酶标二抗HRP/羊抗鼠IgGZIF-L及其制备方法和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010090765.4 (22)申请日 2020.02.13 (71)申请人 江苏大学 地址 212013 江苏省镇江市京口区学府路 301号 (72)发明人 刘振江王欣蔚郭艳国冯建坤 (51)Int.Cl. C07K 16/44(2006.01) G01N 33/535(2006.01) G01N 33/543(2006.01) (54)发明名称 一种酶标二抗HRP/羊抗鼠IgGZIF-L及其制 备方法和应用 (57)摘要 本发明涉及一种酶标二抗HRP/羊抗鼠IgG ZI。

2、F-L及其制备方法和应用， 属于免疫及生物检 测技术领域； 本发明以ZIF-L为金属有机骨架， 将 辣根过氧化物酶HRP和羊抗小鼠IgG包覆， 得到酶 标二抗HRP/羊抗鼠IgGZIF-L， 再通过高灵敏性 的酶标二抗建立ELISA免疫分析方法测试玉米中 的ZEN。 本发明得到的酶标二抗HRP/羊抗鼠IgG ZIF-L可增强生物酶和抗体的稳定性， 同时代替 传统的酶标二抗， 可降低IC20值， 提高其灵敏度， 与传统的仪器分析方法相比， 该免疫分析方法检 测玉米中的玉米赤霉烯酮操作简单， 成本低廉， 更适于推广。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 111320697 A 2020.0。

3、6.23 CN 111320697 A 1.一种酶标二抗， 记为HRP/羊抗鼠IgGZIF-L， 其特征在于， 所述二抗识别玉米赤霉烯 酮单克隆抗体， 玉米赤霉烯酮抗体特异性识别玉米赤霉烯酮。 2.一种酶标二抗HRP/羊抗鼠IgGZIF-L的制备方法， 包括： 步骤1： 取辣根过氧化物HRP和Ab2 （羊抗鼠IgG） 加入到六水合硝酸锌溶液中， 混合均匀 并温和振荡， 得到混合溶液； 步骤2： 将2-甲基咪唑溶液快速加入步骤1得到的混合溶液中， 形成乳白色溶液， 在室温 条件下搅拌一定时间后， 离心洗涤， 得到沉淀物， 即为新型酶标二抗复合物， 记为HRP/羊抗 鼠IgGZIF-L。 3.根据。

4、权利要求2所述的一种酶标二抗HRP/羊抗鼠IgGZIF-L的制备方法， 其特征在 于， 步骤1中所述的辣根过氧化物HRP、 Ab2 （羊抗鼠IgG） 和六水合硝酸锌的质量比为1:1:20， 其中所述六水合硝酸锌的浓度为0.2 mol/L。 4.根据权利要求2所述的一种酶标二抗HRP/羊抗鼠IgGZIF-L的制备方法， 其特征在 于， 步骤1中所述振荡指数为100-500次/分钟。 5.根据权利要求2所述的一种酶标二抗HRP/羊抗鼠IgGZIF-L的制备方法， 其特征在 于， 步骤2中所述的2-甲基咪唑溶液与溶液B的体积比为1:1， 所述2-甲基咪唑溶液的浓度为 1.4-4.8 mol/L。 6。

5、.根据权利要求2所述的一种酶标二抗HRP/羊抗鼠IgGZIF-L的制备方法， 其特征在 于， 步骤2中所述的搅拌时间为2h。 7.一种酶标二抗HRP/羊抗鼠IgGZIF-L在检测玉米赤霉烯酮中的用途。 8.一种酶标二抗HRP/羊抗鼠IgGZIF-L在制备检测玉米赤霉烯酮产品中的用途。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111320697 A 2 一种酶标二抗HRP/羊抗鼠IgGZIF-L及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种酶标二抗HRP/羊抗鼠IgGZIF-L及其制备方法和应用， 属于免疫 及生物检测技术领域。 背景技术 0002 玉米赤霉烯酮 （ZEN） 为一种白色晶体， 。

6、又称F-2毒素， 是由禾谷镰刀菌、 三线镰刀 菌、 黄色镰孢、 木贼镰孢、 半裸镰孢和茄病镰孢等菌种产生的有毒代谢物。 在世界各地各种 粮谷与饲料中均有存在， 主要污染玉米、 麦类、 谷物等， 使农业经济受到严重影响， 而且还会 带来严重的食品安全问题。 同时ZEN对动物也有一定的危害， 研究发现玉米赤霉烯酮及其代 谢物具有类似雌激素的作用， 动物摄食后会产生亢进毒素性反应， 引起流产、 死胎、 返情等 生殖异常现象， 严重则威胁到人类的健康。 因此， 对ZEN的检测显得十分必要。 0003 现有的分析方法主要有色谱法和免疫法等， 由于仪器方法存在许多不足之处， 免 疫分析方法成为一种受欢迎的。

7、分析方法， 但是现有免疫法中HRP和羊抗鼠IgG直接共价偶联 制备酶标二抗用于酶联免疫分析方法， 这种方式容易引起失活率高和试剂昂贵等， 导致方 法的检测线高。 因此， 发展一种简单和稳定的制备酶标二抗方法非常有意义。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是克服现有的技术缺陷， 提供一种新型酶标二抗 （HRP/ 羊抗鼠IgGZIF-L） 及其制备方法和应用。 0005 本发明中， 将直接结合的HRP和羊抗鼠IgG分别嵌入石类咪唑骨架 （ZIF-L） 中， ZIF- L腔可通过限制酶的构象变化来抑制酶分子的变性， 增强酶活和抗体的稳定性， 并代替直接 结合的酶标二抗 （HRP-羊抗鼠IgG。

8、） 建立准确、 快速、 灵敏地检测ZEN的免疫分析方法。 0006 本发明首先提供一种酶标二抗， 记为HRP/羊抗鼠IgGZIF-L， 所述二抗识别玉米赤 霉烯酮单克隆抗体， 玉米赤霉烯酮抗体特异性识别玉米赤霉烯酮； 所述二抗HRP/IgGZIF-L 与ZIF-L显示了相同的结构与形态， 均呈现叶子形态。 0007 为解决上述技术问题， 本发明提供了如下的技术方案： 一种酶标二抗HRP/羊抗鼠IgGZIF-L制备方法， 包括： 步骤1： 取一定量的辣根过氧化物 （HRP） 和Ab2（羊抗鼠IgG） 加入一定浓度的六水合硝酸 锌溶液内， 混合均匀并温和振荡， 得到混合溶液。 0008 步骤2： 。

9、将一定浓度的2-甲基咪唑溶液快速加入步骤1得到的混合溶液中， 形成乳 白色溶液， 在室温条件下搅拌一定时间， 离心洗涤， 得到沉淀物， 为新型酶标二抗复合物， 记 为HRP/羊抗鼠IgGZIF-L， 并置于4 储存备用。 0009 优选的， 步骤1中， 辣根过氧化物 （HRP） 、 Ab2（羊抗鼠IgG） 和六水合硝酸锌的质量比 为1:1:20， 所述六水合硝酸锌的浓度为0.2 mol/L， 所述振荡指数为100-500次/分钟。 0010 优选的， 步骤2中， 2-甲基咪唑溶液与步骤1得到的混合溶液的体积比为1:1， 所述 2-甲基咪唑溶液的浓度为1.4-4.8 mol/L， 所述搅拌时间为。

10、2h。 ； 进一步优选的， 所述2-甲基 说明书 1/5 页 3 CN 111320697 A 3 咪唑溶液的浓度为1.4 mol/L。 0011 本发明还提供所述酶标二抗的应用， 用于酶联免疫中以检测ZEN。 0012 本发明还提供所述检测ZEN的检测方法， 采用所述的新型酶标二抗， 具体的测试方 法如下： 建立ELISA免疫分析方法检测ZEN， 抗原包被96微孔板， 放入4冰箱过夜， 洗板后， 封闭96孔板， 洗板后， 加入玉米赤霉烯酮标准品和玉米赤霉烯酮单抗， 温育一段时间后洗 板， 加入新型酶标二抗复合物， 反应一段时间后， 洗板加入底物液和终止液， 进行仪器测量。 0013 本发明的。

11、有益效果： 为增强酶活和抗体的稳定性以及提高免疫分析方法的灵敏度， 本发明中将HRP和羊抗 鼠IgG嵌入沸石类咪唑骨架ZIFs， ZIFs是MOFs材料的一个子类， 由二甲金属离子 （Zn2+、 Co2 +等） 与咪唑基配位体通过络合作用， 以四配位方式组装形成的纳米多孔晶体材料。 ZIFs不 仅具有结晶度高， 比表面积大以及结构规整等优点， 还具备传统沸石高热稳定性与高化学 稳定性。 0014 （1） 开发的酶标二抗HRP/羊抗鼠IgGZIF-L， 即将辣根过氧化物酶 （HRP） 和羊抗小 鼠IgG嵌入沸石类咪唑骨架ZIF-L， 在高温与有机溶剂条件下， 仍能保持约80%的酶活和约 74%的。

12、抗体结合能力， 与传统的酶标二抗 （酶活低于25%， 抗体结合能力低于35%） 相比， 增强 了HRP和羊抗鼠IgG耐热性和化学抗性， 扩大应用范围， 降低成本。 0015 （2） 将新型的酶标二抗HRP/羊抗鼠 IgGZIF-L代替传统的酶标二抗 （HRP-IgG） 应 用于酶联免疫检测方法 （ELISA） 中， 降低了IC20值， 灵敏度提高了126倍。 0016 （3） 与传统的仪器分析方法相比， 该免疫分析方法检测玉米中的玉米赤霉烯酮操 作简单， 成本低廉。 附图说明 0017 图1是高灵敏性酶标二抗HRP/IgGZIF-L的制备过程及在ZEN检测中应用的示意 图； 图2是ZIF-L和。

13、HRP/IgGZIF-L的透射电镜图； 图3是纯ZIF-L、 HRP/IgGZIF-L以及标准ZIF-L的X射线衍射图； 图4是HRP-RhB （图4A） 、 IgG-FITC （图4B） 和HRP-RhB/IgG-FITCZIF-L （图4C） 的荧光倒置 显微镜图像； 图5是用本发明制备的酶标二抗建立酶联免疫分析法 （ELISA） 检测玉米赤霉烯酮 （ZEN) 的标准曲线图； 图6是传统酶标二抗建立酶联免疫分析法 （ELISA） 检测玉米赤霉烯酮 （ZEN)的标准曲线 图。 具体实施方式 0018 为了使本发明的目的、 技术方案和有益技术效果更加清晰， 以下结合实施例， 对本 发明进行进一。

14、步详细说明。 应当理解的是， 本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释发明， 并非限定本发明的保护范围， 本发明中的参数、 比例等通过常规变换均属于本发明的保护 范围。 0019 实施例中除特殊说明外， 均为本领域常规试剂和方法步骤。 说明书 2/5 页 4 CN 111320697 A 4 0020 实施例中HRP、 羊抗鼠 IgG、 酶标二抗 （HRP-IgG） 、 TMB均购于 Life Sciences Research Products & Services； 玉米赤霉烯酮包被原、 玉米赤霉烯酮单克隆抗体、 玉米赤 霉烯酮标准品购于Fermentek Ltd。 0021 实施例1： （1。

15、） 金属有机骨架ZIF-L的制备 将六水合硝酸锌溶于0.5 ml的去离子水中得到浓度为200 mM的六水合硝酸锌溶液， 将2-甲基咪唑溶于0.5 ml的去离子水中得到浓度为1.4 M的2-甲基咪唑溶液， 待溶解完迅 速将2-甲基咪唑溶液倒入六水合硝酸锌溶液中， 形成乳白色溶液， 并在室温下搅拌2 h， 随 后离心洗涤3次， 得到沉淀物， 置于4 下储存备用。 0022 （2） 高灵敏性酶标二抗复合物HRP/羊抗鼠IgGZIF-L的制备 将2-甲基咪唑溶于0.5 ml的去离子水中得到浓度为1.4 M的2-甲基咪唑溶液； 在0.5 ml六水合硝酸锌溶液 （浓度为200 mM） 中加入1.6 mg的。

16、辣根过氧化物酶 （HRP） 和 75 L的Ab2（羊抗鼠IgG） 混匀得到混合溶液， 将得到的混合溶液温和振荡15分钟后， 迅速将 2-甲基咪唑溶液倒入混合溶液中， 形成乳白色溶液， 并在室温下搅拌2 h， 随后离心洗涤3 次， 得到沉淀物， 置于4 下储存备用。 由二甲金属离子 （Zn2+、 Co2+等） 与咪唑基配位体通过 络合作用， 形成ZIF-L纳米晶体结构， 对HRP和羊抗鼠IgG形成保护作用， 增强酶活与抗体结 合的能力。 0023 由图2所示， 透射电镜表明， HRP/IgGZIF-L与ZIF-L显示了相同的结构与形态， 均 呈现叶子形态。 0024 由图3所示， 通过X射线衍射。

17、进行表征， HRP/IgGZIF-L和ZIF-L的X射线衍射图谱与 模拟的ZIF-L图谱几乎相同， 表明晶体的形成和HRP与羊抗鼠IgG的掺入对ZIF-L的晶体结构 影响可以忽略不计， 同时也证明得到了酶标二抗HRP/IgGZIF-L。 0025 由图4所示， 为了证实HRP和羊抗鼠IgG确实嵌在ZIF-L中， 引入了罗丹明B （RhB） 标 记的HRP和异硫氰酸 （FITC） 标记的羊抗鼠IgG代替HRP和羊抗鼠IgG合成HRP-RhB/IgG-FITC ZIF-L； 荧光倒置显微镜清楚地观察到了荧光显色结果为红色点和绿色点。 在图4A和4B中， 在555nm处观察到HRP-RhB/IgG-。

18、FITCZIF-L的激发， 在460nm处观察到HRP-RhB的红色荧光， 而IgG-FITC的绿色荧光。 此外， 图4C的合并图像表明HRP和羊抗鼠IgG成功地嵌在ZIF-L中。 0026 （3） 本发明制备的高灵敏性酶标二抗复合物在高温和有机溶剂下的耐热性和化学 抗性 HRP/IgGZIF-L和游离HRP在75下水浴1h， 由ZIF-L保护的HRP生物复合物基本上保持 了HRP的高生物活性 （约80%） 。 相比之下， 未受保护的HRP在75下处理1h的生物活性仅为 21%。 同样的条件下， ELISA方法显示游离的羊抗鼠IgG几乎丧失捕获能力 （小于35%） ， 而ZIF- L中的保护的。

19、羊抗鼠 IgG与未经处理的游离的羊抗鼠IgG具有相似的结合能力 （大于74%） 。 0027 在进一步的实验中， 单独的HRP、 羊抗鼠 IgG和HRP/IgGZIF-L分别在有机溶剂甲 醇、 DMSO和DMF中浸泡1h。 自由HRP在甲醇、 DMSO和DMF存在下表现出严重的酶失活 （超过 75%） ， 而嵌入ZIF-L的HRP则表现出较强的热保护作用在这些条件下， HRP/IgGZIF-L中的羊 抗鼠IgG活性基本上保持了它们的结合能力 （约80%由ELISA测定） 。 相比之下， 暴露于有机溶 剂后， 游离的羊抗鼠IgG几乎失去其结合能力 （活性低于36%） 。 0028 实施例2： 高。

20、灵敏性酶标二抗复合物HRP/羊抗鼠IgGZIF-L的制备 说明书 3/5 页 5 CN 111320697 A 5 将2-甲基咪唑溶于0.5 mL的去离子水中得到浓度为3.2 M 的2-甲基咪唑溶液； 在 0.5 mL六水合硝酸锌溶液 （浓度为200 mM） 中加入 1.6 mg的辣根过氧化物酶 （HRP） 和 75 L的Ab2 （羊抗鼠IgG） 混匀得到混合溶液， 将得到的混合溶液温和振荡15分钟后， 迅 速将2-甲基咪唑溶液倒入混合溶液中， 形成乳白色溶液， 并在室温下搅拌 2 h， 随后离心洗 涤3次， 得到沉淀物， 置于4 下储存备用。 由二甲金属离子 （Zn2+、 Co2+等） 与咪。

21、唑基配位体 通过络合作用， 形成ZIF-L纳米晶体结构， 对HRP和羊抗鼠IgG形成保护作用， 增强酶活与抗 体结合的能力。 0029 同样的， 经过透射电镜、 X射线衍射、 荧光倒置显微镜表征结果等， 表明本发明的酶 标二抗制备成功。 0030 实施例3： 高灵敏性酶标二抗复合物HRP/羊抗鼠IgGZIF-L的制备 将2-甲基咪唑溶于 0.5 mL的去离子水中得到浓度为4.8 M的2-甲基咪唑溶液； 在 0.5 mL六水合硝酸锌溶液 （浓度为 200 mM） 中加入 1.6 mg的辣根过氧化物酶 （HRP） 和 75 L的Ab2 （羊抗鼠IgG） 混匀得到混合溶液， 将得到的混合溶液温和振荡。

22、15分钟 后， 迅速将2-甲基咪唑溶液倒入混合溶液中， 形成乳白色溶液， 并在室温下搅拌 2 h， 随后 离心洗涤3次， 得到沉淀物， 置于4 下储存备用。 由二甲金属离子 （Zn2+、 Co2+等） 与咪唑基 配位体通过络合作用， 形成ZIF-L纳米晶体结构， 对HRP和羊抗鼠IgG形成保护作用， 增强酶 活与抗体结合的能力。 0031 同样的， 经过透射电镜、 X射线衍射、 荧光倒置显微镜表征结果等， 表明本发明的酶 标二抗制备成功。 0032 实施例4： 高灵敏性的酶标二抗复合物应用于检测玉米赤霉烯酮 （ZEN） 免疫检测方 法 （1） 包被： 用CBS （胱硫醚 合成酶） 缓冲液 （P。

23、BS稀释， CBS浓度为0.05 mol/L， pH 9.6） 将 玉米赤霉烯酮包被原倍比稀释， 96孔酶标板中每孔加入100 L， 37培养箱中孵育2 h。 0033 （2） 封闭： 以含1% OVA （卵清蛋白） 的PBS缓冲液 （0.01 mol/L， pH 7.4） 作为封闭液， 96孔酶标板中每孔加入200 L， 于37 培养箱中孵育1 h。 0034 （3） 加样： 用含有10%甲醇的PBS缓冲液将目标检测物玉米赤霉烯酮标准品配制成 0.001、 0.01、 0.05、 0.1、 0.5、 1、 5、 10、 50、 100 g/L系列浓度， 96孔酶标板中每孔加入50 L， 再加。

24、入经抗体稀释液 （含有0.01%吐温和0.1%明胶的PBS缓冲液） 稀释到适当浓度的玉米赤 霉烯酮单克隆抗体50 L， 37 培养箱中孵育1 h。 0035 （4） 加酶标二抗： 用上述抗体稀释液将实施例1制备的HRP/羊抗鼠IgGZIF-L稀释 256倍， 然后100 LHRP/羊抗鼠IgGZIF-L溶液加入96孔酶标板中， 37 培养箱中孵育1 h。 0036 （以上每一步结束后都用洗涤液PBST清洗4次） （5） 显色： 向96孔酶标板中每孔加入100 LTMB显色液 （0.5 mLTMB加入10 mL柠檬酸缓 冲液和32 L 0.75% H2O2） ， 37 培养箱中孵育15 min。。

25、 0037 （6） 终止反应： 向96孔酶标板中每孔快速加入50 L 2 mol/L H2SO4， 设定波长为 450 nm， 于酶标仪上读取吸光值。 0038 （7） 标准曲线和灵敏度 根据玉米赤霉烯酮标准品和玉米赤霉烯酮单克隆抗体的结合率与玉米赤霉烯酮浓度 的对数作图即得到标准曲线。 结合率(B/Bo， %)以下式计算： 说明书 4/5 页 6 CN 111320697 A 6 B/Bo （%） = (Ax - Amin)/(Amax - Amin) 100 式中： Ax为加药时的吸光值， Amax为阴性对照的吸光值， Amin为空白对照的吸光值。 0039 同时， 以传统的酶标二抗 （H。

26、RP-IgG） 替代HRP/羊抗鼠IgGZIF-L为对照组， 同上述 步骤过程用于ZEN检测。 0040 结果如图5和6所示， 玉米赤霉烯酮浓度在0.001 ng/mL-0.476 g /L范围内， 玉米 赤霉烯酮浓度的对数值和结合率(B/B0)呈线性关系， 相关系数为R2=0.991， IC20为0.5 ng/ L。 与传统的二抗相比较， 传统的酶标二抗 （HRP-IgG） 的IC20为0.063 ng/mL， IC20值变小， 灵 敏度提高了126倍。 0041 实施例5： 样品添加分析 （1） 提取方法 称取5 g玉米粉， 添加玉米赤霉烯酮标准品， 制成三个不同浓度水平 （0.05， 0。

27、.2， 0.45 mg/kg)的样品， 混匀， 放置过夜， 在样品中加入15 mL提取液 （甲醇： 水=7： 3， 体积比） 。 振荡20 min后， 离心， 取上清液， 用PBS稀释7倍。 0042 （2） 样品的ELISA分析 样品分析参考实施例4， 采用本发明实施例1制备的酶标二抗 （HRP/羊抗鼠IgGZIF-L） 进行检测分析， 经分析可知， 该ELISA的玉米赤霉烯酮平均回收率为84.5-97%， 变异系数为 1.7-8.9%， 具体见下表1。 0043 表1.酶标二抗 （HRP/IgGZIF-L） 对玉米赤霉烯酮的ELISA分析结果 可见该发明适用于玉米赤霉烯酮在玉米粉中的残留测。

28、定。 0044 上述实施例仅为优选实施例而已， 并不用于限制发明， 尽管参照前述事实例对本 发明进行详细的说明， 对于本领域的技术人员来说， 其依然可以对前述实施例所记载的技 术方案进行修改， 或者对其部分技术特征进行同等替换。 凡在发明的精神和原则至内， 所做 的任何修改、 同等替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 5/5 页 7 CN 111320697 A 7 图1 图2 说明书附图 1/3 页 8 CN 111320697 A 8 图3 图4 说明书附图 2/3 页 9 CN 111320697 A 9 图5 图6 说明书附图 3/3 页 10 CN 111320697 A 10 。