酶。 0027 有鉴于此， 本发明的一个具体实施方式中， 提供一株具有高产 -环糊精葡萄糖基 转移酶能力的米曲霉D5， 该菌株已于2019年12月17日保藏中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心(地址： 中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)， 其生物保藏号为CGMCC No.19262。 0028 本发明又一具体实施方式中， 提供一种微生物。

15、菌剂， 所述微生物菌剂包括上述米 曲霉(Aspergillus oryzae)D5或米曲霉(Aspergillus oryzae)D5的代谢物， 所述微生物菌 剂具有制备 -环糊精葡萄糖基转移酶的能力。 0029 本发明又一具体实施方式中， 微生物菌剂的剂型为水剂、 粉剂、 颗粒剂， 进一步优 选为可湿性粉剂、 水分散粒剂、 水悬浮剂； 0030 本发明又一具体实施方式中， 微生物菌剂中还包括食品加工工业上可接受的辅 料， 所述食品加工工业上可接受的辅料选自分散剂、 润湿剂、 崩解剂、 粘结剂、 抗冻剂、 增稠 剂、 填料和溶剂中的一种或多种。 本发明对所述食品加工工业上可接受的辅料的来源等没。

16、 有特殊限制， 一般采用市售产品即可。 0031 本发明又一具体实施方式中， 提供上述米曲霉(Aspergillus oryzae)D5和/或微 生物菌剂在制备 -环糊精葡萄糖基转移酶中的应用。 0032 本发明又一具体实施方式中， 提供一种生产 -环糊精葡萄糖基转移酶的方法， 所 述方法包括： 发酵上述米曲霉(Aspergillus oryzae)D5， 收集发酵产物， 纯化即得 -环糊精 葡萄糖基转移酶。 0033 其中， 发酵用培养基为： 酵母粉10g/L、 蛋白胨20g、 葡萄糖20g、 K2HPO41g、 MgSO4.7H2O 0.5g， 自然PH。 0034 本发明又一具体实施方式。

17、中， 提供上述米曲霉(Aspergillus oryzae)D5和/或微 生物菌剂在食品加工中的应用， 所述食品加工包括但不限于酱油酿造。 0035 为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案， 以下将结合具 体的实施例详细说明本发明的技术方案。 0036 实施例 0037 1材料及方法 0038 1.1材料与仪器 0039 1.1.1样品 0040 巧媳妇豆瓣酱 0041 1.1.2培养基种类 0042 1、 初筛培养基： 牛肉膏3.0g、 蛋白胨5.0g、 葡萄糖2.5g、 琼脂20g加水定容至1L， 121 灭菌20min。 0043 2、 复筛培养基/L： 可溶性淀粉10。

18、g、 蛋白胨5g， 酵母膏5g、 K2HPO40.2g、 MgSO4.7H2O 0.2g、 NaCO3 0.2g、 酚酞0.3g、 甲基橙0.1g、 琼脂20g， 121灭菌20min。 0044 3、 基础发酵培养基/L(同种子培养基)： 酵母粉10g/L、 蛋白胨20g、 葡萄糖20g、 K2HPO4 1g、 MgSO4.7H2O 0.5g， 自然PH， 分装到250ml锥形瓶中， 每瓶50ml， 121灭菌20min。 0045 1.1.2试剂 说明书 3/5 页 5 CN 111304094 A 5 0046 1.1.3仪器与设备 0047 1.2菌株筛选 0048 1.2.1菌株的筛。

19、选分离纯化 0049 无菌条件下称取10g豆瓣酱样品置于100ml无菌水中振荡培养1h， 梯度稀释涂布于 完全培养基上， 30培养48小时， 挑选不同形态的霉菌菌落进行划线直至形成单菌落， 将其 保存在斜面完全培养基上。 0050 1.2.2产 -环糊精葡萄糖基转移酶菌株的初筛 0051 将挑选好的菌株接种于 -环糊精葡萄糖基转移酶的筛选培养基上， 30培养2-3 天， 观察是否出现淡黄色接近无色的斑点。 在含有酚酞和甲基橙的平板内， 环糊精会将酚酞 包埋于疏水空腔内， 形成无色二价阴离子。 挑选出产颜色圈的菌株， 接种到斜面培养基中保 存。 0052 1.2.3产 -环糊精葡萄糖基转移酶菌株。

20、的初筛 0053 将菌株接种到种子培养基中发酵培养， 按照1的接种量接种到基础发酵培养基 中， 30、 150r/min培养72h， 5000r/min离心10min， 制取粗酶液， 测定酶活。 0054 1.3 -环糊精葡萄糖基转移酶酶活测定 0055 酶活定义： 使吸光度在单位时间内下降10的酶量定义为一个酶活单位， U/ml。 0056 测定方法： 取试管b加入0.25的马铃薯淀粉0.2ml和0.2ml PH 9.0的甘氨酸-氢 氧化钠缓冲液， 加入10 L的酶液， 40反应10min。 立即加入0.5ml的醋酸种植反应后， 加入 3ml0.005的碘液进行显色， 定容至10ml， 做三。

21、组平行。 取试管a不加酶液为对照， 蒸馏水为 空白， 在700nm下测定吸光度， 根据公式计算酶活。 0057 酶活计算公式： 0058 酶活(U/ml)(a-b)/a*1000*稀释倍数 0059 1.4粗酶性质的研究 0060 1.4.1不同PH对酶活性的影响 0061 配置不同PH的缓冲液， 调节酶液的PH分别为3.0、 3.5、 4.0、 4.5、 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 8.5、 9.0、 10.0， 在不同PH的反应体系中进行酶促反应， 测定 -环糊精葡萄糖 基转移酶的活性， 选择酶活最高的点来确定其最适PH。 0062 1.4.2不同。

22、温度对酶活性的影响 0063 在最适PH条件下， 设置反应温度为25、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 75， 测定 -环糊精葡萄糖基转移酶的活性， 选取酶活最高点来确定催化反应 最适温度。 0064 1.4.3不同离子对酶活性的影响 0065 在最适PH及温度的条件下， 添加Mn2+、 Fe2+、 Cu2+、 Pb2+、 Zn2+、 Ca2+6种离子溶液， 调节 离子在酶液中的浓度为2.5mmol/L， 测定 -环糊精葡萄糖基转移酶的活性， 确定其对酶促反 应的影响。 0066 2.结果 0067 2.1菌株筛选和鉴定 0068 通过平板筛选， 得到3。

23、株产特征圈的菌株， 分别命名为D1、 D2、 D5， 经发酵后测酶活， 最终选取D5为优化菌株。 说明书 4/5 页 6 CN 111304094 A 6 0069 同时， 对D5进行菌株鉴定， 通过菌落和菌株形态观察， 生理生化指标分析和18S rDNA序列进行测序， 并构建系统发育树， 最终确定D5菌株属于米曲霉(Aspergillus oryzae)。 0070 测序结果如下： 0071 GGAAGTTTCCTCCTGATCCGAGGTCACCTGGAAAGATGGTTTGCGTTCGGCAGCGCCGGCCGGGCCTA CACAGCGGGTGACATTCCCCCATACGCTCGAG。

24、GATCGGAGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTGGGGCCCGTCCCCCCCG GACAGGGGACAACGACCCTACCTTGAGCCGTGCTTGATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGAATGCCCCCCGGAA TACTGTGGGGCGCAATGTGCGTTCTTGACTCAATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACACTACTTATCGCATTTCG CTGCGTTCTTCATCGATGCAGGAACCGTTAAATCCTTTGTTGAAAGTTTTATTTGATTGCGATACACTCGTCTCAT ACTTCAATATATCTTACACACTTC。

25、GTGGTGTCTCCCGGGGGCGCGGCCCCGGCGCTGAGAGACCCAGGGGGCCCTG AATAGCGGGCCCGTAGTTTTAACTAAGGTACGTTGGACGTCGGTGGGAGGTTGGGCTTACTCTTTACCCTACCTTC CGCAATGATCCTTCCGCAGGTTTTGCTACGAAATTCATGTCCAGATTTTTTACTTCCA(SEQ ID No.1)。 0072 2.2粗酶性质研究结果 0073 2.2.1PH对酶活的影响 0074 由图4可以看出， 当反应体系的PH在3-8.5时， -环糊精葡萄糖基转移酶的酶活随 着PH的升高而升高， 当反应。

26、体系的PH超过8.5时酶活开始下降， 这表明反应液的PH太高不利 于 -环糊精葡萄糖基转移酶的催化降解反应， 以此确定其酶解的最适PH为8.5。 0075 2.2.2反应温度对酶活的影响 0076 在最适PH8.5的条件下测定温度对 -环糊精葡萄糖基转移酶活力的影响， 不同的 温度酶的催化反应能力不同， 如图5所示， 在温度25-50时， 酶的催化反应能力随着温度的 升高而升高， 50时酶活达到最高点， 之后酶活开始下降。 随着温度的升高的部分酶开始失 活以此， 选取50为酶的最佳反应温度。 0077 2.2.3金属离子对酶活的影响 0078 如图6所示， 在酶液中分别添加不同的金属离子， 保。

27、持其浓度为2.5mmol/L， 酶活测 定结果表明这几种金属离子都对 -环糊精葡萄糖基转移酶有一定的抑制作用。 特别是Pb2+ 对其抑制作用明显， 不利于其催化反应。 0079 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说明书 5/5 页 7 CN 111304094 A 7 SEQUENCE LISTING 山东省食品发酵工业研究设计院 一株米曲霉及其微生物菌剂和应用 1 PatentIn version 3.3。

28、 1 582 DNA 米曲霉D5 18S rDNA 1 ggaagtttcc tcctgatccg aggtcacctg gaaagatggt ttgcgttcgg cagcgccggc 60 cgggcctaca cagcgggtga cattccccca tacgctcgag gatcggagcg gtgccgccgc 120 tgcctttggg gcccgtcccc cccggacagg ggacaacgac cctaccttga gccgtgcttg 180 atgggcagca atgacgctcg gacaggaatg ccccccggaa tactgtgggg cgcaatgt。

29、gc 240 gttcttgact caatgattca cggaattctg caattcacac tacttatcgc atttcgctgc 300 gttcttcatc gatgcaggaa ccgttaaatc ctttgttgaa agttttattt gattgcgata 360 cactcgtctc atacttcaat atatcttaca cacttcgtgg tgtctcccgg gggcgcggcc 420 ccggcgctga gagacccagg gggccctgaa tagcgggccc gtagttttaa ctaaggtacg 480 ttggacgtcg gtgggaggtt gggcttactc tttaccctac cttccgcaat gatccttccg 540 caggttttgc tacgaaattc atgtccagat tttttacttc ca 582 序列表 1/1 页 8 CN 111304094 A 8 图1 图2 图3 说明书附图 1/3 页 9 CN 111304094 A 9 图4 图5 说明书附图 2/3 页 10 CN 111304094 A 10 图6 说明书附图 3/3 页 11 CN 111304094 A 11 。