一种拉帕醌单星素杂合体及其制备方法和医药用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510951554.4 (22)申请日 2015.12.18 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105461641 A (43)申请公布日 2016.04.06 (73)专利权人 新乡医学院 地址 453003 河南省新乡市金穗大道601号 (72)发明人 武利强张崇 (51)Int.Cl. C07D 239/70(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 CN 102911177 A,2013.02.06,全文. US 20。

2、13096067 A1,2013.04.18,全文. CN 104530056 A,2015.04.22,全文. CN 104610271 A,2015.05.13,全文. US 2009076019 A1,2009.03.19,全文. US 2010184033 A1,2010.07.22,全文. CN 102924429 A,2013.02.13,全文. 秦云植等.-拉帕醌对胃癌细胞生长与侵 袭的抑制作用及机制. 临床与实验病理学杂 志 .2015,第31卷(第6期),第601-606页. 孙敏等.细胞凋亡激动剂-拉帕醌的合成. 中国新药杂志 .2008,第17卷(第18期),第 1598。

3、-1599页. 赵健等.Monastrol对人肺癌细胞系A549有 丝分裂影响的研究. 山东大学学报(医学版) .2006,第44卷(第7期),第658-661页. 审查员 占跃晨 (54)发明名称 一种-拉帕醌-单星素杂合体及其制备方 法和医药用途 (57)摘要 本发明涉及一种-拉帕醌-单星素杂合体 及其制备方法和医药用途， 提供了一种具有式I 结构的化合物， 它的制备方法， 以及在制备肿瘤 药物中的应用。 本发明的化合物为-拉帕醌与 单星素的杂合结构， 具有较强的抗癌活性， 代谢 稳定性和好的选择性。 体外细胞毒与拓扑异构酶 I抑制试验表明该化合物对测试癌细胞与拓扑异 构酶I均有较强的抑制。

4、作用， NQO1活性测试表明 该化合物为NQO1的有效底物， 可在NQO1介导下， 通过氧化还原反应循环， 产生大量活性氧， 诱导 氧化应激， 选择性杀灭肿瘤细胞， 可作为抗癌药 物或先导化合物进一步开发。 本发明方法具有绿 色环保， 原料易得， 操作简单， 产率高的特点。 I。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 105461641 B 2017.11.21 CN 105461641 B 1.一种具有式I所示结构的化合物： I。 2.一种权利要求1所述的化合物的合成方法， 其特征在于， 将2-羟基-1,4-萘醌、 间羟基 苯甲醛、 硫脲和催化剂用量的对甲基苯磺酸溶解到适量乙酸里， 加。

5、热回流反应8-10小时， 反 应后， 将反应混合物冷却到室温， 蒸出乙酸， 粗产物依次用适量水， 乙醇洗涤， 柱层析纯化， 得到目标化合物1,2,3,4-四氢-4-(3-羟基苯基)-2-硫代苯并h喹唑琳-5,6-二酮。 3.权利要求1的化合物用于制备治疗恶性肿瘤的药物的用途。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105461641 B 2 一种 -拉帕醌-单星素杂合体及其制备方法和医药用途 技术领域 0001 本发明涉及药物化学领域， 具体涉及一种 -拉帕醌-单星素杂合体， 包括这个化合 物制备方法及作为制备治疗恶性肿瘤的药物的用途。 背景技术 0002 恶性肿瘤是当前危害人类健康的重要疾病之一。

6、， 是新世纪人类第一杀手， 对人类 生存构成最严重的威胁， 开发与研究新型有效的抗肿瘤药物是生物医药科研领域的重大课 题和长期任务。 依赖还原型辅酶I(II)醌氧化还原酶1(NQO1)是真核细胞内普遍存在的一类 黄素蛋白酶， 它可以通过去电子还原反应参与体内多种醌类的代谢和醌类药物的生物激活 过程。 NQO1在多种肿瘤细胞特别是肝癌、 结肠癌、 乳腺癌细胞中的表达远高于正常组织。 由 于NQO1在肿瘤细胞的高表达及其生物活化的特性, 它被认为是治疗多种肿瘤的潜在分子 靶标。 -拉帕醌， 化学名为3,4-二氢-2,2-二甲基-2H-萘并1,2-b-吡喃-5,6-二酮， 是一个 最有前景的NQO1。

7、靶向药物， 它是有效的NQO1底物， 可以在NQO1介导下， 通过氧化还原循环反 应， 产生活性氧自由基， 诱导氧化应激， 显著地杀灭NQO1表达的癌细胞。 另研究表明： -拉帕 醌对拓扑异构酶I也有很强的抑制， 对 -拉帕醌结构改造， 有助于发现针对NQO1或拓扑异构 酶I的抗癌药物。 0003 二氢嘧啶酮类化合物在抗肿瘤、 抗病毒、 抗菌和抗氧化等领域具有重要的药理活 性， 是近年来有机杂环化合物的合成热点之一。 具有该基本母核结构的微管纺锤体驱动蛋 白抑制剂单星素是近年来发现的一个新型抗肿瘤先导化合物， 它的特点是不影响微管稳定 性及避免产生神经毒性， 相关研究受到广泛关注。 0004 。

8、近年来， 在药效团或活性化合物之间进行合理的分子杂合， 作为药物发现的新策 略， 受到合成化学及药物化学家极大的重视。 杂合体化合物一般具有比母体化合物更好的 亲和力和药理作用， 是发现具有自主知识产权新化学实体药物的有效途径。 本发明的创新 之处在于合成了一种 -拉帕醌-单星素杂合体， 该化合物目前尚未有报道。 体外细胞毒与拓 扑异构酶I抑制试验表明该化合物对测试癌细胞与拓扑异构酶I均有较强的抑制作用， 与 NQO1的分子对接实验和NQO1活性实验表明， 该化合物与NQO1具有较高的亲和性， 能被NQO1 活化， 产生活性氧自由基， 选择性杀灭肿瘤细胞， 可作为靶向拓扑异构酶I或NQO1的抗。

9、癌药 物进一步开发。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种 -拉帕醌-单星素杂合体。 0006 本发明的另一目的在于提供所述 -拉帕醌-单星素杂合体的制备方法和医药用 途。 0007 为了实现本发明目的， 本发明的 -拉帕醌-单星素杂合体， 其为具有式I所示结构 的化合物： 说明书 1/4 页 3 CN 105461641 B 3 0008 I。 0009 具体地说， 本发明的 -拉帕醌-单星素杂合体为1,2,3,4四氢-4-(3-羟基苯基)-2- 硫代苯并h喹唑琳-5,6-二酮， 分子式： C18H12N2O3S、 分子量： 336.06、 外观： 橙黄色固体。 0010 本发明还提。

10、供上述 -拉帕醌-单星素杂合体的制备方法， 将2-羟基-1,4-萘醌、 间 羟基苯甲醛、 硫脲和催化剂用量的对甲基苯磺酸溶解到适量乙酸里， 加热回流反应8-10小 时， 反应后， 将反应混合物冷却到室温， 蒸出乙酸， 粗产物依次用适量水， 乙醇洗涤， 柱层析 纯化， 得到目标化合物1,2,3,4-四氢-4-(3-羟基苯基)-2-硫代苯并h喹唑琳-5,6-二酮。 0011 本发明制备方法的反应式为： 0012 0013 本发明提供的上述 -拉帕醌-单星素杂合体为拓扑异构酶I抑制剂和双电子氧化 还原酶NQO1的有效底物， 可用于制备治疗恶性肿瘤的靶向药物。 0014 本发明的优点及有益效果在于： 。

11、0015 1 本发明的杂合体具有 -拉帕醌与单星素的结构， 结构新颖， 具有较强的抗癌活 性和好的选择性； 0016 2 本发明化合物的抗肿瘤活性和成药性优于 -拉帕醌； 0017 3 与拓扑异构酶I抑制试验表明该化合物对拓扑异构酶I均有较强的抑制作用； 0018 4 与NQO1的分子对接实验和NQO1活性实验表明， 该化合物与NQO1具有较高的亲和 性， 能被NQO1活化， 产生活性氧自由基， 选择性杀灭肿瘤细胞， 可作为靶向NQO1的抗癌药物 进一步开发； 0019 5 本发明的制备方法具有绿色环保， 原料易得和操作简单的特点。 具体实施方式 0020 以下实施例用于说明本发明， 但不用来。

12、限制本发明的范围。 0021 实施例1 化合物的合成 0022 将1.74 g 2-羟基-1,4-萘醌， 1.22 g 3-羟基苯甲醛， 1.52 g硫脲， 0.2 g 对甲基 苯磺酸和20 mL乙酸加入到带有回流冷凝管的50 mL 烧瓶中， 搅拌回流8-10小时后， 冷却到 室温， 蒸出溶剂， 依次用水， 乙醇洗涤， 柱层析纯化， 得相应的橙黄色产品1,2,3,4-四氢-4- (3-羟基苯基)-2-硫代苯并h喹唑琳-5,6-二酮168 m g， 产率为4.8 %。 0023 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): 9.97(s, 2H), 9.52(s, 1H), 8.05-。

13、7.84(m, 4H), 7.15 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 6.80-6.76(m, 2H), 6.69-6.67(m, 1H), 5.44 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6): 181.5, 178.6, 174.9, 158.1, 143.5, 136.1, 135.3, 134.2, 132.0, 130.8, 130.3, 126.6, 126.2, 118.0, 116.5, 115.6, 114.2, 说明书 2/4 页 4 CN 105461641 B 4 52.9； ESI-HRMS m/z M-H+: 335.0489。。

14、 0024 实施例2体外抗肿瘤活性试验 0025 采用MTT法测试目标化合物的抗肿瘤活性。 以人肝癌细胞 HepG2和结肠癌细胞 HCT116为测试细胞株， 选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞， 用胰酶消化后， 用含10小牛血清 的RPMI l640培养基配成5000个/mL的细胞悬液， 接种在96孔培养板中， 每孔接种200 L， 37 ， 5CO2 培养24 小时。 设立阴性对照组， 阳性对照组及给药组。 实验组换新的含不同浓 度被测样品的培养基， 对照组则换含等体积溶剂的培养基， 阳性对照组给予阳性对照药阿 霉素 （用完全培养基稀释至浓度为10 molL- 1） ， 每组设3-5平行孔， 37。

15、 ， 5CO2 培养 4-5 天。 弃去上清液， 每孔加入200 L新鲜配制的含0.2 mg/mL MTT的无血清培养基。 37 继续培养4 小时。 小心弃上清， 并加入200 L DMSO， 用微型超声振荡器混匀后， 在酶标仪上 以试验波长为570 nm， 参比波长为450 nm测定光密度值。 按下式计算药物对肿瘤细胞生长 的抑制率： 肿瘤细胞生长抑制率(1-OD实验/OD对照) 100。 以1,2,3,4-四氢-4- (3-羟基苯基)-2-硫代苯并h喹唑琳-5,6-二酮的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图可 得到剂量反应曲线， 从中求出样品的半数杀伤浓度IC50。 其IC50值为3.18 M。

16、 (HepG2) , 3.29 M (HCT116)。 0026 实施例3 NQO1活性测试 0027 1 mL的反应体系中含有25 mM Tris/HCl(pH 7.4) , 0.7 mg/mL牛血清白蛋白, 0.1% Tween-20, 200 M NADH, 77 M Cytochrome c, 2 g 重组人NQOl和1,2,3,4-四 氢-4-(3-羟基苯基)-2-硫代苯并h喹唑琳-5,6-二酮(25 M )。 设定检测波长550nnm， 在 室温下， 加入NADH 启动反应， 从反应曲线的初始线性部分计算还原速率， 通过细胞色素c摩 尔吸光系数换算 （21.1 mM-1 cm-1）。

17、 ， 结果表示为 mol还原型细胞色素c/min/ g NQOl。 从细 胞色素 c 量的变化可以判断化合物产生活性氧的能力， 化合物在酶水平产生活性氧的速 率为1350165 mol还原型细胞色素c/min/ g NQOl。 0028 实施例4分子对接试验 0029 采用ChemBioDraw Ultra 12.0画出小分子1,2,3,4四氢-4-(3-羟基苯基)-2-硫代 苯并h喹唑琳-5,6-二酮的结构， 然后用ChemBio3D Ultra 12.0使用MMFF94力场进行优 化。 NQO1(PDB ID: 2F1O） 和化合物均使用AutodockTools 1.5.6转化为PDBQ。

18、T格式。 采用 Autodock vina 1.1.2进行分子对接研究。 NQO1的坐标设置为： center_x = 11.549， center_y = 11.875， center_z = -6.018； size_x = 15， size_y = 15， size_z = 15。 参数 exhaustiveness 设置为20。 除了特别说明， 其他参数均采用默认值。 最后， 选取打分值最高 的构象用PyMoL 1.7进行结果分析(图1)。 由图1看出， 化合物与辅酶FAD处于平行的状态， 形 成强烈的 - 堆积作用。 此外， 氢键是CP2和NQO1之间的主要相互作用。 详细分析可以得。

19、到， 化合物CP2的5-位羰基氧可以与氨基酸残基Tyr128形成氢键相互作用， 而6-位的羰基氧可 以与氨基酸残基Tyr126和Tyr128形成双重氢键作用。 更重要的是， 化合物的4-位间羟基苯 基部分平行于残基Tyr128的苯环部分， 形成强烈的 - 堆积作用。 0030 实施例4拓扑异构酶I 抑制实验 0031 Topo I酶的活性是通过观察超螺旋pBR322 DNA的松弛情况进行判断， 1个单位的 DNA Topo I定义为37 ， 标准反应条件下， 经30分钟完全松弛0.5 g负超螺旋质粒pBR322 DNA所需的Topo I的量。 待测样品先用DMSO溶解， 按所需稀释成不同浓度的。

20、待测溶液， 使终 说明书 3/4 页 5 CN 105461641 B 5 浓度分别为400 M、 200 M、 100 M、 50 M， 喜树碱同样方法稀释， 终浓度200 M。 反应混合 物 （10 L） ， 包括H2O （6.5 L） 、 10DNA Topo I Buffer （1 L） 、 0.1%BSA （1 L） 、 DNA Topo I （0.5 U） 、 pBR322 DNA(0.25 g)、 不同浓度的待测样品 （1 L） 。 加入上述反应混合物后， 离 心分离使各种成分均匀混合， 之后同时恒温30分钟， 分别加入反应终止液 （10 Loading Buffer， 1 L）。

21、 停止反应； 在1%的琼脂糖凝胶上， 于TBE缓冲液中， 75V恒压条件下电泳2 小 时， 凝胶用1 g/mL的溴化乙锭溶液染色30 分钟， 最后用凝胶成像系统观察电泳结果并照 相。 化合物在200 M可以完全抑制Topo I酶的活性(图2)。 0032 附图说明： 图1是1,2,3,4四氢-4-(3-羟基苯基)-2-硫代苯并h喹唑琳-5,6-二酮 和NQO1的分子对接， 其中虚线为形成的氢键。 图2是1,2,3,4四氢-4-(3-羟基苯基)-2-硫代 苯并h喹唑琳-5,6-二酮对拓扑异构酶I活性的影响， 其中A道： pBR322 DNA； B道： pBR322 DNA+ 0.5 U TOPO。

22、 I酶； C道： pBR322 DNA+ 0.5 U TOPO I酶+ 喜树碱 200 M； D, E, F, G 道pBR322 DNA+ 0.5 U TOPO I酶+1,2,3,4四氢-4-(3-羟基苯基)-2-硫代苯并h喹唑琳- 5,6-二酮(分别400， 200， 100， 50 M)。 0033 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说明书 4/4 页 6 CN 105461641 B 6 图1 说明书附图 1/2 页 7 CN 105461641 B 7 图2 说明书附图 2/2 页 8 CN 105461641 B 8 。