以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法.pdf

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1、10申请公布号CN104131031A43申请公布日20141105CN104131031A21申请号201410347163722申请日20140721C12N15/84200601A01H5/0020060171申请人南阳师范学院地址河南省南阳市卧龙区卧龙路1638号72发明人杜丽黄蕊李勇鹏姚瑶张力维74专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所普通合伙11350代理人汤东凤54发明名称以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法57摘要本发明提供一种以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，包括以下步骤香樟胚培苗无性系EL6组培苗的茎切段置于不定芽诱导培养基S1上进行预培养；。

2、将预培养后的香樟茎切段作为转化受体材料置于农杆菌侵染液中进行侵染；将侵染后的外植体用无菌滤纸吸去多余菌液，转入共培养培养基中进行共培养；将茎切段转入选择培养基，进行选择培养，获得转基因阳性植物材料。本发明取材方便，材料数量充足，容易获得再生植株；香樟胚培苗无性系茎切段遗传转化，具方法简单、步骤简化、周期短等特点；高频植株再生香樟无性系材料的应用，大大提高农杆菌介导遗传转化的转基因植株获得率，缩短香樟遗传转化周期，缩短获得转基因香樟新种质的周期。51INTCL权利要求书1页说明书8页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页附图2页10申请公布号CN1041。

3、31031ACN104131031A1/1页21一种以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，包含下列步骤步骤1、将香樟胚培苗无性系EL6组培苗的茎切段置于不定芽诱导培养基S1上进行预培养；步骤2、将步骤1中预培养后的香樟茎切段作为转化受体材料置于农杆菌侵染液中进行侵染，即进行遗传转化；步骤3、将步骤2中侵染结束后的外植体用无菌滤纸吸去多余菌液，转入共培养培养基中进行共培养；步骤4、共培养结束后，将茎切段转入选择培养基，进行选择培养，获得转基因阳性植物材料。2根据权利要求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述不定芽诱导配方S1为MS3。

4、0G/L蔗糖08琼脂粉20MG/L6BA05MG/L2,4D，PH60。3根据权利要求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤1中的香樟胚培苗无性系组培苗具节茎切段取自在配方S1中增殖生长2W的香樟胚培苗无性系EL6的组培苗；完全切除组培苗枝条上顶芽、侧芽、腋芽，即所有具分生组织的器官和叶片；将余下茎段按节切段，即每个茎切段上具有1节，长为57MM。4根据权利要求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述预培养条件是预培养时间为2D，其培养条件均为光照培养，光照周期为16H光照/8H黑暗，光照强度为20003000LX，。

5、培养温度为2226。5根据权利要求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述农杆菌侵染液的菌液浓度为OD6000410；侵染时间为2050MIN。6根据权利要求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤3中的共培养条件为共培养时间为3D，共培养培养基为不定芽诱导配方S1；共培养条件暗培养，培养温度为28。7根据权利要求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤4中的不定芽诱导选择培养基的配方为含抑菌剂头孢霉素CEF和筛选剂潮霉素HYG的不定芽诱导培养基S1，即S1CEF300MG/LH。

6、YG25MG/L或35MG/L。8根据权利要求1所述的以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于，所述步骤4中的抗性芽的筛选方法具体按照以下步骤实施将共培养结束后的茎切段转入含头孢霉素和潮霉素的不定芽诱导选择培养基上，光照培养，光照周期为16H光照/8H黑暗，光照强度为20003000LX，培养温度为2226，选择培养2W后，存活并诱导出不定芽的茎切段初步标记可能的阳性材料，之后将不同外植体来源的不定芽切割分离下来，继代入新的选择培养基，再培养2W后筛选即得到阳性抗性芽。权利要求书CN104131031A1/8页3以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法技术领域0。

7、001本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法。背景技术0002香樟CINNAMOMUMCAMPHORAL，樟科樟属植物，是亚热带常绿阔叶林的代表树种。其树形优美，枝繁叶茂，绿荫蔽日，气势雄伟，是优良的城市园林绿化常用树种。在我国的分布大体以长江以北为界，南至两广及西南，以江西，浙江、福建等东南沿海省份为多，因而在栽培范围上受到低温的限制。近年来，随着城市建设发展及园林绿化的新要求，为丰富北方园林的树种组合，改善冬季园林植物景观，不少园林工作者都在尝试引种此树，香樟被广泛引种栽植到黄河流域的一些省分，用以丰富当地绿化树种。0003北方漫长而。

8、寒冷冬季往往会导致香樟正常生长受损，严重时树体甚至死亡，从而造成巨大的经济损失。因此，防治冻害就成为这一优良树种在北方城市顺利推广及应用的一个重要问题。解决这一问题的主要方法是加强栽培管理和选育抗冻新品种，而后者是根本途径。采用生物技术方法，通过转基因手段进行分子育种，是一种“定向育种”，可有效缩短育种周期。生物技术改良香樟必须以高效植株再生体系的建立为研究基础，但目前由于采用香樟胚性愈伤组织为转基因外植体材料，存在转基因胚性愈伤组织再生困难，从而难获转基因植株等问题，制约着生物技术改良香樟的进程。0004目前，在转基因技术改良香樟育种中，外植体大多采用的是香樟胚性愈伤组织，胚性愈伤组织对香樟。

9、这个物种而言再生频率较低；转化外源基因后，在选择阳性转化材料时，选择配方中一定浓度的抗生素更增加诱导转基因胚性愈伤组织再生植株难度。两种不利因素叠加导致选用香樟胚性愈伤组织做为外植体进行遗传转化很难获得转基因再生植株。0005南阳师范学院的专利申请“香樟胚培苗茎切段高频植株再生无性系选育方法”受理号2014101887563，提出以香樟子叶胚培养苗茎切段为外植体，通过直接器官发生途径，建立高频植株再生体系的方法，因其不具有具体遗传转化步骤，因此无法实现香樟品种改良。0006目前，国内外没有关于香樟通过器官发生途径获得转基因植株的报道。发明内容0007为解决上述问题，本发明的目的是提供一种以香樟。

10、胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法。0008本发明所采用的技术方案是，一种以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，包含下列步骤0009步骤1、将香樟胚培苗无性系EL6组培苗的茎切段置于不定芽诱导培养基S1上进行预培养；0010步骤2、将步骤1中预培养后的香樟茎切段作为转化受体材料置于农杆菌侵染液说明书CN104131031A2/8页4中进行侵染，即进行遗传转化；0011步骤3、将步骤2中侵染结束后的外植体用无菌滤纸吸去多余菌液，转入共培养培养基中进行共培养；0012步骤4、共培养结束后，将茎切段转入选择培养基，进行选择培养，获得转基因阳性植物材料。0013本发明的特点还在。

11、于，0014不定芽诱导配方S1为MS30G/L蔗糖08琼脂粉20MG/L6BA05MG/L2,4D，PH60。0015步骤1中的香樟胚培苗无性系组培苗具节茎切段取自在配方S1中增殖生长2W的香樟胚培苗无性系EL6的组培苗；完全切除组培苗枝条上顶芽、侧芽、腋芽，即所有具分生组织的器官和叶片；将余下茎段按节切段，即每个茎切段上具有1节，长为57MM。0016预培养条件是预培养时间为2D，其培养条件均为光照培养，光照周期为16H光照/8H黑暗，光照强度为20003000LX，培养温度为2226。0017农杆菌侵染液的菌液浓度为OD6000410；侵染时间为2050MIN。0018步骤3中的共培养条件。

12、为共培养时间为3D，共培养培养基为不定芽诱导配方S1；共培养条件暗培养，培养温度为28。0019步骤4中的不定芽诱导选择培养基的配方为含抑菌剂头孢霉素CEF和筛选剂潮霉素HYG的不定芽诱导培养基S1，即S1CEF300MG/LHYG25MG/L或35MG/L。0020步骤4中的抗性芽的筛选方法具体按照以下步骤实施将共培养结束后的茎切段转入含头孢霉素和潮霉素的不定芽诱导选择培养基上，光照培养，光照周期为16H光照/8H黑暗，光照强度为20003000LX，培养温度为2226，选择培养2W后，存活并诱导出不定芽的茎切段初步标记可能的阳性材料，之后将不同外植体来源的不定芽切割分离下来，继代入新的选择。

13、培养基，再培养2W后筛选即得到阳性抗性芽。0021本发明的有益效果是本方法以香樟胚培苗无性系具节茎切段为受体，通过农杆菌介导的方法，以GUS基因为报告基因，对影响香樟胚培苗茎切段遗传转化的几个因素进行系统研究，经外植体预培养、遗传转化条件优化、共培养和GUS染色最终建立香樟胚培苗茎切段遗传转化体系。本发明取材方便，材料数量充足，容易获得再生植株；香樟胚培苗无性系茎切段遗传转化，具方法简单、步骤简化、周期短等特点；高频植株再生香樟无性系材料的应用，可大大提高农杆菌介导遗传转化的转基因植株获得率，有效缩短香樟遗传转化周期，有效缩短获得转基因香樟新种质的周期；此外，通过统计GUS基因瞬间表达率对影响。

14、农杆菌介导遗传转化效率的各项因素进行优化，可有效提高香樟遗传转化效率，综上所述，选用高频植株再生香樟胚培苗无性系，通过优化后的农杆菌介导的各项因素中转化，可促进香樟农杆菌介导的基因转化的研究。本发明可在香樟遗传转化和生物技术改良中发挥重要作用，能够替代香樟胚性愈伤组织作为遗传转化的外植体。该发明填补通过器官发生途径实现香樟转基因植株的生物技术改良的空白；可用于新基因功能验证及优良转基因育种材料的获得，同时为其他园林树木的生物技术改良提供重要参考价值。附图说明0022图1是本发明香樟胚培苗茎切段潮霉素敏感性试验图；说明书CN104131031A3/8页50023图2是本发明香樟胚培苗茎切段头孢霉。

15、素敏感性试验图；0024图3是本发明香樟胚培苗茎切段GUS基因表达染色反应图。具体实施方式0025下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，下列所用方法如无特别说明为常规方法。所述百分浓度如无特别说明为质量百分浓度。0026本发明提供一种以香樟胚培苗茎切段为受体的农杆菌介导的遗传转化方法，包含下列步骤0027步骤1、将香樟胚培苗无性系EL6组培苗的茎切段置于不定芽诱导培养基S1上进行预培养；0028步骤2、将步骤1中预培养后的香樟茎切段作为转化受体材料置于农杆菌侵染液中进行侵染，即进行遗传转化；0029步骤3、将步骤2中侵染结束后的外植体用无菌滤纸吸去多余菌液，转入共培养培养基中进行共培。

16、养；0030步骤4、共培养结束后，将茎切段转入选择培养基，进行选择培养，获得转基因阳性植物材料。0031其中，不定芽诱导配方S1为MS30G/L蔗糖08琼脂粉20MG/L6BA05MG/L2,4D，PH60。0032步骤1中的香樟胚培苗无性系组培苗具节茎切段取自在配方S1中增殖生长2W的香樟胚培苗无性系EL6的组培苗；完全切除组培苗枝条上顶芽、侧芽、腋芽，即所有具分生组织的器官和叶片；将余下茎段按节切段，即每个茎切段上具有1节，长为57MM。0033预培养条件是预培养时间为2D，其培养条件均为光照培养，光照周期为16H光照/8H黑暗，光照强度为20003000LX，培养温度为2226。0034。

17、农杆菌侵染液的菌液浓度为OD6000410；侵染时间为2050MIN。0035步骤4中的不定芽诱导选择培养基的配方为含抑菌剂头孢霉素CEF和筛选剂潮霉素HYG的不定芽诱导培养基S1，即S1CEF300MG/LHYG25MG/L或35MG/L。0036步骤4中的抗性芽的筛选方法具体按照以下步骤实施将共培养结束后的茎切段转入含头孢霉素和潮霉素的不定芽诱导选择培养基上，光照培养，光照周期为16H光照/8H黑暗，光照强度为20003000LX，培养温度为2226，选择培养2W后，存活并诱导出不定芽的茎切段初步标记可能的阳性材料，之后将不同外植体来源的不定芽切割分离下来，继代入新的选择培养基，再培养2W。

18、后筛选即得到阳性抗性芽。003711材料0038南阳师范学院申请“香樟胚培苗茎切段高频植株再生无性系选育方法”专利受理号，筛选获得具有高频植株再生能力的胚培苗无性系无菌苗作为香樟遗传转化受体材料的供体来源。不定芽诱导配方S1MS30G/L蔗糖08琼脂粉20MG/L6BA05MG/L2,4D，PH60参见发明专利香樟胚培苗茎切段高频植株再生无性系选育方法，受理号2014101887563作为茎切段预培养培养基、共培养培养基和不定芽诱导选择培养基S1CEFHYG。003912方法说明书CN104131031A4/8页60040121香樟胚培苗无性系组培苗茎切段的获得0041处理方式如下茎切段取自在。

19、配方S1中增殖生长2W的香樟胚培苗无性系的组培苗；完全切除组培苗枝条上顶芽、侧芽、腋芽即，所有具分生组织的器官和叶片；将余下茎段按节切段即每个茎切段上具有1节，长约57MM。0042122培养方法及条件0043除香樟茎切段共培养为暗培养，培养温度为28；其余茎切段抗生素敏感性试验、受体材料预培养、不定芽诱导选择培养等香樟培养材料培养均采用光照培养，光照周期为16H光照/8H黑暗，光照强度为20003000LX；培养温度均为242。0044123香樟茎切段预培养0045以香樟胚培苗无性系组培苗见专利2014101887563茎切段为外植体，将所述的外植体接种于不定芽诱导配方S1见专利201410。

20、1887563进行预处理，预处理时间为2D。0046124香樟茎切段对筛选剂潮霉素和抑菌剂头孢霉素的敏感性试验00471香樟茎切段对筛选剂潮霉素的敏感性试验0048将预处理后的茎切段接种于附加不同浓度0、5、15、25、35MG/L潮霉素HYG的培养基S1上，3W后比较不同浓度抗生素对外植体生长的抑制作用，以确定合适的选择压力。试验的潮霉素浓度梯度为0、5、15、25、35MG/L。每处理试验外植体数不少于30个，接种3W后，进行数据统计。00492香樟茎切段对抑菌剂头孢霉素的敏感性试验0050将预处理后的茎切段接种于附加不同浓度头孢霉素的培养基S1上，3W后比较不同浓度抗生素对外植体不定芽生。

21、长的抑制作用，以确定合适的选择压力。所试头孢霉素CEF浓度梯度为0、200、300、400、1000MG/L。每处理试验外植体数不少于30个，接种3W后，进行数据统计。0051125农杆菌介导的遗传转化条件的优化00521农杆菌菌液活化及侵染液制备0053从80冰箱中取出含质粒PCAMBIA1301的农杆菌EHA105菌种，用接种环在含有100MG/LKM卡那霉素和50MG/LRIF利福平的LB固体培养基上划线，平板倒置，暗培养在28下直至单菌落产生；挑取单菌落接种于含有100MG/LKM的LB液体培养基中，28恒温摇床振荡培养180200R/MIN过夜；后将菌液4000RPM离心10MIN，。

22、弃上清，用无菌液体MS培养基重悬菌体，调整至各种OD600，备用。00542农杆菌的侵染与共培养0055将预培养2D的香樟茎切段取出，置于不同OD6000410农杆菌菌液中浸泡一段时间后，取出并用无菌滤纸吸去表面多余的菌液，完成侵染过程；将侵染后香樟茎切段转回原来预处理使用培养基中即预处理培养基和共培养培养基相同，将上述培养物置于28恒温培养箱，黑暗条件下培养14D，进行共培养；共培养结束后通常情况下，可转入选择培养基进行选择培养，如果采用报告基因优化转化条件，则共培养结束之后，直接进行报告基因瞬间表达的检测。00563转化条件的优化0057本研究试验了根癌农杆菌EHA105/PCAMBIA1。

23、301的菌液浓度OD60004、06、说明书CN104131031A5/8页708、10，共培养天数1、2、3、4D，侵染时间10、20、30、40、50MIN，对遗传转化的影响。检测其中的某个因素时，其它因素采用括号中加粗标记的那个水平，共培养结束后用外植体GUS的瞬间表达量的多少确定转化条件的适宜程度，每个处理的外植体数不少于30个，其中未侵染的材料作为阴性对照。00584GUS染色检测报告基因瞬时表达00591染色将待测样品装入EP管中，加入适量GUS染液，完全浸没样品，将离心管置于37水浴锅过夜。00602漂洗脱色先后用50，70，100的乙醇漂洗样品除去叶绿素，每次摇床震荡脱色20M。

24、IN，直至阴性对照材料成白色为止。00613观察肉眼或显微镜下观察，白色背景上的兰小点即为GUS基因表达的位点。00624统计数据香樟茎切段反应后可直接观察，GUS基因瞬间表达呈阳性者可在肉眼下观察到蓝色反应，然后统计GUS基因瞬间表达率，每次反应观测外植体总数不少于30粒。00635GUS染色配制10MMOL/LEDTA二钠盐，01TRITONX100，500G/MLXGLUC，01MMK4FECN6，01MMMK3FECN6，100G/ML氯霉素CM，20甲醇，以50MMOL/L磷酸缓冲液PH70配制。0064126数据计算和处理0065不定芽诱导率诱导出芽的外植体数/接种外植体总数100。

25、不定芽长度大于1MM，记录一个有效芽0066分化系数诱导出芽总数/诱导出芽的外植体总数1000067愈伤组织诱导率诱导出愈伤组织的外植体数/接种外植体总数1000068存活率存活外植体数/接种外植体总数100外植体全长9成变褐，记录外植体死亡0069GUS瞬间表达率有蓝色反应的外植体数/外植体总数10000702结果与分析007121香樟茎切段对筛选剂潮霉素和抑菌剂头孢霉素的敏感性试验0072表1不同浓度的潮霉素对香樟胚培苗茎切段生长的影响00730074注所有数据均统计于接种3W后。0075由表1可知，潮霉素的添加对香樟胚培苗茎切段的生长具有抑制作用。接种1W后，在不同潮霉素浓度的培养基上，。

26、茎切段反应不同图1AE，但与对照材料比较图1F，说明书CN104131031A6/8页8生长皆明显受到抑制。在潮霉素浓度由5MG/L增至25MG/L时，不定芽诱导减少，材料生长减缓图1G、H，3W后，在该浓度范围内，虽有部分外植体逐渐死亡图1I，但仍有不定芽的诱导形成图1G，并继续存活；随着潮霉素浓度的增加，外植体的死亡率明显增加表1，潮霉素浓度为35MG/L培养基中仅有20外植体存活，且材料无明显生长迹象，而潮霉素浓度增至50MG/L时，外植体无一存活，且材料在接种后1W内迅速死亡。因此，潮霉素浓度为35MG/L时，即可抑制香樟茎切段的生长，可将该浓度作为选择压力进行转基因阳性材料的筛选。0。

27、076表2不同浓度的头孢霉素对香樟胚培苗茎切段生长的影响00770078注所有数据均统计于接种3W后。0079农杆菌介导的遗传转化结束后，需选用一定的抗生素对其生长进行抑制。头孢霉素CEF属于半乳糖苷酶抑制型抗生素，可以有效杀死农杆菌，但对植物细胞也有一定的伤害，因此，需要测试外植体对头孢霉素的敏感性，以确定适宜的浓度。由表2可知，头孢霉素对于香樟茎切段的生长并无显著影响，存活率均为100图2AE；头孢霉素在200MG/L浓度时，不定芽诱导率和诱导系数与对照比较，有较大幅度降低，而愈伤组织的生长量明显增加；头孢霉素添加至300MG/L时，不定芽诱导率和分化系数以及愈伤组织生长量同对照差异不大图。

28、2A、C；随着头孢霉素的添加，愈伤组织诱导率逐渐降低，不定芽诱导率相应降低，但诱导系数略有增加表2，在头孢霉素浓度为1000的MG/L，不定芽诱导系数达36，但不定芽形态均小于对照材料图2F，可见高浓度的头孢霉素可能具有促进香樟不定芽分化的效果，但过多细小的不定芽并不利于阳性转化材料的选择培养。因此，头孢霉素作为抑菌剂在本研究中，选择300MG/L作为抑制农杆菌生长的浓度。0080经上述选择剂潮霉素和抑菌剂头孢霉素的敏感性试验的研究，对于香樟胚培苗茎切段的选择配方确定为以香樟胚培苗茎切段不定芽诱导配方为基础，添加抑菌剂头孢霉素CEF300MG/L和筛选剂潮霉素HYG35MG/L；为保证获得较多。

29、的转化材料，降低因高浓度选择压导致的漏选，也可适当减少潮霉素添加量至25MG/L。008122农杆菌介导的遗传转化条件的优化0082表3不同浓度的菌液对香樟胚培苗茎切段GUS瞬间表达的影响0083OD600测定外植体数GUS瞬间表达率0CK300说明书CN104131031A7/8页904306000630367083013310302000084注所有数据均统计于共培养结束后，其中侵染时间为30MIN，共培养时间为3D；对照为未进行侵染的外植体。0085表4不同侵染时间对香樟胚培苗茎切段GUS瞬间表达的影响0086侵染时间MIN测定外植体数GUS瞬间表达率0CK300103063320304。

30、673030600403033350303000087注所有数据均统计于共培养结束后，其中OD60004或06，共培养时间为3D；对照为未进行侵染的外植体。0088表5不同共培养天数对香樟胚培苗茎切段GUS瞬间表达的影响0089共培养天数D测定外植体数GUS瞬间表达率0CK3001300230167330600430500090注所有数据均统计于共培养结束后，其中OD60004，侵染时间为30MIN；对照为未进行侵染的外植体。0091菌液浓度在农杆菌介导的遗传转化中是影响转化效率的重要因素之一，因此在说明书CN104131031A8/8页1030MIN的侵染时间、共培养3D的相同条件下，测试了。

31、在0410的4个水平OD600值对转化效率的影响，未经转化的外植体材料作为对照表3。结果显示,不同浓度的菌液对香樟胚培苗茎切段的转化影响效果各有不同。菌液OD600值为04时，GUS基因瞬间表达率最高，达60；随着菌液浓度的增加，表达率反倒逐渐降低，可见，高浓度的菌液并不利于香樟胚培苗茎切段的转化；因此，在对香樟胚培苗茎切段的侵染中，农杆菌最适宜的浓度OD600值为04。0092一般而言，农杆菌侵染植物首先进行农杆菌细胞与植物细胞间的相互作用，足够的侵染时间有利于农杆菌吸附到植物外植体伤口进行遗传转化。结果显示当侵染时间为10MIN和30MIN时，外植体的GUS基因瞬间表达率可达60以上表4；。

32、侵染时间为40MIN时，表达率则降至333，当侵染时间延长至50MIN，表达率只有30；延长侵染时间不能促进香樟茎切段转化，所以30MIN是较为适宜的侵染时间。0093为了确定合适的共培养时间，选择农杆菌OD600值为04、侵染时间为30MIN，在共培养14D后1、2、3、4D，测试GUS基因在香樟茎切段中的瞬间表达情况。由表5可知，共培养2D后，GUS基因在外植体内即有表达，随着共培养时间的延长，GUS基因的表达率增高；在共培养3D时表达率达到最高，达60；随后继续培养，则GUS基因的表达开始下降。因此，最适共培养时间为3D。0094在试验中观察到，未转化的对照外植体经GUS染液染色后，没有。

33、蓝色反应图2A，其余各处理有蓝色反应的外植体，色斑均出现在切口处图2B、C，并且切口越多，蓝色反应越明显；这与前人研究农杆菌是通过伤口进行侵染结论相符。因此，在后续的侵染试验中，外植体的处理方式可以采取如下手段，即在不影响外植体活力的情况下，适当的增加外植体的伤口有助于转化效率的提高。0095由表3、4、5的GUS基因瞬间表达结果，能够确立农杆菌介导的香樟胚培苗茎切段遗传转化的适合条件；即菌液OD60004，侵染时间为30MIN，共培养时间为3D；在不影响茎切段活力的情况下，在外植体上添加适当的伤口有利于转化效率的提高。009623香樟转化材料的选择培养方法0097通过香樟茎切段的敏感性试验和。

34、香樟遗传转化条件的优化，并以此为基础，建立以下香樟转化材料的选择培养方法00981不定芽诱导选择培养共培养结束后将外植体转入不定芽诱导选择培养基中进行抗性材料的选择，同时诱导外植体不定芽的生成。不定芽诱导选择培养基配方为含抑菌剂头孢霉素CEF和筛选剂潮霉素HYG的不定芽诱导培养基S1CEF300MG/LHYG2040MG/L，可从中筛选得到抗性芽。00992抗性芽的筛选方法是将共培养结束后的茎切段转入含头孢霉素和潮霉素的不定芽诱导选择培养基上，光照培养，光照周期为16H光照/8H黑暗，光照强度为20003000LX，培养温度为242。选择培养2W后，存活并诱导出不定芽的茎切段初步标记可能的阳性材料，之后将不同外植体来源的不定芽切割分离下来，单独转入新的选择培养基，再培养2W后筛选即得到阳性抗性芽。说明书CN104131031A101/2页11图1说明书附图CN104131031A112/2页12图2图3说明书附图CN104131031A12。