一种提取高纯度微囊藻毒素的方法.pdf
《一种提取高纯度微囊藻毒素的方法.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《一种提取高纯度微囊藻毒素的方法.pdf(6页完成版)》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102516367 A (43)申请公布日 2012.06.27 CN 102516367 A *CN102516367A* (21)申请号 201110455131.5 (22)申请日 2011.12.30 C07K 7/56(2006.01) C07K 1/14(2006.01) (71)申请人 山东建筑大学 地址 250101 山东省济南市历城区临港开发 区凤鸣路 (72)发明人 母锐敏 袁学良 石敬华 韩雪梅 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 王立晓 (54) 发明名称 一种提取高纯度微囊藻毒素的方法 (57) 摘要 本。
2、发明涉及一种提取高纯度微囊藻毒素的方 法, 先将铜绿微囊藻水样经液氮反复冻融, 将冻融 后的水样离心取上清液备用, 对 C18 固相萃取柱 预处理, 将水样中MC-LR用C18固相萃取柱富集纯 化 ; 将 MC-LR 溶出并浓缩得到产品。本发明可提 取得到毫克级 MC-LR, 杂质少, 纯度高 ; 采用液氮 冻融的方法使藻细胞破壁, 操作方法简便, 且可以 使细胞内胞外 MC-LR 完全释放出来, 而且环保、 安 全、 经济。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页。
3、 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种提取高纯度微囊藻毒素的方法, 其特征是, 包括步骤如下 : (1) 水样预处理 : 将铜绿微囊藻水样经液氮反复冻融 2-4 次, 以破碎藻细胞, 释放胞内 微囊藻毒素 MC-LR, 然后将冻融后的水样离心取上清液备用 ; (2)SPE 固相萃取柱的预处理、 MC-LR 的富集与纯化 : 用甲醇清洗固相萃取柱 2-4 次, 再 用超纯水清洗2-4次 ; 向清洗后的固相萃取柱内通入步骤(1)的上清液过柱, 过柱完后用甲 醇水溶液作淋洗液清洗富集了 MC-LR 的固相萃取柱, 除去杂质 ; (3)MC-LR 的溶出与浓缩 : 用 100甲醇作为洗脱液清洗富集。
4、了 MC-LR 的固相萃取柱以 洗脱 MC-LR, 使 MC-LR 溶出, 将溶出的 MC-LR- 甲醇混合溶液置于旋转蒸发仪, 40-60, 旋转 蒸发 10-20min。 2.根据权利要求1所述的一种提取高纯度微囊藻毒素的方法, 其特征是, 步骤(1)中所 述的离心是在 8000-10000rpm 速度下离心 8-12 分钟。 3.根据权利要求1所述的一种提取高纯度微囊藻毒素的方法, 其特征是, 步骤(2)中所 述的固相萃取柱为 C18 固相萃取柱 ; 所述的过柱速度均为 5ml/min。 4.根据权利要求1所述的一种提取高纯度微囊藻毒素的方法, 其特征是, 步骤(2)中所 述的甲醇水溶液。
5、浓度为 10 -20, 洗涤 1-2 次。 权 利 要 求 书 CN 102516367 A 2 1/3 页 3 一种提取高纯度微囊藻毒素的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种微囊藻毒素的提取方法, 具体为一种从产毒铜绿微囊藻中提取高 纯度微囊藻毒素的方法, 属于环保技术领域。 背景技术 0002 近年来, 随着全球水体富营养化程度的加剧, 世界各地有害藻类水华 (Harmful Algal Blooms, HABs) 事件发生的频率和幅度日趋增加。藻类水华已成为严重影响水环 境质量和水体生态安全的全球性问题, 不仅极大的危害人类健康和其他生物安全, 也给 全球造成巨大的经济损失。有些水华。
6、藻类在代谢过程中或藻体破裂后向水体中排出藻 毒素, 给人类健康、 水生动物、 家禽等带来极大危害。如铜绿微囊藻所产生的微囊藻毒素 (Microsystins, 简称 MC) 是一类具有生物活性的环状七肽化合物, 近几十年来, 国内外动 物试验、 人群流行病学调查表明微囊藻毒素具有机体肝毒性、 促癌、 胚胎毒性、 遗传毒性、 免 疫损害等作用。 0003 微囊藻毒素是一类具有生物活性的七肽单环肝毒素, 相对分子量在 900-1100 之 间。到目前为止, 发现的微囊藻毒素的异构体达 60 多种, 其中存在较多且毒性较大的是微 囊藻毒素 MC-LR, MC-YR, MC-RR。能产生微囊藻毒素的藻。
7、类主要有微囊藻 (Microcystis)、 鱼腥藻 (Anabaena)、 颤藻 (Oscillatoria) 和念珠藻 (Nostoc) 等。由于 MC-LR 存在较为普 遍, 毒性较强, 且已分离培养出标准纯品, 故现在藻毒素研究常以其为代表性指标, WHO 以 MC-LR 含量为基准推荐饮水藻毒素标准为 1.0g/L。 0004 随着对微囊藻毒素降解研究的广泛开展, 科研人员对微囊藻毒素样品的需求量也 越来越大, 对水体中微囊藻毒素的检测及降解研究已成为水环境领域的一项重要研究内 容。 0005 目前只有少数几家国外公司才能购买到高纯度(纯度95以上)的MC-LR等标准 品, 价格昂贵。
8、 ( 如美国 sigma 公司 500mg 标准品价格约 3000 元 ), 购买手续繁杂, 等候时间 过长等因素给研究带来极大的不便。 如果实验所需微囊藻毒素样品全部靠进口标准品来完 成, 也将大大增加实验成本。 因此, 开发具有自主知识产权的高纯度微囊藻毒素提取方法对 于在水环境及卫生领域展开更多关于微囊藻毒素的研究具有重要意义。 0006 中国专利 200910033693 公开了一种分离、 纯化微囊藻毒素的方法, 产微囊藻毒素 的蓝藻用12080的溶剂提取, 提取液通过SPE柱净化, 然后利用恒流泵、 C18层析柱、 自 动部分收集器构成的柱层析系统对微囊藻毒素进行分离纯化, 流动相由。
9、3550水、 50 65甲醇以及 0.05 0.1酸组成。由于甲醇浓度偏低, 还有酸的存在会使藻毒素部分降 解, 塑料或是玻璃容器会对 MC 有吸附 ; 超声破碎藻细胞使其中的藻毒素和其他物质同时释 放, 不利于高纯度藻毒素的获得。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种提取高纯度微囊藻毒素的方法, 该方法高效、 经济、 纯度 说 明 书 CN 102516367 A 3 2/3 页 4 高, 解决了目前微囊藻毒素标准品价格昂贵、 获得手续繁杂等问题。 0008 本发明采取的技术方案为 : 0009 一种提取高纯度微囊藻毒素的方法, 包括步骤如下 : 0010 (1) 水样预处理 : 将铜。
10、绿微囊藻水样经液氮反复冻融 2-4 次, 以破碎藻细胞, 释放 胞内微囊藻毒素 MC-LR, 然后将冻融后的水样离心取上清液备用 ; 0011 (2)SPE 固相萃取柱的预处理、 MC-LR 的富集与纯化 : 用甲醇清洗固相萃取柱 2-4 次, 再用超纯水清洗 2-4 次 ; 向清洗后的固相萃取柱内通入步骤 (1) 的上清液过柱, 过柱完 后用甲醇水溶液作淋洗液清洗富集了 MC-LR 的固相萃取柱, 除去杂质 ; 0012 (3)MC-LR 的溶出与浓缩 : 用 100甲醇作为洗脱液清洗富集了 MC-LR 的固相萃取 柱以洗脱 MC-LR, 使 MC-LR 溶出, 将溶出的 MC-LR- 甲醇。
11、混合溶液置于旋转蒸发仪, 40-60, 旋转蒸发 10-20min。 0013 上述步骤 (1) 中所述的铜绿微囊藻水样藻细胞浓度约 107个 /ml, 所述的离心在 8000-10000rpm 速度下离心 8-12 分钟。 0014 步骤 (2) 中所述的固相萃取柱为 C18 固相萃取柱 ; 所述的过柱速度均为 5ml/min ; 所述的甲醇水溶液浓度为 10 -20 (v/v), 洗涤 1-2 次。 0015 本发明的有益效果是 : 0016 (1) 本专利用的是 100的色谱纯甲醇作流动相, 提取效果更好, 样品保留更稳 定, 而且经过旋转蒸发仪浓缩后, 藻毒素样品的纯度更高, 可提取得。
12、到毫克级 MC-LR, 杂质 少, 纯度高 ; 0017 (2) 微囊藻样品中的 MC 包括胞外 MC 和胞内 MC, 因此, 总 MC 为胞外 MC 与胞内 MC 之和, 本研究采用液氮冻融的方法使藻细胞破壁, 可同时获取胞内与胞外 MC, 省去了传统过 滤方法中截留并且萃取滤膜残渣的步骤, 操作方法简便、 环保, 而且安全、 经济 ; 0018 (3) 易于工业化生产 ; 0019 (4) 样品来源于实验室培养的产毒铜绿微囊藻, 原材料价廉、 易得 ; 在研究微囊藻 毒素的同时还可以研究铜绿微囊藻的产毒变化规律等。 附图说明 0020 图 1 为实施例 1 样品的液相色谱图 ; 0021 。
13、图 2 为实施例 1 样品与 F5 反应后的色谱图。 具体实施方式 0022 下面结合附图和实施例进一步说明本发明。 0023 铜绿微囊藻水样可以采集也可实验室扩大培养。 0024 实施例 1 0025 一种提取高纯度微囊藻毒素的方法, 包括步骤如下 : 0026 (1) 取铜绿微囊藻水样 ( 藻种购自中科院水生所, 编号 905, 活化后藻细胞浓度约 为 107个 /ml)100ml, 经液氮冻融两次后离心 (effendorf, 8000r/min, 10min), 将上清液置 入空白玻璃瓶。 0027 (2) 先用 10ml 甲醇 ( 色谱纯 ) 清洗 C18 固相萃取柱 2 次, 过柱。
14、速度 5ml/min, 然后 说 明 书 CN 102516367 A 4 3/3 页 5 用 20ml 超纯水清洗 C18 富集柱 2 次, 过柱速度仍为 5ml/min ; 0028 将上清液经固相萃取装置通入清洗过的 C18 固相萃取柱 ( 过柱速度为 5ml/min), 然后用 20ml 10的甲醇作为淋洗液连续清洗 2 次 C18 富集柱 ( 过柱速度仍为 5ml/min)。 0029 (3)用10ml甲醇作为洗脱液清洗C18富集柱2次, 将MC-LR溶出于空白玻璃瓶中。 将溶出的 20ml MC-LR- 甲醇混合溶液置于旋转蒸发仪, 60旋转蒸发 20min, 浓缩至 1ml。 0。
15、030 实施例 2 一种提取高纯度微囊藻毒素的方法, 包括步骤如下 : 0031 (1) 取铜绿微囊藻水样 ( 藻种购自中科院水生所, 编号 905, 活化后藻细胞浓度约 为 107个 /ml)100ml, 经液氮冻融两次后离心 (effendorf, 8000r/min, 10min), 将上清液置 入空白玻璃瓶。 0032 (2) 先用 10ml 甲醇 ( 色谱纯 ) 清洗 C18 固相萃取柱 2 次, 过柱速度 5ml/min, 然后 用 20ml 超纯水清洗 C18 富集柱 2 次, 过柱速度仍为 5ml/min ; 0033 将上清液经固相萃取装置通入清洗过的 C18 固相萃取柱 (。
16、 过柱速度为 5ml/min), 然后用 20ml 10的甲醇作为淋洗液连续清洗 2 次 C18 富集柱 ( 过柱速度仍为 5ml/min)。 0034 (3)用10ml甲醇作为洗脱液清洗C18富集柱2次, 将MC-LR溶出于空白玻璃瓶中。 将溶出的 20ml MC-LR- 甲醇混合溶液置于旋转蒸发仪, 60旋转蒸发 20min, 浓缩至 1ml。 0035 试验 1 0036 将实施例 1 浓缩定容后的 1ml 样品用 0.22m 的玻璃纤维滤膜过滤, 滤液装入液 相瓶, 进高效液相仪分析检测。根据保留时间定性, 根据峰面积以外标法定量。 0037 实验所用HPLC为Agilent1100高。
17、效液相色谱仪, 色谱柱为SB-C18反向分析柱 ; 流 动相为甲醇水 ( 含 0.1三氟乙酸 ) 70 30(V/V) ; 流速为 0.7ml/min ; 紫外检测波长 为 238nm ; 样品注入量 : 5l ; 柱温 : 40 ; 经检测, 该样品 MC-LR 的浓度为 98.5mg/L。检测 该样品的液相色谱图如图 1 所示。可以看出, 色谱图几乎没有杂峰, 主峰很明显, 为 MC-LR, 说明样品纯度较高, 杂质少。 0038 试验 2 0039 取产毒铜绿微囊藻液100ml(藻细胞浓度约为107个/ml), 经液氮冻融两次后离心 (effendorf, 8000r/min, 10mi。
18、n), 将上清液置入空白玻璃瓶。往瓶中加入 20ml 微囊藻毒素 降解菌 F5 的菌液 ( 细菌浓度约 109个 /ml), 放入振荡培养箱 (25, 220r/min), 反应 5d 后 检测结果。 0040 对玻璃瓶中的MC-LR浓度的检测按照试验1的步骤进行操作。 检测结果表明, 与微 囊藻毒素降解菌 F5 反应后, 瓶中 MC-LR 的浓度为 262mg/L, 经计算 F5 对 MC-LR 的降解率为 68.1, 这一结果与用 MC-LR 标准品测试的结果相差无几。从而说明, 在研究微囊藻毒素降 解实验时, 完全可以自行培养微囊藻进而提取微囊藻毒素, 且提取的藻毒素浓度为毫克级, 纯度较高, 一般高校或科研院所实验室即可实现, 将大大节约实验成本, 提高实验效率。试 验 2 中与 F5 反应后的样品色谱图如图 2 所示。 0041 如上所述, 对本发明的实施例进行了详细地说明, 但是只要实质上没有脱离本发 明的发明点及效果可以有很多的变形, 这对本领域的技术人员来说是显而易见的。 因此, 这 样的变形例也全部包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 102516367 A 5 1/1 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102516367 A 6 。
- 内容关键字: 一种 提取 纯度 微囊藻 毒素 方法
泵下旋转泄油器.pdf
药物生产用的低温干燥装置.pdf
麦克风底座.pdf
蒽醌法生产过氧化氢用白土床.pdf
基于美术品制作的美术品保护箱.pdf
片材挤出机的牵引辊装置.pdf
新型除尘滤袋.pdf
全钢化真空玻璃.pdf
阀盖、截止阀及止回阀.pdf
双注塑口注塑机.pdf
大孔容射孔弹.pdf
浮动球阀.pdf
丁基胶大桶灌装机的罐装结构.pdf
微生物检测装置.pdf
耳道清洗器.pdf
水泵气密性试验用检测装置.pdf
国土空间规划用定位标杆.pdf
便于清洗的取样器.pdf
棱镜式激光清洗装置.pdf
自吸式加料混合装置.pdf
建筑场景点云分割不确定性评估方法、系统及电子设备.pdf
新型的基站通信线缆.pdf
磁敏元件立体封装结构.pdf
带自清洁和净化水域功能的水尺.pdf
激光雕刻设备及使用方法.pdf
平开门的弧形门体折弯装置.pdf
模块化遮阳板生产模具及遮阳板.pdf
建筑消防安全评估方法、设备和介质.pdf
连接器母端子.pdf
基于物联数据处理的多通路管系热输送平衡控制监管系统.pdf
飞机输油半管类零件的成形方法.pdf
图像传感器及其制作方法.pdf
一种用于低产液油井流量测量的浮子流量计.pdf
一种一孔两用的隧洞排水孔结构.pdf
钢管桩围堰结构.pdf
一种生态砌块.pdf
一种铁路桥梁用泄水管.pdf
一种卷帘门的抗风装置.pdf
一种掺有非预应力钢筋的管桩钢筋笼.pdf
大型沉管隧道管段基础.pdf
汽车手套箱开启装置.pdf
城市道路上空花园式电动跃层停车商务楼.pdf
蒸压加气砌块砌窗结构.pdf
一种升降式旋转室外消火栓.pdf
框架结构T型连接柱.pdf
防静电地板吸板器.pdf
一种建筑用箱体或井口预留孔洞活动模具.pdf
速成拉建房屋.pdf
预制桥面板精轧螺纹钢筋弧形连接构造.pdf
一种内固定式伸缩门滑行导轨及伸缩门.pdf
多用途封井器.pdf