一种抗人Delta-like 4人源化抗体及其制备与应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510951483.8 (22)申请日 2015.12.17 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105384819 A (43)申请公布日 2016.03.09 (73)专利权人 中国药科大学 地址 211198 江苏省南京市江宁区龙眠大 道639号 (72)发明人 王旻吴旻贾雪莲许卓斌 王世静王泽根张娟罗晨 (74)专利代理机构 北京德崇智捷知识产权代理 有限公司 11467 代理人 王斌 (51)Int.Cl. C07K 16/28(2006.01) C1。

2、2N 15/13(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 CN 103804497 A,2014.06.21, CN 104428319 A,2015.03.18, 曹慧秋等.肺鳞状细胞癌中Notch14 和 DLL4 的表达及与微血管密度的相关性. 临床与 实验病理学杂志 .2012,第28卷(第8期),第842- 847页. 张安华等.Notch1/DLL4信号通路与VEGF在 胃癌浸润和转移中的作用及其相关性. 中国普 通外科杂志 .。

3、2010,第19卷(第4期),第374-378 页. Steven Suchting等.The Notch ligand Delta-like 4 negatively regulates endothelial tip cell formation and vessel branching. PNAS .2007,第104卷(第9期),第 3225-3230页. 审查员 周奋进 (54)发明名称 一种抗人Delta-like 4人源化抗体及其制 备与应用 (57)摘要 本发明提供了一种抗人DLL4 （delta-like 4） 人源化单克隆抗体H3L2及其制备方法和应用。 本发明利用生物信息。

4、学软件设计鼠单克隆抗体 基于CDR移植的FR区重要碱基回复突变型人源化 抗体， 该抗人DLL4人源化抗体重链可变区具有 SEQIDNO:3所示的氨基酸序列， 轻链可变区具有 SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。 本发明人源化抗 体H3L2可以高亲和力的结合人DLL4抗原 （KD值 2.2610-12M） ， 能特异性靶向HUVEC细胞表面的 DLL4抗原， 阻断DLL4对HUVEC细胞增殖的抑制作 用， 保留了亲本鼠单克隆抗体的生物学活性。 本 发明为诊断和治疗以DLL4过量表达为特征的疾 病提供了基于抗体的疗法。 权利要求书1页 说明书5页 序列表6页 附图6页 CN 105384819 B。

5、 2018.09.21 CN 105384819 B 1.一种抗人Delta-like 4 人源化抗体， 其特征在于其具有SEQ IDNO:3所示的氨基酸 序列的重链可变区和SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列的轻链可变区。 2.根据权利要求1所述的一种抗人Delta-like 4 人源化抗体， 其特征在于： 其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链和SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列的轻链。 3.一种分离的核酸分子， 其特征在于编码要求1或2所述的抗人Delta-like 4 人源化 抗体， 其中： 重链由SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列编码， 轻链由SEQ IDNO:6所示。

6、的核苷酸序 列编码； 重链可变区由SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列编码， 轻链可变区由SEQ IDNO:8所示 的核苷酸序列编码。 4.一种表达载体， 含有权利要求3所述核酸分子。 5.一种重组CHO-s宿主细胞， 其特征在于含有权利要求4所述的表达载体。 6.根据权利要求1所述一种抗人Delta-like 4 人源化抗体在制备治疗肿瘤药物中的 应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105384819 B 2 一种抗人Delta-like 4人源化抗体及其制备与应用 技术领域 0001 本发明属于生物工程领域， 具体涉及一种抗人Delta-like 4人源化抗体H3L2及其 制备与应用。

7、。 背景技术 0002 信号通路 0003 Notch通路是一条保守的信号转导途径， 在多种组织和器官的早期发育过程中， 对 细胞的发育、 生长及凋亡起着重要的调控作用。 肿瘤干细胞生物学研究发现， Notch信号通 路在肿瘤干细胞维持肿瘤的生长中发挥着关键的作用， 在许多血液癌和实体瘤中发现了 Notch 信号通路的异常激活。 血管内皮细胞表达两种Notch受体 （Notch-1和Notch-4） ， 以及 除了DLL-3外的所有配体。 其中DLL4是内皮细胞特异性配体， 其介导的Notch-1信号通路对 血管生成、 发育起重要作用。 许多血管生成信号因子 （如VEGF） 可以激活Notch。

8、-1/DLL4信号 通路， 激活的Notch-1/DLL4信号通路又会负反馈的下调VEGF受体VEGFR2的表达， 从而抑制 内皮细胞增殖和血管出芽。 阻断DLL4介导的Notch-1信号通路则会引起内皮细胞增殖、 血管 过度出芽， 产生管腔发育不完整的无功能血管， 达到抑制肿瘤生长的效果。 除此之外， 还可 以抑制肿瘤干细胞的增殖和自我更新， 进一步防止肿瘤的生长和复发。 0004 目前， 靶向notch信号通路的临床研究药物主要有两大类， 阻断-分泌酶的小分 子抑制剂 （GSI） 以及靶向notch受体、 配体的单克隆抗体。 大部分的GSI通过结合-分泌酶 复合物的活性切割位点， 从而竞争。

9、性的抑制-分泌酶对notch受体的切割， 达到阻断notch 信号通路的作用。 然而GSI对notch的抑制是非选择性的， 它可以抑制所有notch受体的切 割， 引起胃肠道的毒副作用。 同样， 靶向notch1、 notch2受体的单克隆抗体也会引起严重的 胃肠道毒副作用。 介导肠上皮细胞notch信号通路的配体主要是DLL1和DLL4， 选择性的阻断 DLL4介导的notch信号通路不仅可以达到抑制肿瘤的作用， 还可以提高靶向特异性， 减少对 正常组织的毒副作用。 0005 抗体人源化手段 0006 鼠源单克隆抗体具有亲和力高、 特异性强的优势， 但是应用于人体还有很大的缺 陷如： 1 血。

10、清中半衰期短； 2 仅有部分不同亚类的抗体能引发效应功能； 3 最大的障碍是诱 发HAMA反应。 目前克服这些困难的首选途径是鼠单克隆抗体的人源化。 最早的抗体人源化 手段是将鼠单抗的可变区和人抗体的恒定区组成嵌合抗体， 由于这两部分在空间结构上相 对独立， 其抗原亲和力保持得很好， 同时免疫原性也得到了下降， 但由于嵌合抗体上还保留 着鼠可变区， 应用于临床应用时仍可能发生强烈的HAMA反应。 在此基础上， 进一步将鼠单抗 可变区中相对保守的FR区替换成人的FR， 仅保留抗原结合部位CDR区， 即CDR移植。 然而起支 架作用的FR不仅提供了CDR的空间构象环境， 有时还参加抗体结合位点正确。

11、构象的形成。 因 此， 简单的CDR移植往往丧失或降低了原抗体的亲和力。 近年发展起来的噬菌体抗体库技术 通过PCR扩增人抗体的全套可变区基因， 通过噬菌体表面展示技术， 把Fab或单链抗体 （ScFv） 表达在噬菌体的表面， 经过吸附-洗脱-扩增过程筛选并富集特异性抗体。 噬菌体抗 说明书 1/5 页 3 CN 105384819 B 3 体库技术筛选的抗体虽然为全人源的， 但是相对于鼠源抗体亲和力和特异性仍不高。 0007 立体结构数据和同源性分析表明： 在抗原结合、 稳定CDR构象、 FR折叠这几个方面， 构成抗体FR区的残基并不具有相同的重要性。 获得抗体重、 轻链可变区序列后， 应用。

12、生物信 息学技术模拟出抗体可变区的结构模型， 在此基础上分析出对抗体构象维持起重要作用的 碱基， 选择性的进行回复突变。 此方法补偿了完全CDR移植导致的亲和力丧失， 是一种更为 可靠的人源化手段。 0008 本发明应用生物信息学软件MOE设计基于CDR移植的FR区碱基回复突变人源化抗 体， 应用MOE模拟鼠抗体Fv区三维结构， 并根据其三维结构分析维持CDR区构象必需的经典 氨基酸， 保留鼠单抗的CDR区， 根据FR区的经典氨基酸搜索人Fab sequence database， 查找 最适FR模板替换鼠单抗FR区， 在此基础上选择FR区重要的经典氨基酸进行回复突变。 发明内容 0009 发。

13、明目的 0010 本发明提供一种抗人DLL4人源化抗体H3L2及其制备方法和应用。 0011 一种抗人DLL4鼠单克隆抗体可变区的人源化设计， 保留鼠单克隆抗体重、 轻链可 变区的CDR区， 利用生物信息学软件将FR区替换为高同源性的人源FR模板， 并选择重要碱基 进行回复突变， 将得到的人源化可变区与人IgG1抗体恒定区， 通过基因重组等手段构建成 完整的人源化全长抗体 （命名为H3L2） 。 0012 一种分离的核酸， 其特征为编码H3L2抗体。 0013 一种表达载体， 含有上述的核酸。 0014 一种重组CHO-S宿主细胞， 含上述的表达载体。 0015 一种哺乳动物细胞分泌表达法， 。

14、用于分泌表达上述人源化抗体。 0016 一种纯化上述抗DLL4人源化抗体的方法。 0017 上述抗体或抗体片段的应用， 其特征在于选择性的与人DLL4结合或抑制DLL4与 notch受体的结合， 阻断其信号通路的转导。 0018 上述抗体或抗体片段或抗体片段的偶联物。 0019 抗DLL4人源化抗体在制备治疗肿瘤药物中的应用。 0020 具体来说 0021 本发明中抗DLL4人源化抗体H3L2由两条相同的重链H3和两条相同的轻链L2组成 经典的抗体结构， 重链碱基数为1404bp， 轻链碱基数为708bp， 人源化抗体蛋白分子量约为 156KDa， 其中人源碱基数占总碱基数的90%。 重、 轻。

15、链恒定区为人IgG1抗体恒定区， 抗体可变 区的人源化设计在分子建模/药物设计软件MOE上完成： 首先将鼠源抗体FR区替换为高同源 性的人源模板， 得到CDR移植抗体， 然而CDR移植抗体丧失了亲本鼠抗体的高亲和力。 研究表 明Kettleborough C A, Saldanha J, Heath V J, et al. Humanization of a mouse monoclonal antibody by CDRgrafting: the importance of framework residues on loop conformationJ. Protein Engineeri。

16、ng, 1991, 4(7):773-783.， FR区某些氨基 酸对CDR区构象、 抗体亲和力的保持起重要作用， 因此在CDR移植抗体的基础上， 我们选择了 12个FR区重要氨基酸回复突变为鼠源氨基酸以保证其亲和力， 得到人源化抗体重、 轻链可 变区序列。 说明书 2/5 页 4 CN 105384819 B 4 0022 本发明利用酶切酶连技术， 将设计合成的人源化可变区序列克隆到含有人IgG1抗 体序列的表达载体， 替换其可变区序列， 构建成功的表达载体经电穿孔转染CHO-S细胞， 经 G418筛选、 鉴定后得到稳定表达细胞株。 取细胞表达上清， 低温离心去除细胞碎片并抽滤后 采用Pro。

17、tein A柱纯化； Western Blot 鉴定所得H3L2抗体； 流式细胞术检测H3L2与HUVEC细 胞表面DLL4抗原的结合， SPR实验测定H3L2与人DLL4的亲和力常数； MTT检测H3L2阻断DLL4 对HUVEC细胞增殖的抑制作用。 一般认为鼠单抗可变区与人抗体恒定区组成的嵌合抗体与 鼠单抗的亲和力相当， 因此为了方便实验研究， 我们选用嵌合抗体作为人源化抗体的阳性 对照。 0023 本发明成功构建了人源化抗体重、 轻链的真核细胞表达载体H3- pMH3、 L2- pMH3、 H3-pCA、 L2-pCA， 筛选得到了稳定表达本发明人源化抗体的CHO-S细胞株， 其表达的抗。

18、DLL4 人源化抗体H3L2保留了鼠单克隆抗体的高亲和力 （KD值约2.2610-12M） ； 能与人脐静脉内 皮细胞HUVEC具有高特异性结合； 能够阻断DLL4对HUVEC细胞增殖的抑制作用。 本发明为诊 断和治疗以DLL4过量表达为特征的疾病提供了基于抗体的疗法。 0024 有益效果 0025 本发明利用生物信息学软件设计基于CDR移植的FR区重要碱基回复突变型人源化 抗体可变区， 将改造后的人源化抗体可变区与人IgG1型抗体恒定区拼接形成新的人源化全 长抗体H3L2， 将含有该人源化抗体基因的载体导入哺乳动物细胞表达系统CHO-S细胞中并 获得稳定表达细胞株。 大量表达并纯化H3L2，。

19、 经SPR实验验证， H3L2与人DLL4抗原亲和力常 数达到2.2610-12M， 基本上保留了鼠单克隆抗体的高亲和力； H3L2能特异性靶向人DLL4抗 原， 阻断DLL4对HUVEC细胞增殖的抑制作用， 保留了亲本鼠单克隆抗体的生物学活性。 附图说明 0026 图1 是抗DLL4人源化抗体基因的设计。 图为鼠单克隆抗体Fv区的三维结构， 所标 黄色氨基酸为FR人源模板替换后轻、 重链中需要回复突变的经典氨基酸。 轻链 （左） 中为4I、 47P、 48W、 50Y、 72Y； 重链 （右） 中为27Y、 37I、 38K、 48I、 68A、 70L、 98G。 0027 图2 是抗DL。

20、L4人源化抗体与鼠源抗体的氨基酸序列比对结果。 Z27506和J00256为 重链可变区的人源FR模板， X63399和J00242为轻链可变区的人源FR模板。 VHg/VLg表示CDR移 植抗体的重、 轻链可变区。 *表示该氨基酸与鼠源抗体对应位点的氨基酸相同。 标红色氨基 酸为回复突变为鼠源的氨基酸， 轻链中为4I、 47P、 48W、 50Y、 72Y； 重链中为27Y、 37I、 38K、 48I、 68A、 70L、 98G。 重链可变区中橙色区域分别为H-CDR1、 H-CDR2， 红色区域为H-CDR3； 轻链 可变区中紫色区域分别为L-CDR1、 L-CDR2、 L-CDR3。。

21、 MMGZ01_VH/VL表示抗DLL4鼠源抗体的 重、 轻链可变区。 CDR区的确定参考Kabat抗体注释规则Wu, T.T., Kabat, E.A.; An Analysis of the Sequences of the Variable Regions of Bence-Jones Proteins and Myeloma Light Chains and Their Implications for Antibody Complementarity; J. Exp. Med. 132 (1970) 211250. 0028 图3 是表达载体电穿孔转染CHO-S细胞后筛选稳定表达株的。

22、结果。 图A、 B为第二轮 筛选96孔板、 24孔板的Dot Blot图， 图C为T-25细胞培养瓶上清的Western Blot图 （a为非还 原型， b为还原型） ， 显示正确表达、 装配人源化抗体的细胞株。 0029 图4 是SDS-PAGE蛋白质电泳图和Western blot 鉴定人源化抗体图， 图A描述SDS- 说明书 3/5 页 5 CN 105384819 B 5 PAGE鉴定细胞发酵表达的人源化抗体经protein A 柱纯化后的结果， 图B描述Western blot 鉴定人源化抗体纯化后的结果， 所用抗体为HRP标记的羊抗人IgG （ H+L） 。 图A和图B 中， 泳道。

23、1、 2分别为非还原型的市售抗体Cetuximab （一种抗EGFR人鼠嵌合抗体） 和人源化抗 体H3L2， 泳道3 为蛋白Marker(条带分子量从上到下依次为： 250； 130； 100； 70； 55； 35； 25 kDa)， 泳道4、 5为还原型的Cetuximab和人源化抗体H3L2。 0030 图5 是抗原抗体亲和力拟合曲线， 显示人源化抗体与DLL4抗原的特异性结合， 通 过计算可以得到抗原抗体结合的亲和力常数KD值。 图A为阳性对照嵌合抗体c3rd的亲和力 拟合曲线， 图B为人源化抗体H3L2的亲和力拟合曲线， 经计算c3rd的KD值为2.9910-13 M， H3L2的K。

24、D值2.2610-12M。 0031 图6 是流式细胞结合图， 检测人源化抗体H3L2与HUVEC细胞表面DLL4抗原的结合， 阳性对照为鼠单抗可变区与人抗体恒定区组成的嵌合抗体， 二抗为FITC偶联的抗人IgG抗 体。 0032 图7 是MTT图， 显示人源化抗体H3L2阻断DLL4对HUVEC细胞增殖的抑制作用。 结果 显示， H3L2在浓度78ng/ml时， 可以有效地阻断DLL4诱导内皮细胞增殖的抑制， 与嵌合抗体 的阻断效果相当。 具体实施方式 0033 实施例1 抗DLL4人源化抗体基因的设计与构建。 0034 应用生物信息学软件模拟鼠单克隆抗体Fv区三维结构 （图1） ， 并根据。

25、其三维结构 分析维持CDR区构象必需的经典氨基酸， 根据FR区的经典氨基酸搜索人Fab sequence database， 查找最适人源FR模板， 如图2所示， Z27506和J00256为重链可变区的人源FR模板， X63399和J00242为轻链可变区的人源FR模板。 人源模板替换鼠单克隆抗体FR区得到CDR移 植抗体 （VHg/VLg） ， 在此基础上选择FR区重要的经典氨基酸进行回复突变， 得到人源化抗体 H3L2的重、 轻链可变区 （表示为VH3、 VL2） 。 0035 所得人源化重链可变区VH3具有SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列， 具有SEQ IDNO:7 所示的核苷酸序。

26、列； 人源化轻链可变区VL2具有SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列， 具有SEQ IDNO:8所示的核苷酸序列。 人源化重链H3 （可变区+恒定区） 具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸 序列， 具有SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列； 人源化轻链L2 （可变区+恒定区） 具有SEQ IDNO:2 所示的氨基酸序列， 具有SEQ IDNO:6所示的核苷酸序列。 0036 人工合成SEQ IDNO:7 及SEQ IDNO:8所示的编码核苷酸序列并克隆至pUC57- simple载体中 （金斯瑞， 南京） ， 利用酶切酶连技术将目的基因克隆至含有人IgG1重、 轻链全 长基因的表达载体pMH3。

27、-H、 pMH3-L、 pCApuro-H 和 pCApuro-L中Xie W, Li D, Zhang J, et al. Generation and characterization of a novel human IgG1 antibody against vascular endothelial growth factor receptor 2J. Cancer Immunology Immunotherapy, 2014, 63(9):877-888.， 替换其可变区， 得到含有人源化抗体重、 轻链的 表达载体:H3-pMH3、 L2-pMH3、 H3-pCA、 L2-pCA。 。

28、重链对应的酶切位点为EcoR 和Nhe ， 轻链对 应的酶切位点为EcoR 和Sal 。 0037 实施例2 抗体稳定表达细胞株的筛选。 0038 以上述构建成功的四种载体质粒电穿孔共转染CHO-S细胞， 电穿孔转染条件为： 说明书 4/5 页 6 CN 105384819 B 6 160V， 15ms。 24h后加G418筛选 （终浓度为7001000 g/ml） ， 每23天换液， 约10天后克隆长 成， 挑取克隆至96孔板中培养， 待细胞长满后取上清做Dot Blot， 作用抗体为HRP标记的羊 抗人IgG （H+L） 。 根据Dot Blot结果选取阳性克隆扩大至24孔板中培养后取上清。

29、做Dot Blot； 选取阳性克隆扩大至T-25培养瓶中培养， 取上清做Western Blot， 选取表达、 装配正 确的细胞株冻存并进行第二轮筛选， 筛选步骤同上。 经过两轮筛选得到表达、 装配正确的细 胞株为我们需要的稳定表达株。 0039 结果见图3。 0040 实施例3 抗体的表达和纯化 0041 将细胞培养上清以0.22 m滤膜抽滤， 然后通过蠕动泵载入Protein A层析柱内， 上 样完毕后， 用Binding buffer洗涤柱子至紫外信号线平直。 然后用0.1 M pH3.0 醋酸钠缓 冲液 （Elution buffer） 洗脱样品， 洗脱5个柱体积。 为了中和Eluti。

30、on buffer中的酸性物 质， 在样品接收管中按100 l/ml洗脱液加入1M pH9.0 Tris； 洗脱样品进行SDS-PAGE纯度分 析并超滤换液， 使用Bio-Tek蛋白微量定量仪对抗体浓度进行测定。 0042 结果见图4。 0043 实施例4 SPR测定抗原抗体亲和力。 0044 应用Biacore X100 作为SPR-依赖的生物传感器来检测人源化抗体与rhDLL4 （重 组人DLL4） 之间的相互作用。 参照说明书将rhDLL4 固定至CM5传感芯片上， 再往流动池内注 入系列浓度的目标蛋白 （12.5nM、 6.25nM、 3.125nM、 1.5625nM、 0.7812。

31、5nM、 0.39nM、 0.195nM、 0.098nM） ， 监测目标蛋白与配体之间结合引起的响应值RU， 对所获得曲线进行拟合， 计算抗 rhDll4 mAb与抗原的亲和力。 最后用NaOH洗脱再生芯片。 0045 结果见图5。 0046 实施例5 流式细胞术检测抗体与HUVEC细胞表面抗原的结合 0047 HUVEC细胞长至汇合度8090%， 胰酶消化并用PBS重悬， 将细胞浓度调整至106个/ ml， 取250 l已稀释好的细胞与250 l用2%FBS+PBS稀释的人源化抗体及嵌合抗体， 4避光 孵育1h， 2%FBS+PBS洗两次， 加入已稀释好的FITC标记的抗人IgG抗体250。

32、 l， 4避光孵育 1h， 流式检测。 0048 结果见图6。 0049 实施例6 MTT检测抗体对HUVEC细胞增殖的促进作用 0050 往96孔板中加入100 l已用碳酸盐缓冲液稀释至1 g/ml的rhDLL4， 4包被过夜。 次日， PBS洗两遍， 往每孔中加入4000个人脐静脉内皮细胞， 和不同浓度的抗体(20、 5、 1.25、 0.625、 0.3125、 0.15625、 0.078、 0.039、 0.019 g/ml)， 每个浓度3个复孔； 同时准备一块没有 包被rhDLL4的96孔板， 往每孔中加入4000个人脐静脉内皮细胞， 和上述不同浓度的抗体， 每 个浓度3个复孔。 。

33、于37， 5% CO2中培养72h， MTT法检测细胞的增殖。 0051 结果见图7。 说明书 5/5 页 7 CN 105384819 B 7 0001 序列表 0002 中国药科大学 0003 一种抗人Delta-like 4人源化抗体及其制备与应用 0004 2015 0005 8 0006 PatentIn version 3.5 0007 1 0008 468 0009 PRT 0010 人工序列 0011 1 0012 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 0013 1 5 10 15 001。

34、4 Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 0015 20 25 30 0016 Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 0017 35 40 45 0018 Phe Ser Gly Tyr Trp Met Gln Trp Ile Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly 0019 50 55 60 0020 Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly A。

35、sp Thr Arg Tyr 0021 65 70 75 80 0022 Thr Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr 0023 85 90 95 0024 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 0025 100 105 110 0026 Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Asn Phe Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 0027 115 120 125 0028 Gly Thr 。

36、Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 0029 130 135 140 0030 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 0031 145 150 155 160 0032 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 0033 165 170 175 0034 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Va。

37、l His Thr Phe Pro 0035 180 185 190 0036 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 0037 195 200 205 0038 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 序列表 1/6 页 8 CN 105384819 B 8 0039 210 215 220 0040 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys。

38、 Ser 0041 225 230 235 240 0042 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 0043 245 250 255 0044 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 0045 260 265 270 0046 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 0047 275 280 285 0048 His Glu Asp。

39、 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 0049 290 295 300 0050 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 0051 305 310 315 320 0052 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 0053 325 330 335 0054 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala L。

40、eu Pro Ala Pro 0055 340 345 350 0056 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 0057 355 360 365 0058 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 0059 370 375 380 0060 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 0061 385 390 395 400 0062 G。

41、lu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 0063 405 410 415 0064 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 0065 420 425 430 0066 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 0067 435 440 445 0068 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln。

42、 Lys Ser Leu Ser Leu 0069 450 455 460 0070 Ser Pro Gly Lys 0071 465 0072 2 0073 236 0074 PRT 0075 人工序列 0076 2 0077 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 序列表 2/6 页 9 CN 105384819 B 9 0078 1 5 10 15 0079 Gly Ser Thr Gly Glu Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser 0080 20 。

43、25 30 0081 Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser 0082 35 40 45 0083 Ile Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser 0084 50 55 60 0085 Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 0086 65 70 75 80 0087 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly T。

44、hr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile 0088 85 90 95 0089 Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 0090 100 105 110 0091 Ser Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 0092 115 120 125 0093 Val Asp Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro 0094 130 135 140 0。

45、095 Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile 0096 145 150 155 160 0097 Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser 0098 165 170 175 0099 Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser 0100 180 185 190 0101 Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Ty。

46、r Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln 0102 195 200 205 0103 Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser 0104 210 215 220 0105 Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 0106 225 230 235 0107 3 0108 116 0109 PRT 0110 人工序列 0111 3 0112 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 0113 1 5 10 15 0114 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly Tyr 0115 20 25 30 0116 Trp M。