组织工程皮肤构建方法及用其制备的组织工程皮肤.pdf

《组织工程皮肤构建方法及用其制备的组织工程皮肤.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《组织工程皮肤构建方法及用其制备的组织工程皮肤.pdf（6页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)授权公告号 CN 101297981 B (45)授权公告日 2011.11.02 CN 101297981 B *CN101297981B* (21)申请号 200810116108.1 (22)申请日 2008.07.03 A61L 27/60(2006.01) G01N 33/48(2006.01) (73)专利权人 中国检验检疫科学研究院 地址 100123 北京市朝阳区高碑店北路 - 甲 3 号中国检验检疫科学研究院 (72)发明人 邹运动 董益阳 王军兵 郑洪艳 程艳 李铭 杨晓冉 (74)专利代理机构 北京双收知识产权代理有限 公司 11241 代理人 解政文 CN 13。

2、10027 A,2001.08.29, 全文 . CN 1569258 A,2005.01.26, 全文 . JP 9-173362 A,1997.07.08, 全文 . (54) 发明名称 组织工程皮肤构建方法及用其制备的组织工 程皮肤 (57) 摘要 一种组织工程皮肤构建方法， 包括以下步骤 ： (1) 配制组织工程皮肤培养液， (2) 制备人体成纤 维细胞饲养层， (3) 制备凝胶生物材料， (4) 构建 和培养组织工程皮肤。本发明组织工程皮肤构建 方法， 系采用添加经过抑制增殖处理的成纤维细 胞来完成与表皮细胞的相互作用， 从而提高表皮 细胞的成熟和分化程度， 对提高化合物体外毒性 检。

3、测的精确度有着重要的作用， 从而使其制备的 组织工程皮肤能够更有效阻挡化合物对活性细胞 的毒性作用， 提高组织工程皮肤对化合物毒性的 预测精确度， 最终产生更多有效的基于组织工程 皮肤的动物替代检测方法。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 赵莉 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 CN 101297981 B1/1 页 2 1. 一种组织工程皮肤构建方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： (1) 配制组织工程皮肤培养液 ： 以商用无血清表皮细胞培养液为基础液， 再按每 500mL 基础液标准添加胰岛素2050ng， 氢化可。

4、的松100300g， 维生素C 2040mg， 氯化钙 1 2mM ； (2) 制备人体成纤维细胞饲养层 ： 将人体来源的成纤维细胞经抑制增殖处理后， 以常 规细胞培养液添加体积比 2 20血清培养 ； 所述抑制增殖处理为用 5 100Gy 或 射线照射处理 0.5 20h 或利用丝裂霉素 C 或博莱霉素处理 0.5 20h ； (3) 制备凝胶生物材料 ： 将 I 型胶原蛋白、 壳聚糖、 透明质酸和硫酸软骨素按照 8 12 1 3 1 2 1 2 质量份配比混合均匀， 然后以 1M 氢氧化钠溶液调节 PH 至 7.2 7.4 ； (4) 构建和培养组织工程皮肤 ： 将所述步骤 (2) 制备的。

5、 1 10105个成纤维细胞与 13mL所述步骤(3)制备的凝胶生物材料充分混合， 得复合物， 所述复合物在37， 5CO2 培养箱中培养2h， 然后在上面添加110105/mL人源表皮细胞悬液1mL， 继续培养1h后， 添加由所述步骤 (1) 配制的组织工程皮肤培养液 3 5mL， 继续培养至第 5 天， 将所得的组 织工程皮肤进行气液面培养， 第 20 天结束培养， 获得含有完好分化和成熟的表皮结构的组 织工程皮肤。 2. 根据权利要求 1 所述的组织工程皮肤构建方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (1) 中按每 500mL 基础液标准添加胰岛素 35ng， 氢化可的松 200g， 维生素 。

6、C 30mg， 氯化钙 1.5mM。 3. 根据权利要求 1 所述的组织工程皮肤构建方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (2) 中以常 规细胞培养液添加体积比 10血清培养。 4.根据权利要求1所述的组织工程皮肤构建方法， 其特征在于 ： 所述步骤(3)中将I型 胶原蛋白、 壳聚糖、 透明质酸和硫酸软骨素按照 10 2 1 1 质量份配比混合均匀。 5. 利用权利要求 1 4 任一项所述的组织工程皮肤构建方法制备的组织工程皮肤。 6. 权利要求 5 所述的组织工程皮肤在体外检测化合物毒性中的应用。 权 利 要 求 书 CN 101297981 B1/4 页 3 组织工程皮肤构建方法及用其制备的组。

7、织工程皮肤 技术领域 0001 本发明涉及一种利用组织工程技术构建皮肤的方法。 背景技术 0002 皮肤是人体最大的器官， 它由三部分即表皮层、 真皮层和皮下层构成。 表皮层位于 皮肤的最外层， 厚度介于 0.06-0.8mm 之间， 其微结构由基底层、 棘细胞层、 颗粒细胞层和角 质层构成。 角质层是表皮细胞分化的最后产物， 其组成中75-80为蛋白质， 5-15为 脂类， 由 10-15 层细胞构成厚度大约 10m 的结构。角质层有着许多重要的生理功能， 能够 有效阻挡外界毒性化合物对皮肤活性细胞的损伤， 特别是对化妆品成分中潜在可能产生的 细胞毒性有着极为重要的屏障作用。 0003 组织。

8、工程皮肤经历了从表皮替代物、 真皮替代物到双层结构的组织工程皮肤替 代物的阶段， 其基础研究和应用研究有了广泛的进步。应用研究涉及体内应用和体外应 用， 体内应用集中在各种皮肤创伤的治疗， 体外主要运用于化合物的毒性检测， 如化合物的 腐蚀性、 刺激性、 光毒性、 尘殖毒性等的检测。体外毒性检测方面， 欧洲替代方法验证中心 (ECVAM) 主导的对各种动物替代方法进行的验证工作是一项系统工程， 引起了世界范围的 关注。以组织工程皮肤为例， 进行的化合物腐蚀性检测目前只有 EpiDerm 和 EpiSkin 两种 产品通过验证， 刺激性检测目前仅有 EpiSkin 通过了验证。通过验证的组织工程。

9、皮肤产品 数量之所以如此少， 很大程度上是因为构建的组织工程皮肤的角质层成熟和分化不完全所 致。因为角质层成熟和分化的不完全， 造成检测化合物对活性细胞产生的毒性与其本身体 内产生毒性的数据不符， 导致误判率偏高， 不能达到要求的预测精确度。 0004 目前， 有关角质层成熟和分化的机制研究较多， 体内体外的研究均有力的证实表 皮细胞的分化与上皮 - 间充质相互作用有关， 即和真皮成纤维细胞密切相关。所以， 添加真 皮成纤维细胞的组织工程皮肤在阻挡化合物对活性细胞毒性方面有着显著作用。但是， 目 前对化合物毒性的检测是用 MTT 方法测量表皮细胞的存活率， 这样， 混有表皮细胞和成纤 维细胞的。

10、双层组织工程皮肤就无法得到准确结果。 由此， 即使能够形成分化完好的角质层， 含有表皮细胞和成纤维细胞的组织工程皮肤检测化合物毒性在目前是不适用的。经检索， 有关利用成纤维细胞促进角质层分化完好， 同时产品又不含有成纤维细胞的组织工程皮肤 构建方法， 至今尚未见有技术文献公开。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种表皮角质层结构分化完好， 同时产品又不含有成纤维 细胞的组织工程皮肤的构建方法及用其制备的组织工程皮肤。 0006 本发明所采取的技术方案如下 ： 0007 一种组织工程皮肤构建方法， 包括以下步骤 ： 0008 (1) 配制组织工程皮肤培养液 ： 以商用无血清表皮细胞培养液。

11、为基础液， 再按每 500mL 基础液标准添加胰岛素 20 50ng， 氢化可的松 100 300g， 维生素 C 20 40mg， 说 明 书 CN 101297981 B2/4 页 4 氯化钙 1 2mM ； 0009 (2) 制备人体成纤维细胞饲养层 ： 将人体来源的成纤维细胞经抑制增殖处理后， 以常规细胞培养液添加体积比 2 20血清培养 ； 0010 (3) 制备凝胶生物材料 ： 将 I 型胶原蛋白、 壳聚糖、 透明质酸和硫酸软骨素按照 8 12 1 3 1 2 1 2 质量份配比混合均匀， 然后以 1M 氢氧化钠溶液调节 PH 至 7.2 7.4 ； 0011 (4) 构建和培养组。

12、织工程皮肤 ： 将所述步骤 (2) 制备的 1 10105个成纤维细 胞与 1 3mL 所述步骤 (3) 制备的凝胶生物材料充分混合， 得复合物， 所述复合物在 37， 5 CO2培养箱中培养 2h， 然后在上面添加 1 10105/mL 人源表皮细胞悬液 1mL， 继续培 养 1h 后， 添加由所述步骤 (1) 配制的组织工程皮肤培养液 3 5mL， 继续培养至第 5 天， 将 所得的组织工程皮肤进行气液面培养， 第 20 天结束培养， 获得含有完好分化和成熟的表皮 结构的组织工程皮肤。 0012 本发明组织工程皮肤构建方法， 所述步骤 (1) 中最优为按每 500mL 基础液标准添 加胰岛。

13、素 35ng， 氢化可的松 200g， 维生素 C 30mg， 氯化钙 1.5mM。 0013 本发明组织工程皮肤构建方法， 所述步骤 (2) 中的抑制增殖处理为用 5 100Gy 射线照射处理 0.5 20h 或利用化合物处理 0.5 20h。所述射线可以为 、 射线等 ； 所述化合物可以为丝裂霉素 C、 博莱霉素等。 0014 本发明组织工程皮肤构建方法， 所述步骤 (2) 中最优以常规细胞培养液添加体积 比 10血清培养。 0015 本发明组织工程皮肤构建方法， 所述步骤 (3) 中最优将 I 型胶原蛋白、 壳聚糖、 透 明质酸和硫酸软骨素按照 10 2 1 1 质量份配比混合均匀。 0。

14、016 利用本发明组织工程皮肤构建方法制备的组织工程皮肤及其在体外检测化合物 毒性中的应用。 0017 本发明组织工程皮肤构建方法中， 所用原辅材料人源表皮细胞、 人源成纤维细胞、 壳聚糖、 I 型胶原蛋白、 透明质酸、 硫酸软骨素、 氯化钙等， 均应符合无菌要求。 0018 本发明组织工程皮肤构建方法， 系采用添加经过抑制增殖处理的成纤维细胞来完 成与表皮细胞的相互作用， 从而提高表皮细胞的成熟和分化程度， 对提高化合物体外毒性 检测的精确度有着重要的作用， 从而使其制备的组织工程皮肤能够更有效阻挡化合物对活 性细胞的毒性作用， 提高组织工程皮肤对化合物毒性的预测精确度， 最终产生更多有效的。

15、 基于组织工程皮肤的动物替代检测方法。 0019 本发明具有以下优点 ： 一是方法简便， 所有材料均以液体形式， 便于产品的合成和 规模尘产 ； 二是产品具有分化完好的角质层， 利于阻挡化合物毒性 ； 三是产品用于体外分 析时， 不参杂有成纤维细胞， 提高分析准确度 ； 四是获得的产品便于质量控制， 缩小批次之 间变异。 具体实施方式 0020 为进一步说明本发明， 结合以下实施例具体阐述 ： 0021 实施例 1 ： 0022 首先以 Gibco 公司无血清表皮细胞培养液 K-SFM 为基础液， 再按 500mL 基础液标 说 明 书 CN 101297981 B3/4 页 5 准添加胰岛素。

16、 35ng， 氢化可的松 200g， 维生素 C 30mg， 氯化钙 1.5mM， 配制组织工程皮肤 培养液 ； 将 I 型胶原蛋白、 壳聚糖、 透明质酸和硫酸软骨素按照 10 2 1 1 质量份配比 混合均匀， 然后以 1M 氢氧化钠调节 PH 至 7.2， 制备凝胶生物材料 ； 将人体来源的成纤维细 胞用丝裂霉素 C 处理 2.5h 后， 以常规细胞培养液 DMEM 添加 10血清培养制备人体成纤维 细胞饲养层 ； 将制备的人体成纤维细胞饲养层细胞以 5105/mL 与凝胶生物材料 2mL 充分 混合， 得复合物， 复合物在 37， 5 CO2培养箱中培养 2h， 然后在上面添加 5105。

17、/mL 表皮 细胞悬液 1mL， 继续培养 1h， 添加组织工程皮肤培养液 4mL。第 5 天， 将组织工程皮肤进行 气液面培养， 第 20 天结束培养， 获得含有完好分化和成熟的表皮角质层结构的组织工程皮 肤。 0023 实施例 2 ： 0024 首先以 Gibco 公司无血清表皮细胞培养液 K-SFM 为基础液， 再按 500mL 基础液标 准添加胰岛素 20ng， 氢化可的松 300g， 维生素 C 20mg， 氯化钙 2mM， 配制组织工程皮肤培 养液 ； 将 I 型胶原蛋白、 壳聚糖、 透明质酸和硫酸软骨素按照 12 2 1 1 质量份配比混 合均匀， 然后以 1M 氢氧化钠调节 P。

18、H 至 7.2， 制备凝胶生物材料 ； 将人体来源的成纤维细胞 用10Gy射线照射处理18h后， 以常规细胞培养液DMEM添加2血清培养制备人体成纤维 细胞饲养层 ； 将制备的人体成纤维细胞饲养层细胞以 10105/mL 与凝胶生物材料 3mL 充分 混合， 得复合物， 复合物在37， 5CO2培养箱中培养2h， 然后在上面添加10105/mL表皮 细胞悬液 1mL， 继续培养 1h， 添加组织工程皮肤培养液 5mL。第 5 天， 将组织工程皮肤进行 气液面培养， 第 20 天结束培养， 获得含有完好分化和成熟的表皮角质层结构的组织工程皮 肤。 0025 实施例 3 ： 0026 首先以 Gi。

19、bco 公司无血清表皮细胞培养液 K-SFM 为基础液， 再按 500mL 基础液标 准添加胰岛素 50ng， 氢化可的松 100g， 维生素 C 40mg， 氯化钙 1mM， 配制组织工程皮肤培 养液 ； 将 I 型胶原蛋白、 壳聚糖、 透明质酸和硫酸软骨素按照 9 3 1 1 质量份配比混 合均匀， 然后以 1M 氢氧化钠调节 PH 至 7.3， 制备凝胶生物材料 ； 将人体来源的成纤维细胞 用博莱霉素处理 5h 后， 以常规细胞培养液 DMEM 添加 8血清培养制备人体成纤维细胞饲 养层 ； 将制备的人体成纤维细胞饲养层细胞以 1105/mL 与凝胶生物材料 3mL 充分混合， 得 复合。

20、物， 复合物在37， 5CO2培养箱中培养2h， 然后在上面添加1105/mL表皮细胞悬液 1mL， 继续培养1h， 添加组织工程皮肤培养液3mL。 第5天， 将组织工程皮肤进行气液面培养， 第 20 天结束培养， 获得含有完好分化和成熟的表皮角质层结构的组织工程皮肤。 0027 实施例 4 ： 0028 首先以 Gibco 公司无血清表皮细胞培养液 K-SFM 为基础液， 再按 500mL 基础液标 准添加胰岛素 40ng， 氢化可的松 150g， 维生素 C 25mg， 氯化钙 1mM， 配制组织工程皮肤培 养液 ； 将 I 型胶原蛋白、 壳聚糖、 透明质酸和硫酸软骨素按照 8 2 2 2。

21、 质量份配比混 合均匀， 然后以 1M 氢氧化钠调节 PH 至 7.4， 制备凝胶生物材料 ； 将人体来源的成纤维细胞 用60Gy射线处理3h后， 以常规细胞培养液DMEM添加15血清培养制备人体成纤维细胞 饲养层 ； 将制备的人体成纤维细胞饲养层细胞以 8105/mL 与凝胶生物材料 1mL 充分混合， 得复合物， 复合物在37， 5CO2培养箱中培养2h， 然后在上面添加8105/mL表皮细胞悬 液1mL， 继续培养1h， 添加组织工程皮肤培养液4mL。 第5天， 将组织工程皮肤进行气液面培 说 明 书 CN 101297981 B4/4 页 6 养， 第 20 天结束培养， 获得含有完好。

22、分化和成熟的表皮角质层结构的组织工程皮肤。 0029 实施例 5 ： 0030 首先以 Gibco 公司无血清表皮细胞培养液 K-SFM 为基础液， 再按 500mL 基础液标 准添加胰岛素 30ng， 氢化可的松 250g， 维生素 C 35mg， 氯化钙 1mM， 配制组织工程皮肤培 养液 ； 将 I 型胶原蛋白、 壳聚糖、 透明质酸和硫酸软骨素按照 11 3 2 1 质量份配比混 合均匀， 然后以 1M 氢氧化钠调节 PH 至 7.4， 制备凝胶生物材料 ； 将人体来源的成纤维细胞 用丝裂霉素C处理15h后， 以常规细胞培养液DMEM添加15血清培养制备人体成纤维细胞 饲养层 ； 将制备。

23、的人体成纤维细胞饲养层细胞以 3105/mL 与凝胶生物材料 2mL 充分混合， 得复合物， 复合物在37， 5CO2培养箱中培养2h， 然后在上面添加3105/mL表皮细胞悬 液1mL， 继续培养1h， 添加组织工程皮肤培养液3mL。 第5天， 将组织工程皮肤进行气液面培 养， 第 20 天结束培养， 获得含有完好分化和成熟的表皮角质层结构的组织工程皮肤。 0031 试验例 ： 0032 将按照实施例 1 的方法构建的含有完好分化和成熟的表皮角质层结构的组织工 程皮肤置于中性福尔马林溶液中固定 24h， 常规制备组织学切片， 并进行 HE 染色。通过 HE 染色的结果， 发现采用本方法构建的。

24、组织工程皮肤表皮层角质分化完好， 未见成纤维细胞 混杂。 0033 注 ： 本说明书中的术语解释 ： 0034 MTT 方法 ： 0035 以活细胞代谢物还原剂 MTT 噻唑蓝为基础， 作用于活细胞线粒体中的呼吸链， 在 琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C 的作用下生成蓝色的 formazan 结晶， formazan 结晶的生成量 仅与活细胞数目成正比。生成的 formazan 结晶能够在特定的溶解液中溶解， 利用酶标仪测 定光密度值， 从而检测出细胞数目。 0036 HE 染色 ： 0037 即利用苏木精和伊红对切片进行的染色， 经过 HE 染色后， 细胞核显示为蓝紫色， 细胞质显示为红色或淡红色。 0038 本发明中涉及的如无特殊说明外， 均指的是重量百分比。 0039 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述， 并非对本发明的范 围进行限定， 在不脱离本发明设计精神的前提下， 本领域普通工程技术人员对本发明的技 术方案作出的各种变形和改进， 均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。 说 明 书 。