BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质及其制备方法和用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810093324.2 (22)申请日 2018.01.31 (71)申请人 南通大学附属医院 地址 226001 江苏省南通市西寺路20号 (72)发明人 景蓉蓉王惠民于书平崔明 袁丹丹 (74)专利代理机构 南通市永通专利事务所(普 通合伙) 32100 代理人 葛雷 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/63(2006.01) (54)发明名。

2、称 BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考 物质及其制备方法和用途 (57)摘要 本发明公开了一种BCR-ABL1融合基因 e14a2亚型质粒候选参考物质及其制备方法和用 途， 所述的候选参考物质制备时， 先设计引物， 采 用分子克隆技术构建含有BCR-ABL1融合基因 e14a2亚型的重组质粒候选参考物质； 经酶切电 泳、 测序验证后， 实时荧光定量PCR进行均匀性和 稳定性评价； 评定测量不确定度。 本发明制备了 一种均匀、 稳定的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型 的质粒候选参考物质， 可用于慢性粒细胞白血病 BCR-ABL1融合基因e14a2亚型荧光定量PCR相关 分子。

3、诊断试剂厂商产品的校准， 也可用于临床实 验室实时荧光定量PCR检测方法的性能评价， 使 不同临床实验室的检测结果具有可比性， 促进临 床检验的标准化。 权利要求书3页 说明书9页 附图6页 CN 108265117 A 2018.07.10 CN 108265117 A 1.一种BCR-ABL1融合基因e14a2亚型的质粒候选参考物质， 其特征是： 核苷酸序列为： tgtcggagcaggagtcactgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaacggcaa gagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcag。

4、agtggagggagaacatccgggagcagcagaagaagt gtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgaccaactcgtgtgtgaaactccagactgtccac agcattccgctgaccatcaataaggaagatgatgagtctccggggctctatgggtttctgaatgtcatcgtccactc agccactggatttaagcagagttcaaaagcccttcagcggccagtagcatctgactttgagcctcagggtctgagtg aagccgctcgttggaactccaaggaaaac。

5、cttctcgctggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactg tatgattttgtggccagtggagataacactctaagcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatca caatggggaatggtgtgaagcccaaaccaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaaca gtctggagaaacactcctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcagcgggatcaat ggcagcttcttggtgcg。

6、tgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaagggagggtgta ccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctggccgagt tggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaagcgcaacaagccc actgtctatggtgtgtcccccaactacgacaagtgggagatggaacgcacggacatcaccatgaagcacaagctggg cgggg。

7、gccagtacggggaggtgtacgagggcg tgtggaagaaatacagcctg acggtg。 2.一种权利要求1所述的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型的质粒候选参考物质的制备方 法， 其特征是： 包括下列步骤： (1)用于扩增BCR-ABL1融合基因e14a2亚型基因的重组质粒引物： 上游引物： TGTCGGAGCAGGAGTCAC 下游引物： CACCGTCAGGCTGTATTT (2)BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒构建： TRIzol法提取人慢性髓系白血病细胞K562总RNA， 逆转录成cDNA后扩增目的片段， 经 1琼脂糖凝胶回收与pGEM-T Ea。

8、sy载体4过夜连接； 连接产物转化至感受态大肠杆菌DH5 细胞， 涂于含X-gal和IPTG的LB固体培养基， LB固体培养基中含氨苄青霉素100ng/mL， 37 倒置培养1216h； 挑选单个白色阳性克隆菌落于LB液体培养基， LB固体培养基中含氨苄青 霉素100ng/mL， 37过夜震荡培养后提取质粒， 制备质粒候选参考物质； 经酶切和测序验 证； PCR扩增体系与条件： 模板cDNA 2L， 10mol/L的上下游引物各1L， 10mmol/L的 dNTPs0.5 L， 5U/ul的Taq酶0.2 L， 25mmol/L的MgCl21.5 L， 10buffer 2.5 L， ddH2。

9、O 16.3 L， 共25 L； 反应条件： 95预变性3min， 95变性30s， 57退火30s， 72延伸60s， 35个循 环， 最后72延伸10min。 3.根据权利要求2所述的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质的制备方法， 其特征是： 所制得的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质还经BCR-ABL1融合基 因e14a2亚型质粒候选参考物质纯度验证， 验证方法： (1)紫外分光光度法 应用核酸蛋白分析仪检测质粒候选参考物质样品在230nm、 260nm、 280nm的吸光度值 A230、 A260、 A280， 通过A260/A230、 A260。

10、/A280的结果判断质粒候选参考物质的纯度； 质粒经紫外分 光光度法测得A260/A230为2.37， A260/A280为1.80， 质粒纯度良好； (2)琼脂糖凝胶电泳法 将EcoRI、 PstI酶切的质粒候选参考物质溶液进行1琼脂糖凝胶电泳， 成像分析， 酶切 权利要求书 1/3 页 2 CN 108265117 A 2 质粒电泳条带单一， 无杂带， 并无其他DNA、 RNA污染。 4.根据权利要求2所述的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质的制备方法， 其特征是： 所制得的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质还经BCR-ABL1融合基 因e14a2亚。

11、型质粒候选参考物质浓度检测， 检测方法： 回收经PstI酶线性化的质粒候选参考物质， 用TE缓冲液作为空白对照， 应用紫外/可见 分光光度计检测质粒候选参考物质在260nm、 320nm处吸光度值， 根据公式(1)计算质粒候选 参考物质溶液的拷贝数浓度： Copynumber(A260-A320)50NA/Mplasmid (1) 公式中50为双链DNA浓度的转换因子， ng/ L或 g/mL； NA为阿伏加德罗常数； Mplasmid为质 粒分子的摩尔质量。 5.根据权利要求2所述的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质的制备方法， 其特征是： 所制得的BCR-ABL1融合基。

12、因e14a2亚型质粒候选参考物质还经BCR-ABL1融合基 因e14a2亚型质粒候选参考物质均匀性和稳定性检测， 方法如下： (1)标准曲线制作 将质粒候选参考物质10倍梯度稀释成108102cp/ L系列， 绘制RQ-PCR检测标准曲线， 应用标准曲线进行质粒候选参考物质定量； RQ-PCR反应体系和条件： 质粒溶液2 L， 10 mol/ L上下游引物各0.6 L， 10 mol/L探针0.4 L， 2Premix Ex Taq10 L， ddH2O 6.4 L， 共20 L； 95预变性30s， 95变性5s， 60退火延伸30s， 45个循环； 其中上下游引物为： 上游引物： GGGC。

13、TCTATGGGTTTCTGAATG 下游引物： CGCTGAAGGGCTTTTGAACTC 探针： FAM-ATCGTCCACTCAGCCAC-MGB； (2)均匀性分析 将质粒候选参考物质原液稀释103倍至106cp/ L， 分装-70保存； 根据CNAS-GL29 标准 物质/标准样品定值的一般原则和统计方法 随机抽取10管分装的质粒候选参考物质进行 瓶间均匀性研究， 应用RQ-PCR法测定， 每管重复测量3次； 瓶内均匀性： 随机抽取一管质粒， 从上层、 离液面25mm的中间、 管底分别吸取5次样本检测， 每次2 L； 测量结果应用方差分 析统计； (3)稳定性分析 采用同步稳定性研究。

14、设计， 根据运输要求， 将质粒候选参考物质4和2025室温保 存1、 2、 4、 5天， -20保存1、 2、 3、 4周后检测其浓度； 每个温度每个时间段5管， 每管测量3次。 6.根据权利要求2所述的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质的制备方法， 其特征是： 所制得的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质还经BCR-ABL1融合基 因e14a2亚型质粒候选参考物质测量不确定度评定， 方法如下： BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质的不确定度主要由三部分组成： 质粒 候选参考物质浓度测量过程引入的不确定度、 质粒候选参考物质的不均匀性引起。

15、的不确定 度、 质粒候选参考物质的不稳定性引起的不确定度； 其中浓度测量引入的不确定度分为A类 评定和B类评定， A类评定为吸光度的测量不精密度和稀释引入的不确定度， B类评定包括紫 外可见分光光度计波长、 比色杯内径的不确定度、 摩尔消光系数、 阿伏加德罗常数、 质粒分 权利要求书 2/3 页 3 CN 108265117 A 3 子量引入的不确定度； 均匀性分析中重复性标准偏差Sr大于瓶间标准偏差Sbb， 因此不均匀 性引入的不确定度根据公式计算， n为测量次数， VMS组 内为组 内自由度； 不稳定性引入的不确定度根据uitss(b1)t计算， s(b1)为斜率的标准偏差， t 为监测时。

16、间； 分别评定不同组分的不确定度后合成得到候选参考物质的标准不确定度， 再 乘以包含因子k， 95置信区间， k2， 得其扩展不确定度。 7.一种权利要求1所述的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质在慢性粒细 胞白血病BCR-ABL1融合基因e14a2亚型荧光定量PCR相关分子诊断试剂厂商产品的校准中 的应用。 8.一种权利要求1所述的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质在临床实验 室实时荧光定量PCR检测方法的性能评价中的应用。 权利要求书 3/3 页 4 CN 108265117 A 4 BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质及其制备方 。

17、法和用途 技术领域 0001 本发明涉及一种BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质及其制备方法和 用途。 背景技术 0002 慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia， CML)的特征性分子标志物是由 埃布尔森小鼠白血病病毒癌基因(Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1， ABL1)和断裂点簇集区(break point cluster region， BCR)易位形成的BCR-ABL1融合基 因1。 BCR 基因不同的断裂位点产生了多种BCR-ABL1亚型， 其中最常见是的 e14a2亚型， 。

18、由 BCR的e14外显子和ABL1的外显子a2断裂形成2。 近年来， 应用分子生物学技术靶向检测 BCR-ABL1为CML的诊断、 治疗疗效以及微小残留病灶的动态监测提供了依据。 0003 实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction， RQ- PCR)是目前检测融合基因BCR-ABL1的常见方法， 标准化的缺乏使实验室间检测结果存在较 大差异。 部分国内实验室通过自建质粒标准品(质控品)提高本实验室检测结果的质量。 但 是不同实验室引物设计的位置不同， 导致该标准品仅能在各自实验室使用， 且自建标准品 的定值不够精准。 。

19、还有一些实验室与国内权威实验室进行样本交换检测， 获得转换因子 (convert factor， CF)用于调整实验室的检测结果， 这种做法在一定程度上促进了检测结 果的一致化。 但操作过程比较繁琐， 且检测程序的改变可影响CF值。 0004 参考物质是指适用于校准、 对其他物质赋值或标称特性检查、 具有一种或多种足 够均匀和稳定特性的物质。 狭义上， 参考物质是使用有效程序提供一个或多个指定的特性 值及其测量不确定度和溯源性的物质， 可用于量值溯源和正确度评价， 促进实验室检测的 标准化。 目前， 我国尚无BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质。 发明内容 0005 本发明的。

20、目的在于克服现有技术的不足， 提供一种均匀、 稳定， 并含有准确定值和 测量不确定度结果的BCR-ABL1融合基因e14a2 亚型候质粒选参考物质及其制备方法和用 途。 0006 本发明的技术解决方案是： 0007 一种BCR-ABL1融合基因e14a2亚型的质粒候选参考物质， 其特征是： 核苷酸序列 为： 0008 tgtcggagcaggagtcactgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaacg gcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggagc 。

21、agcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgcagatgctgaccaactcgtgtgt gaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagatgatgagtctccggggctctat gggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggatttaagcagagttcaaaagcccttcagcggccagt 说明书 1/9 页 5 CN 108265117 A 5 agcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaagga。

22、aaaccttctcgct ggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagataacactcta agcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaa accaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactc ctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcagcgggatcaatggcagcttc ttg。

23、gtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagatacgaagggagggtgta ccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctgg ccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaa gcgcaacaagcccactgtctatggtgtgtcccccaactacgacaagtgggagatggaacgcacggaca tcaccatgaagcacaagctggg。

24、cgggggccagtacggggaggtgtacgagggcg tgtggaagaa atacagcctg acggtg。 0009 一种BCR-ABL1融合基因e14a2亚型的质粒候选参考物质的制备方法， 其特征是： 包 括下列步骤： 0010 (1)用于扩增BCR-ABL1融合基因e14a2亚型基因的重组质粒引物： 0011 上游引物： TGTCGGAGCAGGAGTCAC 0012 下游引物： CACCGTCAGGCTGTATTT 0013 (2)BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒构建： 0014 TRIzol法提取人慢性髓系白血病细胞K562总RNA， 逆转录成 cDNA后扩。

25、增目的片 段， 经1琼脂糖凝胶回收与pGEM-T Easy载体 4过夜连接。 连接产物转化至感受态大肠 杆菌DH5细胞， 涂于含 X-gal和IPTG的LB固体培养基， LB固体培养基中含氨苄青霉素 100ng/mL， 37倒置培养1216h； 挑选单个白色阳性克隆菌落于LB液体培养基， LB固体培 养基中含氨苄青霉素100ng/mL， 37过夜震荡培养后提取质粒， 制备质粒候选参考物质； 经 酶切和测序验证； PCR扩增体系与条件： 模板cDNA 2 L， 10 mol/L的上下游引物各1 L， 10mmol/L的dNTPs 0.5 L， 5U/ul的Taq酶0.2 L， 25mmol/L 。

26、的MgCl2 1.5 L， 10buffer 2.5 L， ddH2O 16.3 L， 共25 L； 反应条件： 95预变性3min， 95变性30s， 57退火30s， 72延 伸60s， 35个循环， 最后72延伸10min。 0015 所制得的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质还经 BCR-ABL1融合基 因e14a2亚型质粒候选参考物质纯度验证， 验证方法： 0016 (1)紫外分光光度法 0017 应用核酸蛋白分析仪检测质粒候选参考物质样品在230nm、 260 nm、 280nm的吸光 度值A230、 A260、 A280， 通过A260/A230、 A260/。

27、A280的结果判断质粒候选参考物质的纯度； 质粒经紫 外分光光度法测得 A260/A230为2.37， A260/A280为1.80， 质粒纯度良好； 0018 (2)琼脂糖凝胶电泳法 0019 将EcoRI、 PstI酶切的质粒候选参考物质溶液进行1琼脂糖凝胶电泳， 成像分析， 酶切质粒电泳条带单一， 无杂带， 并无其他DNA、 RNA污染。 0020 所制得的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质还经 BCR-ABL1融合基 因e14a2亚型质粒候选参考物质浓度检测， 检测方法： 0021 回收经PstI酶线性化的质粒候选参考物质， 用TE缓冲液作为空白对照， 应用紫外/ 。

28、可见分光光度计检测质粒候选参考物质在260nm、 320nm处吸光度值， 根据公式(1)计算质 说明书 2/9 页 6 CN 108265117 A 6 粒候选参考物质溶液的拷贝数浓度： 0022 Copynumber(A260-A320)50NA/Mplasmid (1) 0023 公式中50为双链DNA浓度的转换因子， ng/ L或 g/mL； NA为阿伏加德罗常数； Mplasmid 为质粒分子的摩尔质量。 0024 所制得的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质还经 BCR-ABL1融合基 因e14a2亚型质粒候选参考物质均匀性和稳定性检测， 方法如下： 0025 (1。

29、)标准曲线制作 0026 将质粒候选参考物质10倍梯度稀释成108102cp/ L系列， 绘制 RQ-PCR检测标准 曲线， 应用标准曲线进行质粒候选参考物质定量； RQ-PCR反应体系和条件： 质粒溶液2 L， 10 mol/L上下游引物各 0.6 L， 10 mol/L探针0.4 L， 2Premix Ex Taq10 L， ddH2O 6.4 L， 共20 L； 95预变性30s， 95变性5s， 60退火延伸30s， 45 个循环； 0027 其中上下游引物为： 0028 上游引物： GGGCTCTATGGGTTTCTGAATG 0029 下游引物： CGCTGAAGGGCTTTTGA。

30、ACTC 0030 探针： FAM-ATCGTCCACTCAGCCAC-MGB； 0031 (2)均匀性分析 0032 将质粒候选参考物质原液稀释103倍至106cp/ L， 分装-70保存； 根据CNAS-GL29 标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法 随机抽取10管分装的质粒候选参考物质 进行瓶间均匀性研究， 应用RQ-PCR法测定， 每管重复测量3次； 瓶内均匀性： 随机抽取一管质 粒， 从上层、 离液面25mm的中间、 管底分别吸取5次样本检测， 每次2 L。 测量结果应用方差 分析统计； 0033 (3)稳定性分析 0034 采用同步稳定性研究设计， 根据运输要求， 将质粒候选。

31、参考物质 4和2025 室温保存1、 2、 4、 5天， -20保存1、 2、 3、 4周后检测其浓度； 每个温度每个时间段5管， 每管测 量3次。 0035 所制得的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质还经BCR-ABL1融合基因 e14a2亚型质粒候选参考物质测量不确定度评定， 方法如下： 0036 BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质的不确定度主要由三部分组成： 质粒候选参考物质浓度测量过程引入的不确定度、 质粒候选参考物质的不均匀性引起的不 确定度、 质粒候选参考物质的不稳定性引起的不确定度； 其中浓度测量引入的不确定度分 为A类评定和B类评定， A。

32、类评定为吸光度的测量不精密度和稀释引入的不确定度， B类评定 包括紫外可见分光光度计波长、 比色杯内径的不确定度、 摩尔消光系数、 阿伏加德罗常数、 质粒分子量引入的不确定度； 均匀性分析中重复性标准偏差Sr大于瓶间标准偏差Sbb， 因此 不均匀性引入的不确定度根据公式计算14， n 为测量次数， VMS组 内为组内自由度； 不稳定性引入的不确定度根据 uitss(b1)t计算， s(b1)为斜率的 标准偏差， t为监测时间； 分别评定不同组分的不确定度后合成得到候选参考物质的标准不 说明书 3/9 页 7 CN 108265117 A 7 确定度， 再乘以包含因子k， 95置信区间， k2，。

33、 得其扩展不确定度。 0037 一种BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质在慢性粒细胞白血病BCR- ABL1融合基因e14a2亚型荧光定量PCR相关分子诊断试剂厂商产品的校准中的应用。 0038 一种BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质在临床实验室实时荧光定量 PCR检测方法的性能评价中的应用。 0039 本发明制备了一种均匀、 稳定的BCR-ABL1融合基因e14a2亚型的质粒候选参考物 质。 该候选参考物质可用于慢性粒细胞白血病 BCR-ABL1融合基因e14a2亚型荧光定量PCR 相关分子诊断试剂厂商产品的校准， 也可用于临床实验室实时荧光定量PCR检。

34、测方法的性 能评价， 使不同临床实验室的检测结果具有可比性， 促进临床检验的标准化。 BCR-ABL1融合 基因e14a2亚型质粒候选参考物质均匀、 稳定， 并含有准确定值和测量不确定度结果。 附图说明 0040 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。 0041 图1是BCR-ABL融合基因e14a2亚型候选参考物质的不确定度分量示意图。 0042 图2是BCR-ABL1融合基因e14a2亚型PCR产物电泳图。 0043 图3是BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质酶切电泳图； 其中a.1泳道 为DL5000 DNA maker， 2泳道为质粒候选参考物质经EcoRI酶切后。

35、的片段(大片段为T-easy 空载体， 小片段为BCR-ABL1目的片段， 1074bp(加酶切位点)。 b.BCR-ABL1融合基因质粒候 选参考物质经PstI酶切电泳图， 1泳道为DL5000 DNA maker， 2为质粒PstI酶切后的片段 (4070bp)。 0044 图4是BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质测序的BCR-ABL1融合基因 e14a2亚型目的片段测序比对图。 0045 图5是BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质测序的BCR-ABL1目的片段 测序峰图。 方框中为上下游引物位点。 0046 图6是BCR-ABL1融合基因e14a2亚。

36、型质粒标准品的标准曲线. 0047 图7是BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒标准品均匀性扩增曲线。 具体实施方式 0048 一种BCR-ABL1融合基因e14a2亚型的质粒候选参考物质， 核苷酸序列为： 0049 tgtcggagcaggagtcactgctgctgcttatgtctcccagcatggccttcagggtgcacagccgcaacg gcaagagttacacgttcctgatctcctctgactatgagcgtgcagagtggagggagaacatccgggagc agcagaagaagtgtttcagaagcttctccctgacatccgtggagctgca。

37、gatgctgaccaactcgtgtgt gaaactccagactgtccacagcattccgctgaccatcaataaggaagatgatgagtctccggggctctat gggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggatttaagcagagttcaaaagcccttcagcggccagt agcatctgactttgagcctcagggtctgagtgaagccgctcgttggaactccaaggaaaaccttctcgct ggacccagtgaaaatgaccccaaccttttcgttgcactgtatgattttgtggccagtggagata。

38、acactcta agcataactaaaggtgaaaagctccgggtcttaggctataatcacaatggggaatggtgtgaagcccaa accaaaaatggccaaggctgggtcccaagcaactacatcacgccagtcaacagtctggagaaacactc ctggtaccatgggcctgtgtcccgcaatgccgctgagtatctgctgagcagcgggatcaatggcagcttc 说明书 4/9 页 8 CN 108265117 A 8 ttggtgcgtgagagtgagagcagtcctggccagaggtccatctcgctgagat。

39、acgaagggagggtgta ccattacaggatcaacactgcttctgatggcaagctctacgtctcctccgagagccgcttcaacaccctgg ccgagttggttcatcatcattcaacggtggccgacgggctcatcaccacgctccattatccagccccaaa gcgcaacaagcccactgtctatggtgtgtcccccaactacgacaagtgggagatggaacgcacggaca tcaccatgaagcacaagctgggcgggggccagtacggggaggtgtacgagggcg tgtggaagaa ataca。

40、gcctg acggtg。 0050 按照下述方法制备BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质 0051 材料和方法： 0052 2.1试剂和仪器 0053 TRIzol提取液(美国Invitrogen公司)， 逆转录试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)， pGEM-T Easy vector、 X-gal(美国Promega 公司)， Taq酶、 LB肉汤、 琼脂 糖、 IPTG(上海生工生物工程有限公司)， Premix Ex Taq(日本Takara公司)， 感受态DH5 (北 京全式金生物技术有限公司)， 胶回收试剂盒、 质粒提取试剂盒(美国。

41、Omega 公司)， 限制性 内切酶EcoRI、 PstI(美国New England Biolabs公司)。 0054 PCR扩增仪(Bio-Rad PTC-200)， RQ-PCR仪(Roche Cobas z 480)， 紫外/可见分光 光度计(Hitachi U-3310)， 核酸蛋白分析仪 (Hitachi U-0080D) 0055 2.2引物设计 0056 根据GenBank中BCR(NM_004327)和ABL1(NM_005157) 的基因序列， 应用Primer 6 软件设计引物用于构建BCR-ABL1融合基因e14a2亚型的重组质粒， 引物序列覆盖目前绝大 部分文献所报道。

42、以及国内外主要试剂盒的扩增区域。 应用Beacon Designer7软件设计 RQ- PCR法检测所用引物和探针以评价质粒均匀性和稳定性， 引物序列见表1， 并由上海生工生 物工程有限公司合成。 0057 表1 本发明所需的引物和探针序列 0058 0059 2.3 BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒构建 0060 TRIzol法提取人慢性髓系白血病细胞K562总RNA， 逆转录成 cDNA后扩增目的片段 (引物序列见表1)， 经1琼脂糖凝胶回收与 pGEM-T Easy载体4过夜连接。 连接产物转化 至感受态大肠杆菌 DH5 细胞， 涂于含X-gal和IPTG的LB固体培养基(含氨。

43、苄青霉素100ng/ mL)， 37倒置培养1216h， 挑选单个白色阳性克隆菌落于LB液体培养基(含氨苄青霉素 说明书 5/9 页 9 CN 108265117 A 9 100ng/mL)37过夜震荡培养后提取质粒， 制备质粒候选参考物质。 经酶切和测序验证。 PCR 扩增体系与条件： 模板cDNA2 L， 上下游引物(10 mol/L)各1 L， dNTPs(10mmol/L)0.5 L， Taq酶(5U/ul)0.2 L， MgCl2(25mmol/L) 1.5 L， 10buffer 2.5 L， ddH2O 16.3 L， 共25 L。 反应条件： 95 预变性3min， 95变性3。

44、0s， 57退火30s， 72延伸60s， 35个循环， 最后72 延伸10min。 0061 2.4 BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质纯度验证 0062 2.4.1紫外分光光度法 0063 应用核酸蛋白分析仪检测质粒候选参考物质样品在230nm、 260 nm、 280nm的吸光 度值A230、 A260、 A280， 通过A260/A230、 A260/A280的结果判断质粒候选参考物质的纯度。 高纯度 DNAA260/A230应大于 2.0， A260/A280应大于1.8。 0064 2.4.2琼脂糖凝胶电泳法 0065 将EcoRI、 PstI酶切的质粒候选参考。

45、物质溶液进行1琼脂糖凝胶电泳， 成像分析， 观察有无杂带判断纯度。 0066 2.5 BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质浓度检测 0067 回收经PstI酶线性化的质粒候选参考物质， 用TE缓冲液作为空白对照， 应用紫外/ 可见分光光度计检测质粒候选参考物质在260nm、 320nm处吸光度值， 根据公式(1)计算质 粒候选参考物质溶液的拷贝数浓度。 0068 Copynumber(A260-A320)50NA/Mplasmid (1) 0069 公式中50为双链DNA浓度的转换因子(ng/ L或 g/mL)， NA为阿伏加德罗常数， Mplasmid为质粒分子的摩尔质量。。

46、 0070 2.6 BCR-ABL1e14a融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质均匀性和稳定性研究 0071 2.6.1标准曲线制作 0072 将质粒候选参考物质10倍梯度稀释成108102cp/ L系列， 绘制RQ-PCR检测标准曲 线， 应用标准曲线进行质粒候选参考物质定量。 RQ-PCR反应体系和条件： 质粒溶液2 L， 上 下游引物(10 mol/L) 各0.6 L， 探针(10 mol/L)0.4 L， 2Premix Ex Taq10 L， ddH2O 6.4 L， 共20 L。 95预变性30s， 95变性5s， 60退火延伸30 s， 45个循环。 0073 2.6.2均匀性。

47、研究 0074 将质粒候选参考物质原液稀释103倍至106cp/ L， 分装-70保存。 根据CNAS-GL29 标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法 随机抽取10管分装的质粒候选参考物质 进行瓶间均匀性研究， 应用RQ-PCR法测定， 每管重复测量3次。 瓶内均匀性： 随机抽取一管质 粒， 从上层、 中间(离液面25mm)、 管底分别吸取5次样本检测， 每次2 L。 测量结果应用方差 分析统计。 0075 2.6.3稳定性研究 0076 采用同步稳定性研究设计， 根据运输要求， 将质粒候选参考物质 4和室温(20 25)保存1、 2、 4、 5天， -20保存1、 2、 3、 4 周后。

48、检测其浓度。 每个温度每个时间段5管， 每管 测量3次。 0077 2.7 BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质测量不确定度评定 0078 BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质的不确定度(图1) 主要由三部分 组成： 质粒候选参考物质浓度测量过程引入的不确定度； 质粒候选参考物质的不均匀性引 说明书 6/9 页 10 CN 108265117 A 10 起的不确定度； 质粒候选参考物质的不稳定性引起的不确定度。 浓度测量引入的不确定度 可分为A 类评定和B类评定， A类评定为吸光度的测量不精密度和稀释引入的不确定度， B类 评定包括紫外可见分光光度计波长、 。

49、比色杯内径的不确定度、 摩尔消光系数、 阿伏加德罗常 数、 质粒分子量引入的不确定度。 均匀性研究中重复性标准偏差Sr大于瓶间标准偏差Sbb， 因 此不均匀性引入的不确定度根据公式计算， n 为测量次 数， VMS组 内为组内自由度。 不稳定性引入的不确定度根据 uitss(b1)t计算， s(b1)为斜率 的标准偏差， t为监测时间。 分别评定不同组分的不确定度后合成得到候选参考物质的标准 不确定度， 再乘以包含因子k(95置信区间， k2)得其扩展不确定度。 0079 结果： 0080 3.1 BCR-ABL1融合基因e14a2亚型质粒候选参考物质构建 0081 以BCR-ABL1forward+BCR-ABL1reverse为引物， 扩增出1055bp 目的片段(图2)。 构 建的质粒候选参考物质经EcoRI、 PstI酶酶切验证(图3)， 同时。