基因Bmal1在制备检测治疗炎症性肠病的产品中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010144540.2 (22)申请日 2020.03.04 (71)申请人 苏州大学 地址 215000 江苏省苏州市吴中区石湖西 路188号 (72)发明人 李建明沈彤刘靖琳王楚怡 优鲁吐孜阿依日夏提程天宇 朱世祺 (74)专利代理机构 苏州市中南伟业知识产权代 理事务所(普通合伙) 32257 代理人 王玉仙 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) G01N 33/68(2006.01) (54)发明名称 基因Bmal1在制备检测治疗炎症性肠。

2、病的产 品中的应用 (57)摘要 本发明公开了基因Bmal1在制备检测治疗炎 症性肠病的产品中的应用， 属于生物医药技术领 域。 本发明提出一种基因Bmal1在制备检测治疗 炎症性肠病的产品中的应用。 并从肠上皮淋巴细 胞的角度发现某种高表达PDL1的Breg细胞能抑 制肠炎， 生物钟异常会无法调控此类Breg细胞， 所以促进肠炎的发生发展。 且我们进一步阐明了 Bmal1基因调控该类细胞的分子机制， 为研发靶 向Bmal1基因的药物， 治疗临床炎症性肠病提供 更多的依据。 权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 附图7页 CN 111304316 A 2020.06.19 CN 111304。

3、316 A 1.一种基因Bmal1在制备检测或治疗炎症性肠病的产品中的应用。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述的基因Bmal1的cDNA的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示。 3.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述的基因Bmal1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 4.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述的检测炎症性肠病的产品为定量检测 基因Bmal1表达量和IL-33含量的试剂盒。 5.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述的治疗炎症性肠病的产品为靶向基因 Bmal1的药物。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述的靶。

4、向基因Bmal1药物通过上调基因 Bmal1表达， 增加肠上皮淋巴细胞中表达PDL1的Breg细胞。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 所述的基因Bmal1调控IL-33转录， 进一步 调控Breg细胞表达PDL1。 8.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述的药物通过注射的方式进行给药。 9.一种检测炎症性肠病的试剂盒， 其特征在于， 包括检测基因Bmal1表达量的试剂和检 测IL-33含量的试剂。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111304316 A 2 基因Bmal1在制备检测治疗炎症性肠病的产品中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种基因Bmal1在制备检测。

5、治疗炎症性肠病的产品中的应用， 属于生 物医药技术领域。 背景技术 0002 溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)等炎症性肠病(IBD)是胃肠道(GI)的慢性炎症 性疾病。 IBD的病因尚不清楚。 了解IBD的分子病理学对于制定新的治疗计划很重要。 肠道稳 态的维持包括三个因素： 肠道菌群， 肠道上皮和宿主的免疫系统。 一旦某一方面发生故障， 便会引起炎症性肠病。 0003 众所周知， B细胞的主要功能是产生抗体， 呈递抗原并分泌细胞因子。 据报道B细胞 参与自身免疫， 比如自身免疫性脑脊髓炎， 关节炎。 B细胞在肠道炎症中的报道也有： Mizoguchi A等人2002年报道， 产生IL-。

6、10的B细胞亚群(经典Breg细胞)可以通过上调IL-1 和激活STAT3途径来抑制肠道炎症过程。 同时B细胞可以特异性分化为浆细胞。 大多数肠道 浆细胞会分泌IgA(sIgA)， 可作为保护上皮免于病原微生物的屏障。 0004 哺乳动物的昼夜稳态由位于大脑上裂眼上核的中央时钟维持。 时钟由昼夜节律基 因操纵。 分子时钟的当前模型基于bHLH-高碘酸席夫转录因子Bmal1和Clock的循环表达。 转 录因子Bmal1和Clock形成中央振荡环的核心。 Bmal1： clock异源二聚体结合E-box位点并驱 动生物钟基因Per1-3， Cry1-2和Rev-Erb(a和b)的表达， 从而建立2。

7、4小时周期。 昼夜节律是 大多数生理过程的重要驱动力， 因为它们使身体与环境中有规律地发生的日常变化保持一 致。 昼夜节律的改变会严重恶化动物模型中结肠炎的发展， 人体的初步研究表明， IBD患者 的睡眠方式改变的风险增加。 此外， 有关于昼夜节律基因在淋巴细胞中的功能的报道。 例 如， 据报道B细胞和T细胞均表达分子钟机制的核心成分。 Bmal1基因的B细胞特异性缺失破 坏了骨髓中B细胞的成熟。 T细胞中昼夜节律基因的缺失会影响淋巴细胞归巢。 然而， 目前尚 不清楚淋巴细胞中的昼夜节律基因是否与炎症性肠病的发生和发展有关。 发明内容 0005 为解决上述问题， 本发明从肠上皮淋巴细胞的角度发。

8、现某种高表达PDL1的Breg细 胞能抑制肠炎， 生物钟异常会无法调控此类Breg细胞， 所以促进肠炎的发生发展。 且我们进 一步阐明了Bmal1基因调控该类细胞的分子机制。 进而提出一种基因Bmal1在制备检测治疗 炎症性肠病的产品中的应用。 0006 本发明的第一个目的是提供一种基因Bmal1在制备检测或治疗炎症性肠病的产品 中的应用。 0007 进一步地， 所述的基因Bmal1的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 0008 进一步地， 所述的基因Bmal1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 0009 进一步地， 所述的检测炎症性肠病的产品为定量检测基因Bmal1表。

9、达量和IL-33含 量的试剂盒。 说明书 1/3 页 3 CN 111304316 A 3 0010 进一步地， 所述的治疗炎症性肠病的产品为靶向基因Bmal1的药物。 0011 进一步地， 所述的靶向基因Bmal1药物通过上调基因Bmal1表达， 增加肠上皮淋巴 细胞中表达PDL1的Breg细胞。 0012 进一步地， 所述的基因Bmal1调控IL-33转录， 进一步调控Breg细胞表达PDL1。 0013 进一步地， 所述的药物通过注射的方式进行给药。 0014 本发明的第二个目的是提供一种检测炎症性肠病的试剂盒， 包括检测基因Bmal1 表达量的试剂和检测IL-33含量的试剂。 0015。

10、 本发明的有益效果： 0016 本发明提出一种基因Bmal1在制备检测治疗炎症性肠病的产品中的应用。 并从肠 上皮淋巴细胞的角度发现某种高表达PDL1的Breg细胞能抑制肠炎， 生物钟异常会无法调控 此类Breg细胞， 所以促进肠炎的发生发展。 且我们进一步阐明了Bmal1基因调控该类细胞的 分子机制， 为研发靶向Bmal1基因的药物， 治疗临床炎症性肠病提供更多的依据。 附图说明 0017 图1为Bmal1/-小鼠和对照小鼠在肠炎发生前后结直肠大体观； 0018 图2为Bmal1/-小鼠和对照小鼠在肠炎发生前后的体重下降曲线和结直肠重量与 长度比值； 及其结直肠炎症情况； 0019 图3为B。

11、mal1/-小鼠和对照小鼠在肠炎发生前后HE图； 0020 图4为Bmal1/-小鼠和对照小鼠在肠炎发生前后结直肠炎症情况评分， 其中A为炎 症范围评分， B为炎症程度评分， C为隐窝损伤评分； 0021 图5为肠炎时Bmal1调控一类具有缓和肠炎的Breg细胞； 0022 图6为野生型(WT)B细胞回输给Bmal1-/-肠炎小鼠后， 能有效缓解肠炎； (A)大体 观； (B)7天体重变化； (C)HE； 0023 图7为Bmal1-/-B细胞回输给野生型(WT)肠炎小鼠后， 能加速肠炎。 (A)大体观； (B) 7天体重变化； (C)HE； 0024 图8为肠炎时， Bmal1-/-小鼠肠上。

12、皮浸润淋巴细胞的特性为高表达PDL1； 0025 图9为Bmal1和Clock复合体通过结合IL-33， 在转录水平正调控IL-33的表达， (A) IL-33的报告基因检测结果； (B)CHIP实验检测结果； 0026 图10为IL-33通过Bmal1在B细胞中促进PDL1的表达。 具体实施方式 0027 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明， 以使本领域的技术人员可以 更好地理解本发明并能予以实施， 但所举实施例不作为对本发明的限定。 0028 实施例1： Bmal1缺失(Bmal1-/-)的小鼠易感炎症性肠病 0029 我们用1的DSS诱导5对Bmal1-/-的小鼠7天， 与同等。

13、诱导的野生型相比较。 我们 发现， Bmal1-/-小鼠在第四天体重明显下降(图1和图2)， HE结果显示肠炎发生时Bmal1-/- 小鼠肠上皮隐窝几乎全部消失， 而对照(WT)小鼠肠上皮50的隐窝只脱落了1/3， 甚至不受 影响(图3和图4)。 0030 实施例2： Bmal1调控小鼠肠道高表达PDL1的Breg(B220+CD5+CD1d+)细胞， 且其与 说明书 2/3 页 4 CN 111304316 A 4 肠炎发生密切相关 0031 我们进一步提取本底和肠炎状态下的Bmal1-/-小鼠及其对照小鼠的肠上皮淋巴 细胞， 监测发现其中的Breg(B220+CD5+CD1d+)细胞在对照。

14、小鼠中有变化， 肠炎发生时， Breg 细胞显著下降， 而Bmal1缺失的小鼠Breg细胞比例在肠炎发生前后表达量很低， 且没有显著 的变化(图5A)。 我们检测到该B细胞可以分泌IL-10， IL-10在Bmal1缺失小鼠及对照小鼠肠 炎时均减少(图5B)。 我们确定该分泌IL-10的B细胞为有功能的Breg细胞。 我们将野生型小 鼠的B细胞分离出通过尾静脉注射入Bmal1缺失的小鼠体内， 7天诱导肠炎期间， 分别在第1， 3， 5天注射WT的B细胞， 发现Bmal1缺失小鼠的肠炎情况较未接受B细胞的Bmal1缺失小鼠减 轻了(图6A-C)。 相反， 我们将Bmal1缺失小鼠的B细胞分离出并。

15、通过尾静脉注射入对照小鼠 体内， 7天诱导肠炎期间， 分别在第1， 3， 5天注射Bmal1缺失的B细胞， 发现对照小鼠肠炎情况 较未接受B细胞的野生型小鼠更严重了(图7A-C)。 我们进一步检测对照小鼠和Bmal1缺失小 鼠的肠上皮Breg细胞的特性， 发现野生型的Breg细胞较Bmal1缺失的小鼠高表达PDL1(图 8)。 0032 实施例3： Bmal1直接作用并调控IL-33的转录 0033 我们通过报告基因检测转录调控因子Bmal1和clock的复合物对IL-33的调控作 用， 结果显示， 转录因子Bmal1和clock复合体会增加IL-33的转录水平表达， 随着复合体的 加倍， I。

16、L-33的表达水平大约三倍(图9A)， 而突变的IL-33不受Bmal1和clock复合体的调控。 同时， 我们用CHIP实验检测发现Bmal1通过E-box结合位点结合在IL-33序列上(图9B)。 0034 实施例4： B细胞中Bmal1通过上调IL-33促进PDL1的表达 0035 我们分离出Bmal1缺失小鼠和对照小鼠的脾脏B淋巴细胞， 激活培养3天后， 加入细 胞因子IL-33， 检测PDL1的表达。 发现， 本底Bmal1缺失的组别中PDL1的表达低于对照组， IL- 33的作用使得Bmal1缺失组表达PDL1显著增加， 大约是本底Bmal1缺失组的3倍， 而此时对照 组中IL-3。

17、3的作用与对照本底水平比没有差异(图10)。 推测IL-33会通过Bmal1促进PDL1的 表达。 0036 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例， 本发明的保护范 围不限于此。 本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换， 均在本发明 的保护范围之内。 本发明的保护范围以权利要求书为准。 说明书 3/3 页 5 CN 111304316 A 5 序列表 苏州大学 基因Bmal1在制备检测治疗炎症性肠病的产品中的应用 2 PatentIn version 3.3 1 390 DNA （人工序列） 1 ggtggtgctg gctagagtgt atacgtttgg。

18、 acccaagctt aacttttcca atgtggaatc 60 ctgggccttc attggttttt ggaagaagct gaccgcctga aaagaaatta taaaacatga 120 aaatcgcttt gaggtgacca agtccagagg cccctaactc ctcccaagct ggatctgggg 180 tgtaagaact gtgacttcag atcatccaat ggcagaccag agaatggaca tttcttcaac 240 catcagtgat ttcatgtccc cgggccccac cgacctgctt tccagctct。

19、c ttggtaccag 300 tggtgtggat tgcaaccgca aacggaaagg cagctccact gactaccagt tagaatatac 360 agaacaccaa ggaaggataa aaaatgcaag 390 2 60 PRT （人工序列） 2 Met Ala Asp Gln Arg Met Asp Ile Ser Ser Thr Ile Ser Asp Phe Met 1 5 10 15 Ser Pro Gly Pro Thr Asp Leu Leu Ser Ser Ser Leu Gly Thr Ser Gly 20 25 30 Val Asp Cys。

20、 Asn Arg Lys Arg Lys Gly Ser Ser Thr Asp Tyr Gln Leu 35 40 45 Glu Tyr Thr Glu His Gln Gly Arg Ile Lys Asn Ala 50 55 60 序列表 1/1 页 6 CN 111304316 A 6 图1 图2 说明书附图 1/7 页 7 CN 111304316 A 7 图3 说明书附图 2/7 页 8 CN 111304316 A 8 图4 说明书附图 3/7 页 9 CN 111304316 A 9 图5 说明书附图 4/7 页 10 CN 111304316 A 10 图6 说明书附图 5/7 页 11 CN 111304316 A 11 图7 说明书附图 6/7 页 12 CN 111304316 A 12 图8 图9 图10 说明书附图 7/7 页 13 CN 111304316 A 13 。