一种融合基因真核表达构建体、基因工程疫苗及其制备方法.pdf

《一种融合基因真核表达构建体、基因工程疫苗及其制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种融合基因真核表达构建体、基因工程疫苗及其制备方法.pdf（64页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、10申请公布号CN104059941A43申请公布日20140924CN104059941A21申请号201310088674722申请日20130319C12N15/85200601C12N15/86200601C12N15/867200601C12N15/66200601A61K48/00200601A61K39/3920060171申请人苏州工业园区唯可达生物科技有限公司地址215000江苏省苏州市工业园区星湖街218号生物纳米园A3楼308室72发明人徐建青万延民74专利代理机构苏州华博知识产权代理有限公司32232代理人孟宏伟54发明名称一种融合基因真核表达构建体、基因工程疫苗及其制。

2、备方法57摘要本发明提供了一种融合基因真核表达构建体，所述融合基因真核表达构建体包含CTA和/或CTB编码基因，或包含CTA和/或CTB编码基因片段与目的抗原基因相连的融合基因。本发明还提供一种融合基因基因工程疫苗及其制备方法。本发明的融合基因真核表达构建体能在真核生物细胞或真核生物体内表达目的融合基因抗原，可活化产生针对所述目的抗原的免疫应答。因此本发明能够提高针对所述目的抗原的免疫应答，尤其是细胞免疫应答，从而有助于提高疫苗的免疫效果。此外，本发明的真核表达构建体在体内还具有佐剂的效果，可显著性提高与之相连的目的抗原的免疫应答水平。51INTCL权利要求书1页说明书15页序列表35页附图1。

3、2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书15页序列表35页附图12页10申请公布号CN104059941ACN104059941A1/1页21一种融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述融合基因真核表达构建体包含CTA和/或CTB编码基因，或包含CTA和/或CTB编码基因片段与目的抗原基因相连的融合基因。2如权利要求1所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列为SEQIDNO1；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列为SEQIDNO2；所述CTA编码基因核酸序列为SEQIDNO3；所述CTB编码基因核酸序列为SEQIDNO4。3如权。

4、利要求12任一所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述目的抗原基因来源于病原微生物和/或动物细胞的抗原。4如权利要求12任一所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述真核表达构建体为质粒DNA载体、重组病毒载体、慢病毒载体。5如权利要求12任一所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述真核表达构建体是包括TRIVNCTA和/或TRIVNCTB融合基因的真核表达构建体。6如权利要求12任一所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述真核表达构建体是包括VP1CTA和/或VP1CTB融合基因的真核表达构建体。7如权利要求12任一所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述真核表达。

5、构建体是包括HACTA和/或HACTB融合基因的真核表达构建体。8如权利要求12任一所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述真核表达构建体是包括OVACTA融合基因的真核表达构建体。9一种融合基因基因工程疫苗，其特征在于，所述基因工程疫苗包括权利要求1至8所述的融合基因真核表达构建体。10一种制备融合基因基因工程疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括将目的抗原基因编码核苷酸序列与CTA和/或CTB编码核苷酸相连成融合基因，并克隆至真核表达构建体的步骤。权利要求书CN104059941A1/15页3一种融合基因真核表达构建体、基因工程疫苗及其制备方法技术领域0001本发明涉及生物工程领域，具。

6、体涉及一种真核表达构建体及其基因工程疫苗。背景技术0002霍乱毒素（CHOLERATOXIN，CT）作为一种公认的粘膜免疫佐剂，已经广泛应用于疫苗开发和应用研究。天然的CT分子是由一个A亚单位（CTA）和五个相同的形成环状的B亚单位（CTB）结成的六聚体。A亚单位易被外源性蛋白水解酶切断其二硫键，产生由单一的二硫键连结的AL和A2片段。A1片段具有ADP核糖基化转移酶活性，能够催化某些哺乳动物蛋白的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性ADP核糖基化，尤其是三聚体GTP结合蛋白GS的调节亚单位调节腺苷酸环化酶的活性，此作用导致环腺苷酸（CAMP）的细胞内浓度增高和蛋白激酶A的活化以及肠细胞内的主要氯化物通。

7、道的磷酸化和开放。A2片段是一种衔接分子，其主要功能是与B亚单位相结合。B亚单位能与大多数哺乳动物小肠粘膜上皮细胞上的GMI神经节苷脂受体结合，介导A亚单位进入细胞，而GM1几乎分布于体内所有细胞类型中，如T细胞、B细胞、抗原呈递细胞以及上皮细胞等，因而也利于抗原进入细胞。0003多年来对CT免疫原性和佐剂活性的研究认为，作为一种黏膜免疫佐剂，CT是直接作用于免疫系统，提高整体的反应强度，使针对于抗原的免疫反应增强。0004现有的关于CT佐剂的研究中，多是将其作为蛋白疫苗的佐剂经口途径投递，以刺激活化肠黏膜免疫。这是由于一直以来的观点均认为CT佐剂活性主要依赖粘膜途径，是一种有效的粘膜疫苗佐剂。

8、，一般以蛋白疫苗的形式进行投递，理论上难以将其直接通过系统途径投递而产生佐剂效果。0005然而实际上CT发挥佐剂作用的机制有多种可能性，这是由它的分子特性决定的。但虽然已经过多年的研究，CT佐剂活性的分子机理却一直没有被真正阐明，人们对有关的信号传导途径知之甚少，从而妨碍了对它的应用。发明内容0006针对上述问题，本发明提供了一种融合基因表达构建体，提供了另一种实现CTA、CTB佐剂效果的技术手段，拓宽了对于CT佐剂的应用。0007为达到上述目的，本发明的技术方案是一种融合基因真核表达构建体，所述融合基因真核表达构建体包含CTA和/或CTB编码基因，或包含CTA和/或CTB编码基因片段与目的抗。

9、原基因相连的融合基因。0008优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列为SEQIDNO1；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列为SEQIDNO2；所述CTA编码基因核酸序列为SEQIDNO3；所述CTB编码基因核酸序列为SEQIDNO4。0009优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQIDNO1有90同源；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQIDNO2有90同源。说明书CN104059941A2/15页40010优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQIDNO1有95同源；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQIDNO2有95同源。0011优选的，所述目的抗原基因。

10、来源于病原微生物和/或动物细胞的抗原。所述目的抗原基因可以来源于病毒、细菌等病原微生物，也可以来源于动物细胞，例如肿瘤抗原。所述病原微生物包括但不限于HIV、HBV、流感病毒、肠道病毒等。0012优选的，所述真核表达构建体为质粒DNA载体、重组病毒载体、慢病毒载体。0013优选的，所述真核表达构建体为质粒DNA载体。所述质粒DNA载体包括可商购的PVAX1（英杰（INVITROGEN）载体、PDRVISV10载体（本文为叙述方便起见，以下简称为PSV10）（参见中国国家发明专利2004100282803权利要求1）等。在本发明的一实施方式中，所述质粒DNA载体是PSV10载体。在本发明另一实施。

11、方式中，所述质粒DNA载体是PVAX1。0014优选的，所述真核表达构建体是包括TRIVNCTA或TRIVNCTB融合基因的真核表达构建体。0015优选的，所述真核表达构建体是包括VP1CTA或VP1CTB融合基因的真核表达构建体。0016优选的，所述真核表达构建体是包括HACTA或HACTB融合基因的真核表达构建体。0017优选的，所述真核表达构建体是包括OVACTA融合基因的真核表达构建体。0018优选的，所述疫苗是目的抗原基因可以在受体内表达的任意疫苗形式，如可以是DNA疫苗，重组病毒载体疫苗；优选DNA疫苗。0019优选的，所述的目的抗原基因是HIV病毒的抗原基因。0020优选地，所述。

12、的目的抗原基因是TAT、REV、INT、VIF、NEF或其融合基因。0021优选的，所述目的抗原基因是肠道病毒抗原基因。0022优选的，所述目的抗原基因是源于肠道病毒71型（EV71）的衣壳蛋白编码基因VP1。0023优选的，所述目的抗原基因是流感病毒抗原基因。0024优选的，所述目的抗原基因是流感病毒血凝素（HA）基因。0025本发明提供了一种含有融合基因的真核表达构建体载体，所述融合基因真核表达构建体是由真核表达构建体与包含CTA和/或CTB编码基因，或CTA和/或CTB编码基因核苷酸序列与目的抗原基因编码核苷酸序列相连的融合基因通过可操作连接而成，且所述融合基因位于所述真核表达构建体的真。

13、核启动子元件与终止子元件之间，使得所述融合基因真核表达构建体能在真核生物细胞或真核生物体内表达目的融合基因抗原，可活化产生针对所述目的抗原的免疫应答。此外，所述融合基因真核表达构建体在体内还具有佐剂的效果，可显著提高与之相连的目的抗原的免疫应答水平，因而，所述融合基因真核表达构建体可以用于基因工程疫苗。0026所述融合基因的融合方式可以是目的抗原编码核苷酸序列在上游，CTA和/或CTB编码核苷酸序列在下游，也可以是目的抗原编码核苷酸序列在下游，CTA和/或CTB编码核苷酸序列在上游。目的抗原编码核苷酸序列与CTA和/或CTB编码核苷酸序列之间可以有几个氨基酸编码核苷酸序列组成的连接序列，比如经。

14、常用于融合基因的4个甘氨酸编码核说明书CN104059941A3/15页5苷酸序列组成的连接序列。目的抗原编码核苷酸序列与CTA和/或CTB编码核苷酸序列之间也可以没有所述连接序列，而是直接首位相连。基因融合的方法均为本领域熟知，包括重叠PCR、IIS型限制性内切酶、重组酶重组等。0027本发明还提供一种融合蛋白，所述融合蛋白由包含CTA和/或CTB编码基因，或包含CTA和/或CTB编码核苷酸序列与目的抗原编码核苷酸序列相连的融合基因的真核表达构建体表达，该融合蛋白可活化产生针对所述目的抗原的免疫应答。0028优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列为SEQIDNO1；所述CTB编码基因编码。

15、的氨基酸序列为SEQIDNO2；所述CTA编码基因核酸序列为SEQIDNO3；所述CTB编码基因核酸序列为SEQIDNO4。0029优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQIDNO1有90同源；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQIDNO2有90同源。0030优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQIDNO1有95同源；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQIDNO2有95同源。0031本发明还提供一种宿主细胞，含有所述包含CTA和/或CTB编码基因，或CTA和/或CTB编码核苷酸序列与目的抗原核苷酸序列相连的融合基因的真核表达构建体，且能表达所述CTA和/或CT。

16、B与目的抗原相连的融合蛋白。0032优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列为SEQIDNO1；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列为SEQIDNO2；所述CTA编码基因核酸序列为SEQIDNO3；所述CTB编码基因核酸序列为SEQIDNO4。0033优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQIDNO1有90同源；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQIDNO2有90同源。0034优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQIDNO1有95同源；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQIDNO2有95同源。0035本发明还提供一种基因工程疫苗，所述基因工程疫苗包括含有CTA。

17、和/或CTB编码基因，或CTA和/或CTB编码核苷酸序列与目的抗原编码核苷酸序列融合表达的真核表达构建体。本发明提供的基因工程疫苗可单独施用，也可以与其它形式的疫苗组合施用。尽管本发明没有记载所述基因工程疫苗与重组蛋白疫苗组合施用，但本领域技术人员可利用本领域熟知的初免加强的策略组合施用本发明的基因工程疫苗与重组蛋白疫苗，以提供免疫应答效果。0036优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列为SEQIDNO1；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列为SEQIDNO2；所述CTA编码基因核酸序列为SEQIDNO3；所述CTB编码基因核酸序列为SEQIDNO4。0037优选的，所述CTA编码基因编码的。

18、氨基酸序列与SEQIDNO1有90同源；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQIDNO2有90同源。0038优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQIDNO1有95同源；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQIDNO2有95同源。0039优选的，所述基因工程疫苗是DNA疫苗，投递方式包括肌肉内接种、皮下接种、静脉注射、鼻内接种、电穿孔、电转化、与载体共投递，优选肌肉内接种和皮下接种。本发明关于DNA疫苗的投递方式还包括电穿孔，电转化，以及与载体的共投递，诸如壳聚糖、聚乙烯说明书CN104059941A4/15页6亚胺（PEI）等。0040本发明还提供一种制备基因工程疫苗的方法。

19、，其特征在于，所述方法包括将目的抗原基因编码核苷酸序列与CTA和/或CTB编码核苷酸相连成融合基因，并克隆至真核表达构建体的步骤。0041优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列为SEQIDNO1；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列为SEQIDNO2；所述CTA编码基因核酸序列为SEQIDNO3；所述CTB编码基因核酸序列为SEQIDNO4。0042优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQIDNO1有90同源；所述CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQIDNO2有90同源。0043优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQIDNO1有95同源；所述CTB编码基因编码的氨基酸。

20、序列与SEQIDNO2有95同源。0044本发明所称“融合基因”，是指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列（包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等）控制之下构成的嵌合基因。融合基因的表达产物为融合蛋白。0045本发明所称的“真核表达构建体”，是指将可在真核细胞或真核生物中表达目的基因的载体，包括真核表达启动子，终止子或增强子等一系列真核表达调控原件。例如，真核表达构建体可以是质粒DNA载体，重组病毒载体、慢病毒载体等。0046本发明所称的“基因工程疫苗”，是指使用DNA重组生物技术，把天然的或人工合成的遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞表达构建体或宿主中，使之充分。

21、表达，经纯化后而制得的疫苗。例如重组DNA疫苗、重组病毒载体疫苗、亚单位疫苗。0047本发明所称的“佐剂效果”，是指提高目的抗原免疫应答的效果，包括提高体液免疫应答（即抗体应答）或细胞免疫应答的效果。0048与现有技术相比，本发明的有益效果是能够提高针对所述目的抗原的免疫应答，尤其是细胞免疫应答，从而有助于提高疫苗的免疫效果。此外，CT或其亚单位是细菌的表达产物，尚未有关于其与目的抗原融合的真核表达构建体的研究报道，本发明填补了这一方面的空白。附图说明0049图1是实施例1中的DNA疫苗或真核表达构建体PSV10TRIVN的表达验证结果。0050图2是实施例1中的DNA疫苗或真核表达构建体PS。

22、V10TRIVNCTA、PSV10TRIVNCTB的表达验证结果。0051图3是实施例1中的ELISPOT技术评价细胞免疫原性的结果；其中图3A是总反应强度，即将TAT，REV，INT，VIF和NEF共五个肽库的斑点数叠加后的结果；图3B是针对各个肽库的特异性T细胞应答分布情况。005200530054图4是实施例2中的细胞免疫原性评价的结果；其中图4A是总反应强度；图4B是针对各个肽库的特异性T细胞应答分布情况。0055说明书CN104059941A5/15页700560057图5是实施例2中的多色流式细胞分析中的划门示意图。0058图6是实施例2中的多色流式细胞分析的结果；其中图6A是各免。

23、疫组小鼠的中心记忆CD8T细胞的细胞因子表达水平；图6B是各免疫组小鼠的效应记忆CD8T细胞的细胞因子表达水平。005900600061图7是实施例2中的对NEF的结合抗体检测结果。0062图8是实施例2中的在NIH3T3细胞模型上的体外刺激活性检测结果。0063图9是实施例3中的DNA疫苗或真核表达构建体PVAX1VP1、PVAX1VP1CTA、PVAX1VP1CTB的表达验证结果。0064图10是实施例3的细胞免疫原性的检测结果。0065图11是实施例3中的对重组蛋白VP1的结合抗体检测结果。0066图12是实施例4中的细胞免疫原性的检测结果。0067图13是实施例4中的中和抗体检测结果。。

24、0068图14是实施例5中的特异性T细胞应答水平检测结果。0069图15是实施例6中的对疫苗免疫小鼠进行痘苗病毒攻击后的保护性结果。具体实施方式0070下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附后权利要求书限定的范围。0071实施例1,与目的基因TRIVN的融合0072一、TRIVN基因的获取及其DNA疫苗的构建0073从LOSALAMOSHIVDATABASE中调取AE重组亚型AE2F毒株（GENBANK登录号AY008714。

25、）的TAT、REV、INT、VIF和NEF蛋白的氨基酸序列，经过必要的突变修饰之后，将上述基因按TATREVINTVIFNEF的顺序串联起来，在相邻的蛋白之间加入4个甘氨酸作为柔性连接子。然后将其按哺乳动物细胞的密码子偏好逆向翻译成DNA序列，并送上海捷瑞生物工程有限公司合成。合成后的融合基因命名为TRIVN（核酸序列SEQID5）。用分子生物学方法将所述融合基因分别克隆至PDRVISV10载体的多克隆位点（以下简称PSV10）上，构建成含融合基因的DNA疫苗PSV10TRIVN。构建完成后，经测序鉴定后入库备用。0074二、PSV10TRIVN的表达验证0075为了检测含融合基因TRIVN质。

26、粒DNA疫苗PSV10TRIVN在哺乳动物细胞中的表达情况，我们将上述质粒和空载体PSV10为阴性对照分别转染了HEK293T细胞，然后分别收集转然后细胞裂解物，并制备蛋白样品进行免疫印迹杂交实验。图1是DNA疫苗PSV10TRIVN的表达验证。将所述DNA疫苗以及载体PSV10转染293T细胞后，裂解转染细胞制成样品，然后用免疫杂交印迹方法检测，一抗是抗HIV1人血清。如图1所示，在90KD位置，相对于MOCK对照（即PSV10载体转染对照），所述DNA疫苗有特异性条带，与预期的说明书CN104059941A6/15页8分子量位置吻合，而细胞对照及空载体转染对照的泳道上未见相应分子量位置的条。

27、带，表明DNA疫苗在哺乳动物细胞中能正确表达目的抗原TRIVN。0076三、CTA、CTB基因的获取及其与TRIVN基因的融合构建0077根据基因文库所提供的霍乱弧菌O395的CTA、CTB基因序列,用JCAT在线优化软件（HTTP/WWWJCATDE/）将其优化成哺乳动物密码子偏好的核酸序列CTA（SEQID3）、CTB（SEQID4），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。运用重叠PCR技术分别将CTA、CTB基因序列与上述目的基因TRIVN基因序列融合形成融合基因基因序列TRIVNCTA（SEQID6）、TRIVNCTB（SEQID7），并将所得的融合基因分别克隆至DNA疫苗载体PSV10的多。

28、克隆位点，得到两种包含所述融合基因的DNA疫苗，分别命名为PSV10TRIVNCTA、PSV10TRIVNCTB。构建完成后，经测序鉴定后入库备用。0078四、PSV10TRIVNCTA、PSV10TRIVNCTB的表达验证0079为了检测分别含融合基因TRIVNCTA和TRIVNCTB的质粒DNA疫苗PSV10TRIVNCTA和PSV10TRIVNCTB在哺乳动物细胞中的表达情况，我们将上述质粒和空载体PSV10为阴性对照分别转染了HEK293T细胞，然后分别收集转染后的细胞裂解物，并制备蛋白样品进行免疫印迹杂交实验。图2为DNA疫苗PSV10TRIVNCTA、PSV10TRIVNCTB的表。

29、达验证结果。方法同图1。如图2所示，在95KD的分子量左右有特异性条带，与预期的分子量位置吻合，而细胞对照及空载体转染对照的泳道上未见相应分子量位置的条带，表明DNA疫苗在哺乳动物细胞中能正确表达目的抗原。0080五、PSV10TRIVNCTA、PSV10TRIVNCTB的免疫原性评价0081用德国QIAGEN公司去内毒素质粒大提试剂盒制备上述质粒DNA疫苗PSV10TRIVN，PSV10TRIVNCTA，PSV10TRIVNCTB和载体质粒PSV10，所有操作按说明书进行。将制备好的无内毒素的质粒溶于无菌的PBS溶液中PH72，调整浓度为1MG/ML。0082体重为1822G的SPF级雌性B。

30、ALB/C小鼠购自上海斯莱克实验动物中心。BALB/C小鼠随机分为A、B、C三组，每组5只。其中，对照组A小鼠免疫PSV10TRIVN，实验组小鼠分别接种PSV10TRIVNCTA、PSV10TRIVNCTB。分别于第0、2、4周在小鼠右侧胫前肌注射100G质粒DNA疫苗，在第7周时用含TRIVN的重组痘苗载体疫苗（上海市公共卫生临床中心提供）加强，于第9周分离脾细胞进行免疫检测。免疫分组及规划如表1。0083表1实施例1的动物免疫分组及免疫规划00840085用常规分离方法分离脾细胞，简要叙述如下00861摘眼球取血后，颈椎脱臼处死免疫小鼠，小鼠眼眶取的血放入灭菌的15ML离说明书CN104。

31、059941A7/15页9心管中，室温放置至凝血后3000G离心15分钟，小心吸取上层血清转移至新的15ML无菌离心管中，56灭活30分钟，存于80冰箱；0087275乙醇浸泡消毒，在超净台内取脾，放入已加入5MLRPMI1640培养基（含2胎牛血清，1PS，1谷氨酰胺）的平皿中，纱布研磨；00883用吸管将研磨的脾淋巴细胞转移至15ML离心管中，以1200转/分，离心8分钟，弃去上清；00894每管加入3ML冰预冷的红细胞裂解液，室温放置3分钟，加入2MLRPMI1640培养基（2含胎牛血清，1PS，1谷氨酰胺），以1200转/分，离心8分钟，弃上清；00905每管加入5MLRPMI1640。

32、完全培养基（10含胎牛血清，1PS，1谷氨酰胺）重悬，吸取100L用PBS稀释10倍后进行白细胞计数，以1200转/分，离心8分钟，弃去上清；00916用RPMI1640完全培养基将细胞稀释至合适浓度备用。0092小鼠脾细胞用于酶联免疫斑点试验（ELISPOT），以检测特异性T细胞应答。小鼠IFNELISPOT试剂盒购自美国BD公司（CATNO551083），按照试剂盒说明书进行。其中，刺激用的肽为源自TAT、REV、INT、VIF和NEF的肽库，刺激终浓度为5G/ML，实验结束后，用免疫斑点读板仪获取并分析数据（CHAMPSPOT，北京赛智）。0093统计学方法数据均以均值标准差表示，两组间。

33、均值的统计比较使用非配对T检验，以P50的最高稀释度的倒数。0141检测结果如图13，纵坐标表示针对流感假病毒TE09H1PP的中和抗体滴度的对数值，从图中所知，各免疫组均能活化产生抗TE09H1的中和抗体，但非融合DNA疫苗免疫（B组）活化产生的中和抗体水平（中和抗体滴度的对数值为312024）显著低于PVAX1HACTA（C组）活化的抗体水平（中和抗体滴度的对数值为395030）和PVAX1HACTB（D组）所活化的抗体水平（中和抗体滴度的对数值为372029，P005）。上述结果表明，CTA和/或CTB与免疫原HA融合后能显著性提高中和抗体应答水平。0142统计学方法数据均以均值标准差表。

34、示，两组间均值的统计比较使用非配对T检验，以P005作为差异有显著性的标准。0143实施例5，与目的基因OVA的融合0144一、真核表达构建体的构建说明书CN104059941A1514/15页160145本发明所用的OVA基因编码序列编码核苷酸序列编码核苷酸序列是OVA氨基酸序列经哺乳动物密码子优化后并送上海捷瑞生物工程有限公司进行全基因合成所得，其基因编码序列编码核苷酸序列编码核苷酸序列如SEQIDNO14。将所述的哺乳动物密码子优化的HA基因编码序列编码核苷酸序列编码核苷酸序列通过本领域技术人员熟知的方法插入PVAX1载体（货号V26020，英杰）中，构建成HA的真核表达构建体或DNA疫。

35、苗PVAX1OVA。0146然后将实施例1中所述的哺乳动物密码子优化的CTA基因编码序列编码核苷酸序列编码核苷酸序列分别插入PVAX1OVA载体的HA下游，构建成表达融合蛋白OVACTA的真核表达构建体或DNA疫苗PVAX1OVACTA。HACTA融合基因编码序列编码核苷酸序列编码核苷酸序列如SEQIDNO15。构建完成后，经测序鉴定后入库备用。0147二、动物实验0148用德国QIAGEN公司去内毒素质粒大提试剂盒制备上述质粒DNA疫苗PVAX1OVA，PVAX1OVACTA。所有操作按说明书进行。将制备好的无内毒素的质粒溶于无菌的PBS溶液中PH72，调整浓度为1MG/ML。0149体重为。

36、1822G的SPF级雌性BALB/C小鼠购自上海斯莱克实验动物中心。BALB/C小鼠随机分为两组，每组3只。小鼠分别接种PVAX1OVA、PVAX1OVACTA。分别于第0、4、8周在小鼠右侧胫前肌注射100G质粒DNA疫苗，于第10周分离脾细胞进行免疫检测。免疫分组及规划如表5。0150表5实施例5的动物免疫分组及免疫规划01510152用如实施例1和2中的方法采集小鼠脾细胞和血清。0153小鼠脾细胞用于酶联免疫斑点试验（ELISPOT），以检测特异性T细胞应答。小鼠IFNELISPOT试剂盒购自美国BD公司（CATNO551083），实验方法根据试剂盒说明书进行。其中，刺激细胞分泌IFN的。

37、肽为本领域熟知的OVA表位肽（由上海科肽合成）。上述肽刺激浓度为10G/ML，阳性刺激物佛波醇12肉豆蔻酯13乙酯（PHORBOL12MYRISTATE13ACETATE，PMA）和离子霉素（INOMYSIN）均购自美国SIGMA公司，刺激浓度分别为50NG/L，1G/L。实验完成后，分析每孔的斑点数目，标准化处理后，反映免疫小鼠活化T细胞应答水平的特异性T细胞频数表述为SFCS/106脾细胞。检测结果见图14中，各免疫组小鼠均能活化产生高水平的细胞免疫应答，其中，OVA组活化的T细胞免疫反应强度分别为1710SFCS/106脾细胞，低于PVAX1OVACTA活化的T细胞频数（9821SFCS。

38、/106脾细胞）。上述结果表明，CTA与免疫原OVA融合后能提高细胞免疫水平。0154实施例6，CTA与目的基因TRIVN的融合0155在实施例1和2的基础上，我们再进行了一组动物实验，观察疫苗的保护性效果。疫苗制备如实施例1和实施例2中所述。0156体重为1822G的SPF级雌性BALB/C小鼠购自上海斯莱克实验动物中心。BALB/说明书CN104059941A1615/15页17C小鼠随机分为3组，每组3只。其中，载体对照组MOCK小鼠免疫PSV10、实验组小鼠分别接种PSV10TRIVN、PSV10TRIVNCTA。分别于第0、2、4周在小鼠右侧胫前肌注射100G质粒DNA疫苗，于第6周。

39、用表达TRIVN的痘苗病毒RVVTRIVN（上海市公共卫生临床中心提供），以4106PFU/只的剂量腹腔攻毒，于攻毒后第三天取卵巢，经组织研磨和匀浆后，用VERO细胞进行病毒滴定。0157如图15，结果表述为每克组织的病毒滴度（PFUS/G）。与对照组相比，免疫PSV10TRIVN、PSV10TRIVNCTA疫苗均能有效降低病毒复制水平，其中，PSV10TRIVNCTA更明显降低了病毒滴度，显著性地增强了疫苗的保护效果，表明了经融合基因后的真核表达构建体能够提高针对所述目的抗原的免疫应答，有助于提高疫苗的免疫效果。0158本发明提供了一种融合基因真核表达构建体，该真核表达构建体包含CTA和/或。

40、CTB编码基因，或包含CTA和/或CTB编码基因片段与目的抗原基因相连的融合基因。该融合基因真核表达构建体能在真核生物细胞或真核生物体内表达目的融合基因抗原，可活化产生针对所述目的抗原的免疫应答。因此，与现有技术相比，本发明的有益效果是能够提高针对所述目的抗原的免疫应答，尤其是细胞免疫应答，从而有助于提高疫苗的免疫效果。此外，该融合基因真核表达构建体在体内还具有佐剂的效果，可显著性提高与之相连的目的抗原的免疫应答水平，因而，所述融合基因真核表达构建体可以用于基因工程疫苗。此外，CT或其亚单位是细菌的表达产物，尚未有关于其与目的抗原融合的真核表达构建体的研究报道，本发明填补了这一方面的空白。01。

41、59以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。说明书CN104059941A171/35页1800010002序列表CN104059941A182/35页190003序列表CN104059941A193/35页200004序列表CN104059941A204/35页210005序列表CN。

42、104059941A215/35页220006序列表CN104059941A226/35页230007序列表CN104059941A237/35页240008序列表CN104059941A248/35页250009序列表CN104059941A259/35页260010序列表CN104059941A2610/35页270011序列表CN104059941A2711/35页280012序列表CN104059941A2812/35页290013序列表CN104059941A2913/35页300014序列表CN104059941A3014/35页310015序列表CN104059941A3115/。

43、35页320016序列表CN104059941A3216/35页330017序列表CN104059941A3317/35页340018序列表CN104059941A3418/35页350019序列表CN104059941A3519/35页360020序列表CN104059941A3620/35页370021序列表CN104059941A3721/35页380022序列表CN104059941A3822/35页390023序列表CN104059941A3923/35页400024序列表CN104059941A4024/35页410025序列表CN104059941A4125/35页420026序。

44、列表CN104059941A4226/35页430027序列表CN104059941A4327/35页440028序列表CN104059941A4428/35页450029序列表CN104059941A4529/35页460030序列表CN104059941A4630/35页470031序列表CN104059941A4731/35页480032序列表CN104059941A4832/35页490033序列表CN104059941A4933/35页500034序列表CN104059941A5034/35页510035序列表CN104059941A5135/35页52序列表CN104059941A。

45、521/12页53图1图2图3A说明书附图CN104059941A532/12页54图3B说明书附图CN104059941A543/12页55图4A图4B说明书附图CN104059941A554/12页56图5说明书附图CN104059941A565/12页57图6A说明书附图CN104059941A576/12页58图6B说明书附图CN104059941A587/12页59图7图8说明书附图CN104059941A598/12页60图9图10说明书附图CN104059941A609/12页61图11说明书附图CN104059941A6110/12页62图12说明书附图CN104059941A6211/12页63图13说明书附图CN104059941A6312/12页64图14图15说明书附图CN104059941A64。