前列腺组织分离和建立原代上皮细胞和/或间质细胞的方法.pdf

《前列腺组织分离和建立原代上皮细胞和/或间质细胞的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《前列腺组织分离和建立原代上皮细胞和/或间质细胞的方法.pdf（10页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、10申请公布号CN104152398A43申请公布日20141119CN104152398A21申请号201410176073622申请日20140428201310176244020130513CNC12N5/071201001C12N5/07720100171申请人百奥迈科生物技术有限公司地址226016江苏省南通市经济技术开发区常兴路76号72发明人江明李铁军彭薇张平静74专利代理机构上海申汇专利代理有限公司31001代理人翁若莹王婧54发明名称前列腺组织分离和建立原代上皮细胞和/或间质细胞的方法57摘要本发明提供了一种前列腺组织分离和建立原代上皮细胞和/或间质细胞的方法，其特征在于，具。

2、体步骤包括将小鼠前列腺叶组织剪碎，用原代细胞培养液洗涤，将剪碎的组织转移到离心管中离心；用原代细胞培养液重悬组织并转移到T25培养瓶中培养，当组织块粘附在瓶底之后，倒出培养液并重新加入原代细胞培养液培养，小鼠前列腺上皮和间质细胞从组织块周围生长出；用胰酶充分消化生长出的细胞，离心收集细胞并将其转移至另一新的含原代培养基的培养瓶中，得到小鼠前列腺组织原代上皮细胞和间质细胞。本发明方法简便易行、重复性好、成本低。66本国优先权数据51INTCL权利要求书1页说明书6页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图2页10申请公布号CN104152398ACN1。

3、04152398A1/1页21一种前列腺组织分离和建立原代上皮细胞和/或间质细胞的方法，其特征在于，具体步骤包括第一步将小鼠前列腺叶组织剪碎，用原代细胞培养液洗涤，将剪碎的组织转移到离心管中，并离心；第二步用原代细胞培养液重悬组织并转移到T25培养瓶中，在37培养箱中培养12天，当组织块粘附在瓶底之后，倒出培养液并重新加入原代细胞培养液培养，23天后，小鼠前列腺上皮和间质细胞从组织块周围生长出第三步用胰酶充分消化生长出的细胞，离心收集细胞并将其转移至另一新的含原代培养基的培养瓶中，得到小鼠前列腺组织原代上皮细胞和间质细胞；或者，在倒置显微镜下辨别各种细胞和组织块的类型，用细胞刮刀将间质细胞和组。

4、织块刮掉或将上皮细胞和组织块刮掉，用原代培养基洗涤后，用胰酶充分消化生长出的细胞，离心收集细胞并将其转移至另一新的含原代培养基的培养瓶中，得到小鼠前列腺组织原代上皮细胞或间质细胞。2如权利要求1所述的前列腺组织分离和建立原代上皮细胞和/或间质细胞的方法，其特征在于，所述的原代细胞培养液通过在RPMI1640培养基中加入FBS和抗菌抗真菌剂得到。3如权利要求1所述的前列腺组织分离和建立原代上皮细胞和/或间质细胞的方法，其特征在于，所述的第三步还包括继续培养细胞并传代1525次，改换常规细胞培养液进行培养，实现细胞永生化，所述的常规细胞培养液通过在RPMI1640培养基中加入FBS和抗菌素得到，F。

5、BS和抗菌素的终浓度分别为5和1。4如权利要求1所述的前列腺组织分离和建立原代上皮细胞和/或间质细胞的方法，其特征在于，所述的第三步还包括冻存并复苏细胞，在与第二步相同的培养条件下重新生长后进行鉴定。5如权利要求4所述的前列腺组织分离和建立原代上皮细胞和/或间质细胞的方法，其特征在于，所述的前列腺原代上皮细胞经免疫组织化学染色显示干祖细胞标记物CD133、CD44和LDH为强阳性，分泌细胞标记物细胞角蛋白CK8、CK18和AR为弱阳性，显示为基底细胞类型为主的混合型。6如权利要求4所述的前列腺组织分离和建立原代上皮细胞和/或间质细胞的方法，其特征在于，所述的前列腺原代上皮细胞经免疫组织化学染色。

6、显示基底细胞标记物细胞角蛋白CK5和细胞角蛋白CK14为强阳性，分泌细胞标记物细胞角蛋白CK8和CK18为弱阳性，显示为基底细胞类型为主的混合型。7如权利要求1所述的前列腺组织分离和建立原代上皮细胞和/或间质细胞的方法，其特征在于，所述的前列腺原代间质细胞经免疫组织化学染色显示纤维母细胞标记物波形蛋白强阳性，平滑肌细胞标记物平滑肌肌动蛋白弱阳性，显示为纤维母细胞类型为主的混合型。权利要求书CN104152398A1/6页3前列腺组织分离和建立原代上皮细胞和/或间质细胞的方法技术领域0001本发明涉及医学和细胞生物学以及组织工程领域，具体涉及小鼠前列腺原代上皮细胞和/或间质细胞分离和建立的新方法。

7、。背景技术0002上皮细胞间质细胞的交互作用INTERACTION和相互转换TRANSITION等生物学特性在胚胎发育过程中具有十分重要的地位。诸多研究数据表明这些生物学过程在调控正常人体组织和肿瘤组织的细胞可塑性方面也起到了关键作用。通过上皮细胞间质细胞的交互作用和转换过程能够形成多个各不相同的细胞亚群，即形成了肿瘤细胞异质性。这些亚群细胞都具有各自的特点，有一些可能分化程度较高，但还有一些则表现出了干细胞的特征。而这些特征又都与肿瘤相关表型，比如肿瘤转移、抗药性或致死率等有关，因此，如何针对肿瘤细胞的这种干细胞特征即可塑性来设计治疗方案和寻找新的治疗药物已经成为临床研究的关注点。0003建。

8、立同一组织来源中上皮细胞和间质细胞原代培养的方法可以更好地研究上皮细胞和间质细胞的组成和各自的功能，以及研究小鼠前列腺组织上皮细胞间质细胞之间的交互作用和相互转换过程以及与基因信号转导网络调控的关系，同时研究前列腺组织发育、再生和修复的分子机制，为疾病和肿瘤的靶向基因治疗药物开发提供更好的体外研究模型。0004目前研究报道的原代细胞制备方法步骤繁琐、程序复杂、成本高，不易分离上皮细胞与间质细胞。0005本发明提供了一种从同一个正常成年小鼠前列腺组织同时分离和建立原代上皮细胞和间质细胞的新方法，简便易行、重复性好、成本低。发明内容0006本发明的目的是提供一种简便易行、重复性好、成本低的从同一个。

9、正常成年小鼠前列腺组织同时分离和建立原代上皮细胞和/或间质细胞的方法。0007为了达到上述目的，本发明提供了一种前列腺组织分离和建立原代上皮细胞和/或间质细胞的方法，其特征在于，具体步骤包括0008第一步将小鼠前列腺叶组织剪碎，用原代细胞培养液洗涤，将剪碎的组织转移到离心管中，并离心；0009第二步用原代细胞培养液重悬组织并转移到T25培养瓶中，在37培养箱中培养12天，当组织块粘附在瓶底之后，倒出培养液并重新加入原代细胞培养液培养，23天后，小鼠前列腺上皮和间质细胞从组织块周围生长出OUTGROWTH0010第三步用胰酶充分消化生长出的细胞，离心收集细胞并将其转移至另一新的含原代培养基的培养。

10、瓶中，得到小鼠前列腺组织原代上皮细胞和间质细胞或者，在倒置显微说明书CN104152398A2/6页4镜下辨别各种细胞和组织块的类型，用细胞刮刀将间质细胞和组织块刮掉或将上皮细胞和组织块刮掉，用原代培养基洗涤后，用胰酶充分消化生长出的细胞，离心收集细胞并将其转移至另一新的含原代培养基的培养瓶中，得到小鼠前列腺组织原代上皮细胞或间质细胞。0011优选地，所述的原代细胞培养液通过在RPMI1640培养基中加入FBS和抗菌抗真菌剂得到。0012优选地，所述的第三步还包括继续培养细胞并传代1525次，改换常规细胞培养液进行培养，实现细胞永生化，所述的常规细胞培养液通过在RPMI1640培养基中加入FB。

11、S和抗菌素得到，FBS和抗菌素的终浓度分别为5和1。0013优选地，所述的第三步还包括冻存并复苏细胞，在与第二步相同的培养条件下重新生长后进行鉴定。0014更优选地，所述的前列腺原代上皮细胞经免疫组织化学IHC染色显示干祖细胞标记物CD133、CD44和LDH为强阳性，分泌细胞标记物细胞角蛋白CK8、CK18和AR为弱阳性，显示为基底细胞干、祖细胞类型为主的混合型。0015更优选地，所述的前列腺原代上皮细胞经免疫组织化学染色显示基底细胞标记物细胞角蛋白CK5和细胞角蛋白CK14为强阳性，分泌细胞标记物细胞角蛋白CK8和CK18为弱阳性，显示为基底细胞类型为主的混合型。0016更优选地，所述的前。

12、列腺原代间质细胞经免疫组织化学染色显示纤维母细胞标记物波形蛋白VIMENTIN强阳性，平滑肌细胞标记物平滑肌肌动蛋白SMACTIN弱阳性，显示为纤维母细胞类型为主的混合型。0017优选地，所述的小鼠前列腺组织原代上皮细胞包括干祖细胞、基底细胞和分泌细胞。0018优选地，所述的小鼠前列腺组织原代间质细胞包括纤维母细胞和平滑肌细胞。0019与现有技术相比，本发明的有益效果是0020本发明方法简便易行、重复性好、成本低。本发明可应用于1研究同样生理状态下前列腺上皮细胞和间质细胞的组成和各自的功能；2前列腺上皮细胞间质细胞之间的交互作用和相互转换和基因信号转导网络的调控；3研究前列腺组织发育、再生和修。

13、复的分子机制；4结合小核酸干扰RNAI技术研究特定基因在前列腺上皮细胞或间质细胞中的功能，为疾病和肿瘤的靶向基因治疗打下基础。同时，本发明方法可以从普通小鼠推广到转基因或基因剔除或基因高表达小鼠系分离和制备原代上皮和间质细胞，以适合不同的研究领域。附图说明0021图1小鼠前列腺组织的解剖取材照片0022图2小鼠前列腺组织中分离的上皮细胞和间质细胞照片00231小鼠前列腺细小组织块原代培养左上照片，放大倍数5；00242细胞从原代培养的小鼠前列腺细小组织块周围生长出左下照片A和B，放大倍数10；00253原代培养的小鼠前列腺上皮细胞右上照片A，放大倍数32；00264原代培养的小鼠前列腺间质细胞。

14、右下照片B，放大倍数32。说明书CN104152398A3/6页50027图3小鼠前列腺原代细胞的免疫荧光IF染色照片00281小鼠前列腺原代上皮细胞的CD133抗体染色CD133，放大倍数40；00292小鼠前列腺原代上皮细胞的CD44抗体染色CD44，放大倍数40；00303小鼠前列腺原代上皮细胞的CK14抗体染色CK14，放大倍数40；00314小鼠前列腺原代上皮细胞的AR抗体染色AR，放大倍数40；00325小鼠前列腺原代间质细胞的VIMENTIN抗体染色VIMENTIN，放大倍数40；00336小鼠前列腺原代间质细胞的SMACTIN抗体染色TSMACTIN，放大倍数40。0034图4。

15、小鼠前列腺组织重组种植物3个月的HE染色照片00351小鼠前列腺原代上皮细胞和UGM组织重组种植3个月的组织形态学A，放大倍数10；00362小鼠前列腺原代上皮细胞和UGM组织重组种植3个月的组织形态学，显示分化的前列腺导管形成B，放大倍数20；具体实施方式0037在具体实施方式中，本发明可以应用于小鼠前列腺组织的上皮细胞和间质细胞的同时分离。0038在一个具体实施方式中，本发明可用于研究同样生理状态下前列腺上皮细胞和间质细胞的组成和各自的功能。0039在一个具体实施方式中，本发明可用于研究前列腺上皮细胞间质细胞之间的交互作用和相互转换和基因信号转导网络的调控。0040在一个具体实施方式中，本。

16、发明可用于研究前列腺组织发育、再生和修复的分子机制。0041优选地，本发明可应用于疾病和肿瘤的靶向基因治疗药物包括小核酸干扰RNAI的开发。0042下面结合实施例对本发明进行详细阐述，应当理解的是，下面的实施例仅用于阐明本发明，但不限制本发明。0043实施例100441试剂材料00451手术器械，均高压灭菌处理；00462显微镜日本NIKON；0047324CM细胞刮瑞士TPP公司；00484HBSSHANKS平衡盐溶液溶液GIBCO公司；00495RPMI1640GIBCO公司；00506胎牛血清FBSGIBCO公司；00517双抗ANTIBIOTICANTIMYCOTICAM/ABGIBC。

17、O公司；00528胰酶025GIBCO公司；00539PRIMARIATMT25组织培养瓶美国BECTONDICKINSON公司；说明书CN104152398A4/6页6005410解剖培养液250MLHBSSHANKS平衡盐溶液溶液中加入25RMLAB/AM1；005511原代培养液500MLRPMI1640中加入125MLFBS25和5MLAB/AM1。00562细胞原代培养并分离0057步骤1在体视显微镜下，于HBSS溶液中解剖小鼠前列腺叶组织，具体步骤为如图1所示，将致死雄性小鼠仰卧，酒精消毒腹部皮肤，切开小鼠腹部皮肤，切开小鼠腹膜、腹腔和暴露泌尿生殖器官，提起小鼠精囊腺SV，从腹腔内。

18、沿泌尿管逐步剪断整个雄性泌尿生殖器官，在体视显微镜下分离前列腺腺叶组织，取完整个雄性泌尿生殖器官后的腹腔。将小鼠前列腺叶组织剪碎成细小组织块115MM；0058步骤2用2ML原代培养液洗涤，将剪碎的细小组织块转移到15ML离心管中，并在转速为3000RPM的条件下离心3MIN；0059步骤3用1ML原代培养液重悬细小组织块并移置T25培养瓶中，在37培养箱中培养2天；在细小组织块粘附在瓶底后，倒出培养液并重新加入5ML原代培养液培养；2天后，小鼠前列腺上皮细胞MOUSEPROSTATEEPITHELIUM，MPRE和间质细胞MOUSEPROSTATESTROMA，MPRS从细小组织块周围生长出。

19、；0060步骤4用胰酶充分消化生长出的细胞，离心收集细胞并将其转移至另一新的含5ML原代培养基的T25培养瓶中，得到小鼠前列腺组织原代上皮细胞和间质细胞。0061实施例20062类似于实施例1，区别在于，所述的步骤4为在倒置显微镜下辨别各种细胞和组织块的类型，如图2所示，在倒置显微镜下，所述的前列腺原代上皮细胞呈方块形、体积小、核圆居中。所述的前列腺原代间质细胞呈长梭形、体积大，核扁梭形。用细胞刮刀将间质细胞和组织块刮掉，用原代培养基洗涤后，用胰酶充分消化生长出的细胞，用胰酶充分消化生长出的细胞，离心收集细胞并将其转移至另一新的含5ML原代培养基的T25培养瓶中，得到小鼠前列腺组织原代上皮细胞。

20、。0063实施例40064类似于实施例1，区别在于，所述的步骤4为在倒置显微镜下辨别各种细胞和组织块的类型，如图2所示，在倒置显微镜下，所述的前列腺原代上皮细胞呈方块形、体积小、核圆居中。所述的前列腺原代间质细胞呈长梭形、体积大，核扁梭形。用细胞刮刀将上皮细胞和组织块刮掉，用原代培养基洗涤后，用胰酶充分消化生长出的细胞，用胰酶充分消化生长出的细胞，离心收集细胞并将其转移至另一新的含5ML原代培养基的T25培养瓶中，得到小鼠前列腺组织原代间质细胞。0065实施例4常规免疫荧光IF染色方法进行细胞标记物的分子鉴定00661免疫荧光染色步骤00671分别取实施例2中的小鼠前列腺组织原代上皮细胞和实施。

21、例3中的小鼠前列腺组织原代上皮细胞进行细胞爬片，用1PBS洗后，放入4丙酮固定10MIN，再用1PBS洗5MIN3次。用3过氧化氢孵育10MIN，消除内源性过氧化物酶的活性。再用1PBS洗5MIN2次。00682用10正常山羊血清PBS稀释封闭，室温孵育10MIN。倾去血清，勿洗，说明书CN104152398A5/6页7滴加按比例稀释的一抗CD133抗体美国SANTACRUZ公司，SC130617按1500稀释，CD44抗体美国ABCAM公司，AB119863按1500稀释，CK14抗体美国SANTACRUZ公司，SC31770按1500稀释，AR抗体美国SANTACRUZ公司，SC28982。

22、按1500稀释，VIMENTIN抗体美国SANTACRUZ公司，SC373717按1500稀释，ASMACTIN抗体美国SANTACRUZ公司，SC130616按1500稀释工作液，37孵育2H。00693用1PBS冲洗5MIN3次。00704滴加适当比例稀释的荧光素标记二抗1BSAPBS稀释FITC标记的二抗美国SANTACRUZ公司，SC69872，按11000稀释，37孵育10MIN。00715PBS冲洗5MIN3次。00726DAPI复染盖片。00737荧光显微镜观察并拍照。00742实验结果0075如图3所示，原代上皮细胞经免疫荧光染色显示干祖细胞标记物CD133、CD44和LDH为。

23、强阳性，分泌细胞标记物CK8和CK18为弱阳性。原代上皮细胞经免疫荧光染色显示基底细胞标记物细胞角蛋白5CYTOKERATIN5，CK5和CK14为强阳性，分泌细胞标记物AR、CK8和CK18为阴性或弱阳性。间质细胞经免疫荧光染色显示纤维母细胞标记物VIMENTIN强阳性，平滑肌细胞标记物平滑肌肌动蛋白SMOOTHMUSCLEACTIN，ACTA2弱阳性。0076实施例5组织重组00771试剂材料00781RPMI1640培养液含5FBS和1双抗GIBCO公司；00792胰酶025GIBCO公司；00803大鼠尾胶原SIGMA公司；00814SETTINGSOLUTION008210EBSSS。

24、IGMA公司100ML，0083NAHCO3245G，0084NAOH1M75ML，0085DDH2O425ML；00865AVERTINSIGMA公司；00876聚维酮碘SIGMA公司；00887手术器械，均高压灭菌处理；00898体视显微镜日本NIKON；00909灭菌纱布垫等。00912实验步骤0092第一天00931对实施例2中所得的小鼠前列腺原代上皮细胞计数，用RPMI1640培养液重悬细胞，与大鼠胚胎泌尿生殖窦原始间叶细胞UGM每组织重组体一个胚胎UGM，每组织重组体含上皮细胞100，000混合，2,000RPM离心3MAIN，弃掉培养液；00942用大鼠尾胶原混合溶液重悬细胞说明。

25、书CN104152398A6/6页80095A在15ML离心管中，混合4体积份的大鼠尾胶原与1体积份的SETTINGSOLUTION；0096B在4冰水上慢慢混合；0097C调节PH值为中性颜色呈现橙色，如果颜色呈现粉红色再补加胶原，0098如果颜色呈现黄色再补加SETTINGSOLUTION；0099D每组织重组体为50微升；0100E将上述制备的细胞悬液每滴50微升滴加到6孔细胞培养板中，每孔不要超过3滴以使孔中留有间隙；01013于37放置10MIN进行凝固。01024轻轻加入3ML的RPMI1640培养液并37孵育过夜。0103第二天01041显微镜下观察细胞重组体中的细胞是否存活。0。

26、1052将小鼠用AVERTIN240MG/KG麻醉小鼠。01063用聚维酮碘消毒小鼠。01074沿背部用手术镊打开并从腹膜钝性分离皮肤。01085在肾脏部位切开一小口。01096取出肾脏。01107用手术镊将肾脏轻轻地从体腔中拉出。01118用手术镊钝性分离肾脏内膜。01129轻轻地从6孔培养板上分离组织重组体，在灭菌纱布垫上吸干以去除部分培养液，将组织重组体放置入肾脏内膜下。011310将肾脏轻轻地放回体腔并缝合皮肤切口。011411重复步骤510处理另一个肾脏。011512术后，小鼠腹腔注射生理盐水。011615将小鼠置于加热垫上待其苏醒。0117163个月后观察组织重组的实验结果，处死小。

27、鼠去肾脏包膜下生长的组织重组体，部分组织常规固定做HE染色和免疫组化染色做形态学分析，部分组织冻存用于提取DNA、RNA和蛋白质做分子生物学研究。01183实验结果0119如图4所示，小鼠前列腺原代上皮细胞混合，结合大鼠胚胎泌尿生殖窦原始间叶细胞UROGENITALMESENCHYME，UGM制作成组织重组TISSUERECOMBINATION，种植于SCID小鼠肾内膜下，结果显示小鼠前列腺腺体组织功能性再生。小鼠前列腺原代上皮细胞与大鼠胚胎泌尿生殖窦原始间叶细胞UGM组织重组的前列腺体再生物，显示基底细胞、分泌细胞和间质细胞正常分布。说明书CN104152398A1/2页9图1图2说明书附图CN104152398A2/2页10图3图4说明书附图CN104152398A10。