防治感冒的药物组合及制备方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101361941 B (45)授权公告日 2011.05.11 CN 101361941 B *CN101361941B* (21)申请号 200810198894.4 (22)申请日 2008.09.28 A61K 36/906(2006.01) A61P 31/12(2006.01) A61P 31/16(2006.01) (73)专利权人 东莞广州中医药大学中医药数理 工程研究院 地址 523808 广东省东莞市松山湖科技产业 园区生产力促进基地 16 号 3 楼 (72)发明人 赖小平 张奉学 苏子仁 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理 有限公司。

2、 44224 代理人 谭一兵 CN 1430981 A,2003.07.23, 全文 . CN 1839942 A,2006.10.04, 全文 . CN 1723922 A,2006.01.25, 全文 . 叶寿山等 . 莪术油软胶囊抗病毒作用研 究 .中药药理与临床 .2005, 第 21 卷 ( 第 3 期 ),20-23. 边嘉鸿等 .HPLC 法测定香菊感冒颗粒 ( 无糖 型 ) 中刺槐素的含量 .中药材 .2006, 第 29 卷 ( 第 11 期 ),1233-1235. 胡天佑 . 具有抗病毒作用的中草药应用研 究 .中国处方药 .2004,( 第 29 期 ),69-70. 。

3、(54) 发明名称 防治感冒的药物组合及制备方法 (57) 摘要 本发明提供一种用于防治感冒、 流行性感冒 及其他病毒性感染疾病的药物组合及制备方法。 本发明的防治感冒的药物组合， 由以下重量配比 的原料药组成 ： 莪术油0.520份、 广藿香油5 50 份、 野菊花超临界二氧化碳萃取物 5 50 份。 本发明是一种具有芳香化浊、 发表解毒功效的药 物组合， 药理研究表明其具有抗菌、 抗病毒、 抗炎、 解热和调节免疫的作用， 可用于感冒、 流行性感冒 及其他病毒性感染的预防和治疗。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 谢京晶 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利。

4、 权利要求书 1 页 说明书 11 页 CN 101361941 B1/1 页 2 1. 一种防治感冒的药物组合物， 其特征在于由以下重量配比的原料药组成 ： 莪术油 0.520份、 广藿香油550份、 野菊花超临界二氧化碳萃取物550份 ； 所述野菊花超临 界二氧化碳萃取物， 由野菊花原药材， 粉碎成粗粉， 置超临界二氧化碳萃取仪中萃取， 萃取 参数为萃取温度 453， 萃取压力 2010MPa， 解析压力为 6 7MPa， 解析温度 555， 二氧化碳流量为 253L/h， 萃取时间为 21h， 获得该萃取物。 2. 根据权利要求 1 所述的防治感冒的药物组合物， 其特征在于各成分重量配比。

5、优选 为 ： 莪术油 2.7 份、 广藿香油 13.5 份、 野菊花超临界二氧化碳萃取物 13.5 份。 3. 根据权利要求 1 所述的防治感冒的药物组合物， 其特征在于 ： 所述药物组合物在呼 吸系统疾病方面的应用， 用于感冒及其他病毒性感染的预防和治疗。 4. 根据权利要求 1 所述的防治感冒的药物组合物， 其特征在于 ： 所述该药物组合物加 入常规辅料， 制成临床可接受口服剂型。 5. 根据权利要求 4 所述的防治感冒的药物组合物， 其特征在于 ： 所述口服剂型选自于 丸剂、 片剂、 胶囊剂、 喷雾剂当中的一种。 6. 一种防治感冒的药物组合物的制备方法， 其特征在于， 包括下述步骤 ：。

6、 、 首先制备野菊花超临界二氧化碳萃取物， 取野菊花原药材， 粉碎成粗粉， 置超临界 二氧化碳萃取仪中萃取， 萃取参数为萃取温度 453， 萃取压力 2010MPa， 解析压力为 6 7MPa， 解析温度 555， 二氧化碳流量为 253L/h， 萃取时间为 21h， 所得萃取物置 洁净容器中， 备用 ； 、 再将上述制备的野菊花超临界二氧化碳萃取物， 按药物组合物的各成分重量配比 ： 莪术油 0.5 20 份、 广藿香油 5 50 份、 野菊花超临界二氧化碳萃取物 5 50 份， 以上材 料混合搅拌均匀， 然后制得药物组合物。 权 利 要 求 书 CN 101361941 B1/11 页 3。

7、 防治感冒的药物组合及制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种中药组合物， 尤其涉及一种应用于防治感冒、 流行性感冒的药物。 背景技术 0002 感冒是最常见的一种呼吸道传染性疾病， 其中 70 80是由病毒感染引起， 少 部分由细菌感染所致。感冒危害着人类的健康， 它可降低人体的免疫能力， 引起其他疾病， 如咽喉炎、 鼻窦炎、 中耳炎、 支气管炎和肺炎， 甚至脓胸、 肝脓肿、 心包炎和骨髓炎等。 由于目 前尚无确切的抗病原体药物， 所以西药对感冒的治疗主要是缓解症状， 防止继发感染。 临床 应用的抗感冒药已有 20 余种， 它们对于感冒所引起的各种症状具有缓解或消除作用， 但最 终还需靠。

8、人的自身免疫力治愈， 且一般都有嗜唾、 困倦等副作用。 0003 流感是由流感病毒引发的一种比普通感冒更为严重的急性呼吸道传染病， 其特点 为起病急、 传染性强、 发病率高、 病程长。 目前防治流感的最有效手段是接种流感疫苗， 但由 于流感病毒变异性强， 可使现有疫苗失效， 从而加大了防治的难度。 0004 从中医的角度讲， 感冒、 流感是在机体内火伏里的基础上外感风寒引发的。 中药治 疗感冒既可清除内热， 又可疏散外表风寒之邪， 表里同治， 并且中药可以整体调节人体的免 疫机能， 达到扶正驱邪的目的， 可以使感冒、 流感得到彻底有效的治疗。临床上已有数十种 治疗感冒的中成药问世， 如板蓝根颗。

9、粒、 抗病毒口服液、 荆防败毒散等， 但由于它们的药物 组成较为单一， 适应症比较局限， 加上制剂工艺比较落后， 起效较慢， 临床疗效不太理想。 因 此， 研究开发出疗效显著、 毒副作用低的防治感冒、 流感产品， 具有重要的意义。 发明内容 0005 针对现有技术存在的问题， 本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处， 提 供一种用于防治感冒、 流行性感冒及其他病毒性感染疾病的药物组合及制备方法。 0006 本发明采用具有抗菌、 抗病毒和抗炎功效的莪术油、 广藿香油及野菊花超临界二 氧化碳萃取物作为主要成分， 制成口服剂型。莪术油是从姜科植物蓬莪术、 温郁金、 广西莪 术中提取的挥发油， 主。

10、要成分为半萜类， 如莪术醇、 莪术酮、 莪术双酮等。 现代药理研究表明 莪术油具有抗菌、 抗病毒、 抗肿瘤、 免疫调节、 抗炎等作用， 动物实验证明莪术油对呼吸道合 胞病毒、 流感病毒A1型和A3型具有直接的抑制作用。 现已制成莪术油注射液和莪术油葡萄 糖注射液在临床上用于治疗上呼吸道感染、 病毒性肺炎等病毒性感染疾病。但由于中药注 射剂化学成分复杂、 制备工艺落后， 莪术油注射液的不良反应时有发生， 甚至导致死亡， 严 重影响了莪术油在临床上的应用。广藿香油作为广藿香药材的主要成分具有抑菌的功效， 对金黄色葡萄球菌、 甲型链球菌等病原体具有一定的抑制作用。 此外， 文献报道野菊花超临 界二氧。

11、化碳萃取物具有抗菌、 解热、 增强免疫等作用， 现已有以其作为原料用于治疗牙周病 的牙膏。 0007 为达上述目的， 本发明的防治感冒的药物组合， 采用以下的技术方案 ： 0008 一种防治感冒的药物组合， 由以下重量配比的原料药组成 ： 莪术油0.520份、 广 说 明 书 CN 101361941 B2/11 页 4 藿香油 5 50 份、 野菊花超临界二氧化碳萃取物 5 50 份。 0009 进一步地， 本发明原料药的重量配比优选为 ： 莪术油 2.7 份、 广藿香油 13.5 份、 野 菊花超临界二氧化碳萃取物 13.5 份 ； 0010 进一步地， 所述药物组合物以及提取物或精制物可。

12、以加入常规辅料或赋形剂， 制 成临床可接受的剂型， 为口服剂型 ； 口服剂型选自于丸剂、 片剂、 胶囊剂、 喷雾剂以及滴丸剂 当中的一种 ； 0011 上述的药物组合物在呼吸系统疾病方面的应用， 用于感冒、 流行性感冒及其他病 毒性感染的预防和治疗。 0012 本 发 明 原 料 药 的 来 源 为 ：莪 术 油 为 姜 科 植 物 蓬 莪 术 Curcuma phaeocaulisValeton、温 郁 金 Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling、广 西 莪 术 Curcumakwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang 的 干 燥 根 。

13、茎 经 水 蒸 汽 蒸 馏 或 应 用超临界二氧化碳萃取技术提取的脂溶性部分。广藿香油为唇形科植物广藿香 Pogostemoncablin(Blanco)Banth. 的地上部分经水蒸汽蒸馏或应用超临界二氧化碳萃取 技术提取的脂溶性部分。野菊花为菊科植物野菊 Chrysanthemum indicum L. 的干燥头状 花序。质量标准 ：中华人民共和国药典 2005 年版一部。 0013 一种防治感冒的药物组合的制备方法， 包括下述步骤 ： 0014 、 首先制备野菊花超临界二氧化碳萃取物， 取野菊花原药材， 粉碎成粗粉， 置超 临界二氧化碳萃取仪中萃取， 萃取参数为萃取温度 453， 萃取压。

14、力 2010MPa， 解析压 力为 6 7MPa， 解析温度 555， 二氧化碳流量为 253L/h， 萃取时间为 21h， 所得萃取 物置洁净容器中， 备用 ； 0015 、 再将上述制备的野菊花超临界二氧化碳萃取物， 按药物组合的各成重量配比 ： 莪术油 0.5 20 份、 广藿香油 5 50 份、 野菊花超临界二氧化碳萃取物 5 50 份， 以上材 料混合搅拌均匀， 然后制得药物组合。 0016 本发明是一种具有芳香化浊、 发表解毒功效的药物组合， 药理研究表明其具有抗 菌、 抗病毒、 抗炎、 解热和调解免疫的作用。而且， 该药物组合抗病毒、 抗炎及解热作用均比 单独用莪术油、 广藿香油。

15、或野菊花萃取物要强。 可用于感冒、 流行性感冒及其他病毒性感染 的预防和治疗。 具体实施方式 0017 为能进一步了解本发明的特征、 技术手段以及所达到的具体目的、 功能， 下面将通 过动物实验对本发明作进一步详细描述。 0018 首先制备野菊花超临界二氧化碳萃取物， 取野菊花原药材， 粉碎成粗粉， 置超临界 二氧化碳萃取仪中萃取， 萃取参数为萃取温度 453， 萃取压力 2010MPa， 解析压力为 6 7MPa， 解析温度 555， 二氧化碳流量为 253L/h， 萃取时间为 21h， 所得萃取物 置洁净容器中， 备用 ； 将制备好的野菊花超临界二氧化碳萃取物， 按药物组合的各成重量配 比。

16、 ： 莪术油 0.5 20 份、 广藿香油 5 50 份、 野菊花超临界二氧化碳萃取物 5 50 份， 以 上材料混合搅拌均匀， 然后制得药物组合。 0019 例 1( 硬胶囊剂 ) ： 0020 取 2.7g 莪术油、 13.5g 广藿香油、 13.5g 野菊花二氧化碳超临界提取物， 用 240g 倍 说 明 书 CN 101361941 B3/11 页 5 他环糊精包合， 得包合物 ； 加淀粉至 370g， 混匀， 制成颗粒， 60以下干燥， 过筛， 装入 1 号胶 囊， 制成硬胶囊 1000 粒 (0.37g/ 粒 )。服用剂量为 ： 每天 2 次， 每次 2 粒。 0021 例 2( 。

17、片剂 ) ： 0022 取 2.7g 莪术油、 13.5g 广藿香油、 13.5g 野菊花二氧化碳超临界提取物， 用 240g 倍他环糊精包合， 得包合物， 加淀粉至 250g， 混匀， 制成颗粒， 60以下干燥， 压制成 1000 片 (0.25g/ 片 )， 包薄膜衣， 即得。服用剂量为 ： 每天 2 次， 每次 2 片。 0023 例 3( 软胶囊剂 ) ： 0024 取 2.7g 莪术油、 13.5g 广藿香油、 13.5g 野菊花二氧化碳超临界提取物， 加入花生 油至 250g， 混匀， 制成软胶囊 1000 粒 (0.25g/ 粒 )。服用剂量为 ： 每天 2 次， 每次 2 粒。。

18、 0025 例 4( 滴丸剂 ) ： 0026 取 170g 聚乙二醇 4000， 70水浴加热使熔融， 加入 2.7g 莪术油、 13.5g 广藿香 油、 13.5g 野菊花二氧化碳超临界提取物， 混匀， 滴入冷却的二甲硅油中， 制成滴丸 1000 丸 (0.21g/ 丸 )。服用剂量为 ： 每天 2 次， 每次 2 丸。 0027 例 5( 颗粒剂 ) ： 0028 取 2.7g 莪术油、 13.5g 广藿香油、 13.5g 野菊花二氧化碳超临界提取物， 用 240g 倍他环糊精包合， 得包合物， 加淀粉至 250g， 混匀， 制成颗粒， 60以下干燥， 分装成 500 袋 (1g/ 袋 。

19、)。服用剂量为 ： 每天 2 次， 每次 1 袋。 0029 例 6( 软胶囊剂 ) ： 0030 取 20g 莪术油、 50g 广藿香油、 50g 野菊花二氧化碳超临界提取物， 加入花生油至 250g， 混匀， 制成软胶囊 1000 粒 (0.25g/ 粒 )。服用剂量为 ： 每天 2 次， 每次 2 粒。 0031 例 7( 滴丸剂 ) ： 0032 取 160g 聚乙二醇 4000， 70水浴加热使熔融， 加入 0.5g 莪术油、 5g 广藿香油、 5g 野菊花二氧化碳超临界提取物， 混匀， 滴入冷却的二甲硅油中， 制成滴丸 1000 丸 (0.18g/ 丸 )。服用剂量为 ： 每天 2。

20、 次， 每次 2 丸。 0033 例 8( 硬胶囊剂 ) ： 0034 取 5g 莪术油、 20g 广藿香油、 20g 野菊花二氧化碳超临界提取物， 用 240g 倍他环糊 精包合， 得包合物 ； 加淀粉至 370g， 混匀， 制成颗粒， 60以下干燥， 过筛， 装入 1 号胶囊， 制 成硬胶囊 1000 粒 (0.37g/ 粒 )。服用剂量为 ： 每天 2 次， 每次 2 粒。 0035 例 9( 片剂 ) ： 0036 取 10g 莪术油、 8g 广藿香油、 25g 野菊花二氧化碳超临界提取物， 用 240g 倍他环糊 精包合， 得包合物， 加淀粉至 250g， 混匀， 制成颗粒， 60以。

21、下干燥， 压制成 1000 片 (0.25g/ 片 )， 包薄膜衣， 即得。服用剂量为 ： 每天 2 次， 每次 2 片。 0037 以下是动物实验证明本发明具有的技术效果 ： 0038 一、 体内抗病毒试验 0039 1、 对流感病毒感染小鼠致死的保护作用 0040 1.1 实验材料 0041 受试药物 ： 本发明药物组合 ( 含莪术油 2.7g、 广藿香油 13.5g、 野菊花超临界二 氧化碳萃取物 13.5g)、 莪术油、 广藿香油、 野菊花超临界二氧化碳萃取物， 由广州中医药 大学新药开发研究中心提供 ； 阳性对照药 ： 利巴韦林， 由湖北医药工业研究所提供， 批号 说 明 书 CN 。

22、101361941 B4/11 页 6 080104。 0042 实验动物 ： NIH 小鼠， 单一性别， 由广东省医学实验动物中心提供， SPF 级别， 体重 1315g。 小鼠饲料为富含多种成分的配方。 饲养环境 ： 室温232， 相对湿度7510。 0043 病毒 ： 甲 1 型流感病毒鼠肺适应株由广州中医药大学热研所病毒室提供， 给小鼠 增强毒力后， 于鸡胚尿囊腔传代 2 次。并测定其半数致死量 LD50 5.52， 放冰水中保存。 0044 1.2 实验方法 0045 把小鼠随机分成阳性药物组 ( 利巴韦林 )、 病毒对照组 ( 即模型组 )、 本发明组合 物组、 莪术油组、 广藿香。

23、油组、 野菊花提取物组， 每组 15 只。各组小鼠用乙醚轻度麻醉， 选用 甲 1 型流感病毒鼠肺适应株 5 个 LD50 病毒浓度， 滴鼻感染小鼠， 每只 4 滴， 约 0.05ml。从感 染前1d开始按0.16ml/10g的剂量灌胃给药， 每天1次， 连续12d， 病毒感染对照组以等体积 蒸馏水灌胃。 逐日观察动物发病症状与死亡数， 共观察15d。 计算死亡率、 保护率、 平均存活 天数及生命延长率。 0046 死亡保护率 ( 病毒感染对照组死亡率试验组死亡率 )/ 病毒感染对照组死亡 率 ； 0047 生命延长率(试验组平均存活天数一病毒感染对照组平均存活天数/病毒感染 对照组平均存活天数。

24、 )100。 0048 1.3 实验结果 0049 小鼠感染流感病毒后， 大多发病在 4d 以后， 小鼠出现耸毛、 活动减少、 体重减轻、 体温下降等症状， 从第 6 日开始出现死亡。野菊花组， 小鼠症状严重， 死亡率高达 100， 至 实验第 10 天， 小鼠全部死亡。其余各组动物症状减轻， 少数症状重， 甚至死亡。结果见表 1 0050 表 1 对流感病毒致小鼠死亡的保护作用 0051 组别 剂量 mg/Kg 死亡 数 ( 只 ) 存活 数 ( 只 ) 平均存活时间 (d) 死亡 率 ( ) 死亡保 护率 ( ) 延长生 命率 ( ) 病毒对照组1327.073.5986.67 利巴韦林组。

25、1021314.072.46 13.3384.62 99.06 本发明组合 物组 2.7( 莪 术油 ) 9 6 11.274.18 # 60 30.77 45.28 莪术油组2.71059.603.87 #& 66.67 23.0835.79 广藿香油组13.31239.263.37 #& 80 7.6931.13 野菊花组13.31505.402.67#&100 0052 ( 与病毒对照组比较 ： P0.05， ： P0.01 ； 与利巴韦林比较 ： #P0.05， #0.01 ； 与本发明药物组合比较 ： &0.05， & ： P0.01) 0053 1.4 讨论 0054 结果表明， 。

26、该药物组合对流感病毒致小鼠死亡的保护作用比相同浓度下单独用莪 术油、 广藿香油或野菊花萃取物要强。 0055 2、 对小鼠流感病毒性肺炎的影响 0056 2.1 实验材料 0057 受试药物 ： 本发明药物组合 ( 含莪术油 2.7g、 广藿香油 13.5g、 野菊花超临界二 说 明 书 CN 101361941 B5/11 页 7 氧化碳萃取物 13.5g)、 莪术油、 广藿香油、 野菊花超临界二氧化碳萃取物， 由广州中医药 大学新药开发研究中心提供 ； 阳性对照药 ： 利巴韦林， 由湖北医药工业研究所提供， 批号 080104。 0058 实验动物 ： NIH 小鼠， 单一性别， 由广东省。

27、医学实验动物中心提供， SPF 级别， 体重 1315g。 小鼠饲料为富含多种成分的配方。 饲养环境 ： 室温232， 相对湿度7510。 0059 病毒 ： 甲 1 型流感病毒鼠肺适应株由广州中医药大学热研所病毒室提供， 给小鼠 增强毒力后， 于鸡胚尿囊腔传代 2 次。并测定其半数致死量 LD50 5.52， 放冰水中保存。 0060 2.2 实验方法 0061 将小鼠随机分正常对照组、 阳性药物组 ( 利巴韦林 )、 病毒对照组 ( 即模型组 )、 本 发明组合物组、 莪术油组、 广藿香油组、 野菊花提取物组， 除正常对照组外， 每组 10 只。各组 小鼠用乙醚轻度麻醉， 选用甲 1 型流。

28、感病毒鼠肺适应株 15 个 LD50 病毒浓度， 滴鼻感染小 鼠， 每只 4 滴， 约 0.05ml。从感染前 1d 开始按 0.16ml/10g 的剂量灌胃给药， 每天 1 次， 连 续4d， 病毒感染对照组以等体积蒸馏水灌胃。 第6天称取小鼠体重后解剖， 肉眼观察肺部病 变， 记录肺部肝样实变的程度， 摘取全肺称重， 与体重计算肺指数值， 并求出肺指数与抑制 率。 0062 肺指数小鼠肺重 (g)100 / 小鼠体重 (g) 0063 肺指数抑制率(对照组平均肺指数一实验组平均肺指数)100/对照组平均 肺指数 0064 2.3 实验结果 0065 小鼠感染流感病毒 4d 后被处死， 解剖。

29、发现病毒对照组小鼠的肺部病变明显， 其 肺指数与正常对照组比较具有显著性差别 (P0.01)， 表明此模型成立。利巴韦林对于流 感病毒所致小鼠肺炎病变均有明显的抑制作用， 与病毒对照组相比， 肺指数有明显好转 (P0.01)。本发明组合物组与病毒对照相比， 肺指数低于病毒对照组 (P0.05)。结果见表 2。 0066 表 2 药物对流感病毒性肺炎的影响 0067 分组剂量 mg/Kg肺指数 /xs抑制率 / 正常对照组0.810.14 病毒对照组1.520.17# 利巴韦林对照组10.01.090.36 42.69 本发明组合物组2.7( 莪术油 ) 1.270.28 15.90 莪术油组2。

30、.71.350.28&12.92 广藿香油组13.51.380.25&9.42 野菊花组13.51.410.26&8.73 0068 ( 与正常对照组比较， # ： P0.01 ； 与病毒对照组比较 ： ： P0.01， ： P0.05 ； 与 利巴韦林比较 ： P0.05， 0.01 ； 与本发明药物组合比较 ： &0.05， & ： P0.01) 0069 2.4 讨论 0070 结果表明， 该药物组合对小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用比相同浓度下单独用莪 术油、 广藿香油或野菊花萃取物要强。 0071 二、 体外抗病毒试验 0072 1、 材料和方法 说 明 书 CN 101361941 B。

31、6/11 页 8 0073 1.1 细胞 ： 传代人宫颈癌细胞、 狗肾细胞， 由广州中医药大学热带医学研究所提 供。 0074 1.2 病毒 ： 呼吸道合胞病毒 ； 腺病毒 3 型 ； 柯萨奇 B3 病毒， 流感病毒亚甲型鼠肺适 应株 FM1 由广州中医药大学热带医学研究所提供。 0075 1.3 药品和试剂本发明药物组合、 莪术油、 广藿香油、 野菊花提取物， 由广州中 医药大学新药开发研究中心提供 ； 利巴韦林注射液 ( 由湖北医药工业研究所提供， 批号 080104)， IMDM 细胞培养液 (GIBC0 公司， 美国 )， 新生小牛血清 ( 大连生化试剂厂 )， 胰蛋白 酶 (SIGM。

32、A， 美国 )， 噻唑蓝 (MTT， SIGMA， 美国 )。 0076 2、 实验方法 0077 2.1 药物毒性实验 0078 将待测药物分别用含有 2FBS 的 IMDM 稀释， 莪术油稀释 10 倍 (27.31mg/ml)、 100 倍 (2.73mg/ml)、 200 倍 (1.36mg/ml)、 400 倍 (0.68mg/ml)、 600 倍 (0.46mg/ml)、 800 倍 (0.34mg/ml)、 1000 倍 (0.27mg/ml)、 1200 倍 (0.23mg/ml)、 1400 倍 (0.20mg/ml)。本发明药 物组合以莪术油浓度为实验浓度， 其余广藿香油、。

33、 野菊花提取物以及利巴韦林注射液配制 均同上。将传代人宫颈癌细胞按 2108/ml 接种于 96 孔培养板 (0.2ml/ 孔 )， 待形成单层 细胞后倾掉培养液， 加入上述 5 种浓度药物 0.2ml， 48h 后观察细胞病变， 同时采用 MTT 法测 定细胞存活量。并采用 ReedMuench 法计算药物的最大无毒浓度 (TD0) 和半数致死浓度 (TD50)。 0079 2.2 药物抗病毒的体外实验 0080 实验分为正常细胞对照组 ； 病毒对照组 ； 本发明组合物组 ； 莪术油组 ； 广藿香油 组 ； 野菊花提取物组 ； 利巴韦林注射液组七组。按上述分组方法， 接种于 96 孔培养板，。

34、 正常 对照组观察细胞病变， 待病毒对照组的细胞病变达 + 时， 用 MTT 法测定作 OD 值以确定细 胞存活量， 计算各药物对细胞病变的平均抑制率 (CPI) 和最小抑制浓 (MIC)。采用 Reed Muench 法计算各组药物抑制病毒致 5O细胞病变的浓度 (IC50)、 90有效浓度 (IC90) 和 抗病毒的治疗指数 (TI)。TI 值是治疗药物疗效的综合判断指标， 值越大说明药物的毒性越 小， 抑制病毒的有效浓度越低。 0081 3、 结果 0082 3.1 体外实验的药物无毒剂量结果本发明组合物及莪术油 TD0 均为 680g/ml， TD50 为 1360g/ml。实验时每组。

35、分别取 680g/ml、 340g/ml、 170g/ml 三个浓度。广 藿香油 TD0 为 1360g/ml， TD50 为 2730g/ml。野菊花提取物 TD0 为 2730g/ml， TD50 为 27.31mg/ml。对照药利巴韦林注射液 TD0 为 800g/ml， TD50 为 1500g/ml。 0083 3.2 体外实验药物对细胞的病变抑制效果见表 3 表 6。四组药物中， 本发明组合 物组的 CPI 和 TI 值在 4 种抗病毒实验结果中均为最高， 证明本发明组合物对 4 种病毒的抑 制效果均优于单独的莪术油或广藿香油。 0084 表 3 不同药物对呼吸道合胞病毒引起细胞病。

36、变的抑制效果 0085 分组 CPI ( ) MIC (g/ml) IC50 (g/ml) IC90 (g/ml) TI 说 明 书 CN 101361941 B7/11 页 9 本发明药物组合 80.581612085 莪术油77102015068 广藿香油505016080017 野菊花提取物1216004500200006.1 利巴韦林70255020030 0086 表 4 不同药物对腺病毒 Ad3 型引起细胞病变的抑制效果 0087 分组 CPI ( ) MIC (g/ml) IC50 (g/ml) IC90 (g/ml) TI 本发明药物组合 82.58166085 莪术油8010。

37、208068 广藿香油456018070015.2 野菊花提取物10.518005000210005.5 利巴韦林70255020030 0088 表 5 不同药物对柯萨奇 B3 型病毒引起细胞病变的抑制效果 0089 分组 CPI ( ) MIC (g/ml) IC50 (g/ml) IC90 (g/ml) TI 本发明药物组合 75166515020.9 莪术油71208016017 广藿香油40803009009.1 野菊花提取物1118005500230005 利巴韦林70255020030 0090 表 6 不同药物对流感病毒亚甲型鼠肺适应株 FM1 引起细胞病变的抑制效果 0091。

38、 分组 CPI ( ) MIC (g/ml) IC50 (g/ml) IC90 (g/ml) TI 本发明药物组合 75166515020.9 莪术油74204516030.2 广藿香油35903209008.5 野菊花提取物1515004000180006.8 利巴韦林72255020030 0092 三、 抗炎试验 ( 对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响 ) 0093 1、 实验材料 0094 1.1 受试药物 ： 本发明药物组合 ( 含莪术油 2.7g、 广藿香油 13.5g、 野菊花超临界 二氧化碳萃取物 13.5g)、 莪术油、 广藿香油、 野菊花超临界二氧化碳萃取物， 由广州中医药 大。

39、学新药开发研究中心提供 ； 阳性对照药 ： 醋酸泼尼松， 5mg/ 片， 广东华南药业有限公司生 产， 批号 ： 070301。 0095 1.2 实验动物 ： NIH 小鼠， SPF 级， 由广州中医药大学实验动物中心提供。 0096 2、 实验方法 说 明 书 CN 101361941 B8/11 页 10 0097 取 NIH 小鼠， 体重 18 22g， 80 只， 雌雄各半， 随机分成六组， 空白对照组、 醋酸泼 尼松组、 本发明药物组合组、 莪术油组、 广藿香油、 野菊花提取物组。除空白对照组外， 各组 按表 7 剂量分别灌胃给药， 空白对照组给予等容积蒸馏水， 每天给药 1 次，。

40、 连续 4 天。末次 给药 0.5h 后， 将二甲苯 100l 滴于小鼠右耳两面， 左耳不涂作为对照， 致炎 0.5h 后处死动 物， 沿耳廓基线剪下两耳， 用直径 9mm 打下双耳同一部位圆片， 电子分析天平， 精密称重， 以 左、 右耳片重量之差作为肿胀度， 比较各组间差异。 0098 3、 实验结果与讨论 0099 实验结果见表 7 0100 表 7 各组药物对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响 (xs， n 10) 0101 组别剂量 (mg 药物 /kg)耳肿胀度 (mg) 空白对照组13.261.17 醋酸泼尼松40.04.711.12 本发明组合物2.7( 莪术油 )6.421.78 。

41、莪术油组2.79.111.31 & 广藿香油组13.58.071.62 & 野菊花提取物组 13.57.631.24 & 0102 ( 与病毒对照组比较 ： P0.05， ： P0.01 ； 与醋酸泼尼松 ： #P0.05， #0.01 ； 与 本发明药物组合比较 ： &0.05， & ： P0.01) 0103 表 7 结果表明， 与空白对照组比较， 醋酸泼尼松组、 本发明组合物组、 莪术油组、 广 藿香油组、 野菊花提取物组， 均能显著抑制二甲苯致炎小鼠的耳肿胀度 (P 值均 0.05， 提示本发明药物组合抗炎作用强度与醋酸泼尼松相 当， 且其抗炎作用比单独使用莪术油、 广藿香油、 野菊花。

42、提取物强。 0104 四、 解热试验 0105 1、 实验材料 0106 1.1 受试药物 ： 本发明药物组合 ( 含莪术油 2.7g、 广藿香油 13.5g、 野菊花超临界 二氧化碳萃取物 13.5g)、 莪术油、 广藿香油、 野菊花超临界二氧化碳萃取物， 由广州中医药 大学新药开发研究中心提供 ； 阳性对照药 ： 消炎痛片 ( 吲哚美辛肠溶片 )， 5mg/ 片， 广东华 南药业有限公司生产， 批号 ： 071001。 0107 1.2 实验动物 ： SD 大鼠， SPF 级， 由广州中医药大学实验动物中心提供。 0108 2.、 实验方法 0109 取大鼠若干只， 体重 (20020)g。

43、， 选取体温在 36.6 38.3内的大鼠 50 只， 雌 雄各半， 随机分为 5 组， 每组 10 只， 灌胃给药， 给药体积 20ml/kg， 连续给药 3， 于实验前禁食 12， 自由饮水， 实验当日测体温 2 次， 隔 2h1 次， 选择温差不超过 0.3的合格大鼠 80 只， 给 药后立刻于大鼠背部皮下注射干酵母(15)混悬液10ml/kg， 然后于2、 4、 6、 10h测定肛温值， 进行组间比较。 0110 3、 实验结果与讨论 0111 实验结果见表 8 0112 表 8 各组药物对鲜酵母致大鼠发热的影响 (xs， n 10) 说 明 书 CN 101361941 B9/11 。

44、页 11 0113 0114 ( 与病毒对照组比较 ： P0.05， ： P0.01 ； 与消炎痛比较 ： #P0.05， #0.01 ； 与 本发明药物组合比较 ： &0.05， & ： P0.01) 0115 表 8 结果表明， 与空白对照组比较， 消炎痛在给药 2 4h 后对鲜酵母致大鼠的发 热具有解热作用， 本发明药物组合在给药后 3、 4h 具有解热作用， 野菊花提取物组在给药后 4h 时具有解热作用， 其余各组均无解热作用。 0116 五、 对免疫功能的影响 0117 1、 实验材料 0118 1.1 受试药物 ： 本发明药物组合 ( 含莪术油 2.7g、 广藿香油 13.5g、 。

45、野菊花超临界 二氧化碳萃取物 13.5g)、 莪术油、 广藿香油、 野菊花超临界二氧化碳萃取物， 由广州中医药 大学新药开发研究中心提供 ； 阳性对照药 ： 醋酸泼尼松， 5mg/ 片， 广东华南药业有限公司生 产， 批号 ： 070301。 0119 1.2 实验动物 ： NIH 小鼠， SPF 级， 由广州中医药大学实验动物中心提供。 0120 2、 实验方法 0121 取 NIH 小鼠 60 只， 雌雄各半， 体重为 18 22g， 随机分成六组， 空白对照组、 醋 酸泼尼松 ( 免疫抑制剂 ) 组、 本发明药物组合组、 莪术油组、 广藿香油组、 野菊花提取物 组。除空白对照组外， 各组。

46、按表 9 剂量分别灌胃给药， 空白对照组给予等容积蒸馏水， 每 天 1 次， 连续 7d。末次给药后 0.5 小时， 于尾静脉注入稀释中华墨汁 ( 用 1明胶液稀释 4 倍 )0.1mL/10g， 于注入墨汁后 2min 及 12min， 用特制吸管从小鼠眼眶后静脉丛取血 10L， 立刻吹入 0.1 Na2CO3 溶液 10mL 中， 用吸管从该液中吸入吹出数次， 充分洗出吸管壁附着 之血液， 以 0.025mL 正常小鼠血溶于 10mL0.1 Na2CO3 溶液校零， 于 576nm 处测定吸收度 (A) 值， 计算吞噬指数 K， 实验数据采用单因素方差分析比较各组间差异。 0122 K (。

47、logOD1 logOD2)/(t1 t2) 0123 3、 实验结果与讨论 0124 表 9 各组药物对小鼠网状内皮系统吞噬功能的影响 (xs， n 10) 0125 组别剂量 (mg/kg)吞噬指数 K 空白对照0.0060.002 醋酸泼尼松40.00.0030.001 说 明 书 CN 101361941 B10/11 页 12 本发明药物组合2.7( 莪术油 )0.0180.004 莪术油2.70.0170.002 广藿香油13.50.0140.003 野菊花提取物13.50.0100.002& 0126 ( 与病毒对照组比较 ： P0.05， ： P0.01 ； 与醋酸泼尼松比较 。

48、： #P0.05， #0.01 ； 与本发明药物组合比较 ： &0.05， & ： P0.01) 0127 表 9 结果表明， 与空白对照组比较， 本发明药物组合、 莪术油、 广藿香油， 均能显著 提高小鼠网状内皮系统的吞噬功能 (P0.01)， 醋酸泼尼松组能显著降低小鼠网状内皮系统 的吞噬功能 (P0.01)， 提示本发明药物组合有明显的提高免疫功能的作用。 0128 六、 镇痛实验 ( 对小鼠热板痛阈的影响 ) 0129 1、 实验材料 0130 1.1 受试药物 ： 本发明药物组合 ( 含莪术油 2.7g、 广藿香油 13.5g、 野菊花超临界 二氧化碳萃取物 13.5g)、 莪术油、 广藿香。