猪源附红细胞体检测试剂盒及方法和应用.pdf

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1、10申请公布号CN104152537A43申请公布日20141119CN104152537A21申请号201310176304922申请日20130513C12Q1/68200601C12Q1/04200601C12R1/3520060171申请人中国农业科学院上海兽医研究所地址200241上海市闵行区紫月路518号72发明人周鹏陈兆国曹薇米荣升黄燕74专利代理机构上海序伦律师事务所31276代理人周东萍54发明名称猪源附红细胞体检测试剂盒及方法和应用57摘要本发明公开一种猪源附红细胞体检测试剂盒，该试剂盒包括针对猪源附红细胞体G1基因设计的TAQMAN探针和引物对，该探针与猪源附红细胞体G1。

2、基因第658793位核苷酸序列特异性结合，该引物对用于扩增猪源附红细胞体G1基因第658793位的核苷酸序列。本发明基于粘附蛋白G1基因的猪源附红细胞体实时荧光定量PCR检测试剂盒，具有特异性强、灵敏性高、重复性好的特点，可快速、准确、高通量地检测出猪血样品中是否存在附红细胞体，可应用于猪的附红细胞体病的临床诊断、分子流行病学调查、疗效评估和猪场净化等方面，对于猪的附红细胞体病的早期快速诊断、防控和净化具有重要意义。51INTCL权利要求书1页说明书9页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书9页附图3页10申请公布号CN104152537ACN104152。

3、537A1/1页21一种猪源附红细胞体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对猪源附红细胞体G1基因设计的TAQMAN探针，该探针与所述猪源附红细胞体G1基因第658793位核苷酸序列特异性结合；针对猪源附红细胞体G1基因设计的引物对，该引物对用于扩增猪源附红细胞体G1基因第658793位的核苷酸序列。2根据权利要求1所述的猪源附红细胞体检测试剂盒，其特征在于，所述探针的序列如SEQIDNO4所示；所述引物对的序列如SEQIDNO2和SEQIDNO3所示。3根据权利要求1所述的猪源附红细胞体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括含有猪附红细胞体G1基因的阳性重组质粒标准品。4根据权利要求1。

4、所述的猪源附红细胞体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光定量PCR反应缓冲液及聚合酶。5根据权利要求1所述的猪源附红细胞体检测试剂盒，其特征在于，所述探针的5端标记有荧光报告基团，3端标记有淬灭基团。6一种检测猪源附红细胞体浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤针对猪源附红细胞体G1基因设计TAQMAN探针，该探针与所述猪源附红细胞体G1基因第658793位核苷酸序列特异性结合；针对猪源附红细胞体G1基因设计一对引物，该对引物用于扩增猪源附红细胞体G1基因第658793位的核苷酸序列；用所述TAQMAN探针及引物，对含有猪附红细胞体G1基因的阳性重组质粒标准品进行实时荧光定量PCR检测，。

5、根据检测结果绘制出标准曲线；用所述TAQMAN探针及引物，对待测猪血样品DNA进行实时荧光定量PCR检测，根据所述标准曲线分析待测猪血样品中猪源附红细胞体的浓度。7根据权利要求6所述的检测猪源附红细胞体浓度的方法，其特征在于，所述探针的序列如SEQIDNO4所示；所述引物的序列如SEQIDNO2和SEQIDNO3所示。8根据权利要求6所述的检测猪源附红细胞体浓度的方法，其特征在于，所述阳性重组质粒是将全长猪附红细胞体G1基因插入PMD18T载体而制得。9权利要求1所述的猪源附红细胞体检测试剂盒在制备诊断猪的附红细胞体病的产品中的应用。权利要求书CN104152537A1/9页3猪源附红细胞体检。

6、测试剂盒及方法和应用技术领域0001本发明属于动物血液中支原体感染检测技术领域，具体涉及一种猪源附红细胞体检测试剂盒及方法和应用。背景技术0002猪源附红细胞体属于不能体外培养的嗜血支原体家族中的成员，一般寄生在猪红细胞的表面和内部。猪源附红细胞体感染在全世界广泛分布，给养猪业带来严重的经济损失。其急性感染可导致严重的菌血症、急性红细胞溶血，有时可导致年轻仔猪死亡、怀孕母猪流产等。对于慢性感染的猪只，血液中细菌含量低，临床症状多变，比如可能出现温和的黄疸、亚健康、生长速度缓慢、生产能力低下或对其他的感染性疾病易感。在强烈的免疫作用和抗生素治疗之下，猪源附红细胞体依旧可以在宿主体内建立慢性和持续。

7、性的感染。猪感染附红细胞体后，极有可能在症状消失后转化为慢性感染。目前发现感染猪的附红细胞体即猪源附红细胞体有两种，包括猪附红细胞体MYCOPLASMASUIS和小附红细胞体MPARVUM。由于依靠16SRRNA基因及RNASEPRNA序列的分子鉴定方法才出现不久，对小附红细胞体的研究尚不充分。0003尽管早在1932年，附红细胞体病原即已在美国被确认，但其感染的流行病学数据仍不甚明确，需要一种准确可靠的方法对猪源附红细胞体感染进行诊断和鉴定，进而推动对该病的防控和净化。猪的附红细胞体病的传统诊断方法包括镜检、血清学检测、普通PCR扩增等。而临床上该病的诊断主要以镜检为主，其中包括鲜血压片和涂。

8、片染色。由于附红细胞体主要寄生在红细胞表面和血浆中，常导致红细胞变形，但红细胞的变形可以由多种因素引起，如涂片技术、渗透压的改变等，因此容易将变形红细胞错误判断为附红细胞体，从而导致误诊。附红细胞体在吉姆萨染色时呈蓝紫色，瑞氏染色呈淡蓝色，吖啶橙染色呈淡绿色荧光，但是吉姆萨染色和瑞氏染色需要避免变性红细胞嗜碱性红细胞、多染性红细胞和豪周氏小体红细胞、血小板、抗凝剂和染料颗粒的干扰；载玻片上的污染异物和白细胞碎片均可能引起非特异性发光，导致检测结果出现假阳性。猪源附红细胞体的血清学检测方法包括补体结合试验COMPLEMENTFIXATIONTEST，CFT、间接血凝试验INDIRECTHEMAG。

9、GLUTINATIONASSAY，IHA和酶联免疫吸附试验ENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAY，ELISA等。由于附红细胞体尚无成熟的体外培养方法，难以获得大量原始抗原而阻碍了血清学方法的应用。近几年普通PCR诊断方法主要集中在扩增16SRRNA基因上，该基因序列也是目前最常用的细菌种属分类和鉴定的序列片段。比对多个原核生物、支原体的16SRRNA基因发现猪源附红细胞体与其他原核生物的相似性很高。在临床采集的猪血样本可能被多种细菌污染，采用PCR扩增16SRRNA基因极易出现假阳性。因此迫切需要建立一种准确、特异的猪源附红细胞体检测方法。猪源附红细胞体甘油醛3磷酸脱氢酶。

10、样蛋白1GLYCERALDEHYDE3PHOSPHATEDEHYDROGENASELIKEPROTEIN1，简称G1蛋白基因主要编码一种黏附蛋白，具有甘油醛3磷酸脱氢酶的功能，为猪源附红细胞体特异性基因。对小附红细胞体的G1基因MPG1进行PCR扩增分析发现其DNA序列与猪附红细胞体G1说明书CN104152537A2/9页4基因MSG1的核苷酸序列相似性在966982之间，而氨基酸的相似性为982100之间，两者无显著差异，其中小附红细胞体G1基因在450550位、600900位核苷酸序列与猪附红细胞体G1基因对应序列高度同源。0004实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，。

11、利用荧光信号的累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定时分析的方法。与已有的诊断方法相比，荧光定量PCR一次可同时对多个样品进行检测和诊断；检测速度更加迅速，结果判断不需要借助电泳分析，从而大大节省时间并降低了对环境的污染；对检测样品可以实时定量分析。发明内容0005本发明要解决目前猪源附红细胞体的检测方法假阳性率高的技术问题，提供一种基于粘附蛋白G1基因的猪源附红细胞体实时荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒特异性强、灵敏性高，可快速、准确地检测出猪血样品中是否存在附红细胞体。0006为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现0007在本发明的一个方面，提供了一种猪源。

12、附红细胞体检测试剂盒，所述试剂盒包括0008针对猪源附红细胞体G1基因设计的TAQMAN探针，该探针与所述猪源附红细胞体G1基因第658793位核苷酸序列特异性结合；0009针对猪源附红细胞体G1基因设计的引物对，该引物对用于扩增猪源附红细胞体G1基因第658793位的核苷酸序列。0010优选的，所述探针的序列如SEQIDNO4所示；所述引物对的序列如SEQIDNO2和SEQIDNO3所示。0011所述试剂盒还包括含有猪附红细胞体G1基因的阳性重组质粒标准品。0012所述试剂盒还包括荧光定量PCR反应缓冲液及聚合酶。0013所述探针的5端标记有荧光报告基团，3端标记有淬灭基团。0014在本发明。

13、的另一方面，还提供了一种检测猪源附红细胞体浓度的方法，包括以下步骤0015针对猪源附红细胞体G1基因设计TAQMAN探针，该探针与所述猪源附红细胞体G1基因第658793位核苷酸序列特异性结合；0016针对猪源附红细胞体G1基因设计一对引物，该对引物用于扩增猪源附红细胞体G1基因第658793位的核苷酸序列；0017用所述TAQMAN探针及引物，对含有猪附红细胞体G1基因的阳性重组质粒标准品进行实时荧光定量PCR检测，根据检测结果绘制出标准曲线；0018用所述TAQMAN探针及引物，对待测猪血样品DNA进行实时荧光定量PCR检测，根据所述标准曲线分析待测猪血样品中猪源附红细胞体的浓度。0019。

14、所述探针的序列如SEQIDNO4所示；所述引物的序列如SEQIDNO2和SEQIDNO3所示。0020所述阳性重组质粒是将猪附红细胞体G1全长编码基因插入PMD18T载体而制得。0021在本发明的另一方面，还提供了上述猪源附红细胞体检测试剂盒在制备诊断猪的说明书CN104152537A3/9页5附红细胞体病的产品中的应用。0022本发明基于粘附蛋白G1基因的猪源附红细胞体实时荧光定量PCR检测试剂盒，具有特异性强、灵敏性高、重复性好的特点，可快速、准确、高通量地检测出猪血样品中是否存在附红细胞体，可应用于猪的附红细胞体病的临床诊断、分子流行病学调查、疗效评估和猪场净化等方面，对于猪的附红细胞体。

15、病的早期快速诊断、防控和净化具有重要意义。附图说明0023下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。0024图1是本发明实施例1的猪源附红细胞体G1基因PCR扩增电泳图；0025图2是本发明实施例1的猪源附红细胞体G1基因阳性质粒酶切鉴定电泳图；0026图3是本发明实施例3敏感性试验扩增曲线图；0027图4是本发明实施例3实时荧光定量PCR标准曲线图；0028图5是本发明实施例4特异性试验扩增曲线图；0029图6是本发明实施例6猪田间血液样品附红细胞体感染检测结果图。具体实施方式0030下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如分子克隆实验指南萨姆布鲁克J，拉塞尔D。

16、W，著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译分子克隆实验指南，第3版，北京科学出版社，2002中所述的方法进行。0031本发明根据GENBANK公布的猪附红细胞体G1基因序列GENBANK登录号AM4074041，设计了1对引物和TAQMAN探针，研制了基于TAQMAN探针检测猪源附红细胞体的实时荧光定量PCR检测试剂盒，并对现场采集的猪血液样品进行了检测。结果显示，设计的探针对检测猪源附红细胞体具有很高的特异性；质粒DNA的检测阈值达100个拷贝；检测了319份临床猪血液样品，猪源附红细胞体的感染样品数为45份含34份猪附红细胞体和11份小附红细胞体，两种附红细胞体总的感染阳性率为1411，提示猪源。

17、附红细胞体TAQMAN实时荧光定量PCR检测试剂盒操作简便、快速，在荧光PCR仪中反应一小时内即可获得准确结果，特异性强，敏感度高，重复性好，可用于猪的附红细胞体病的临床诊断、分子流行病学调查、疗效评估和猪场净化等的快速定量检测。0032本发明的猪源附红细胞体检测试剂盒，包括0033针对猪源附红细胞体G1基因设计的TAQMAN探针，该探针与猪源附红细胞体G1基因第658793位核苷酸序列特异性结合；0034针对猪源附红细胞体G1基因设计的引物对，该引物对用于扩增猪源附红细胞体G1基因第658793位的核苷酸序列。0035在下述优选实施例中，探针的序列如SEQIDNO4所示；引物对的序列如SEQ。

18、IDNO2和SEQIDNO3所示。0036实施例1猪源附红细胞体G1基因的克隆和序列分析00371引物设计0038根据GENBANK公布的猪附红细胞体G1蛋白编码基因序列GENBANK登录号AM4074041，应用PRIMERPREMIER50软件设计了扩增猪源附红细胞体G1蛋白全长编码说明书CN104152537A4/9页6基因的特异性引物，引物序列如下0039上游引物MF15GCGGGATCCATGACAATCCACAAAGTAGC3SEQIDNO5；0040下游引物MR15CGCCTGCAGTTAAAGAGAAATGTAGTA3SEQIDNO6。00412猪血液样品基因组DNA提取004。

19、2用全血基因组DNA提取试剂盒树脂型，购自赛百盛公司，产品目录号CUC100，按照该试剂盒的说明书提取猪血液样品基因组DNA取500L无菌抗凝全血到1ML纯化树脂中，颠倒混匀56次。室温下温育3MIN，其间颠倒混匀一次，5000R/MIN离心3S，收集沉淀。用1MLGN结合液将纯化树脂悬浮，颠倒混匀，5000R/MIN离心3S，收集沉淀。用05ML漂洗液漂洗纯化树脂两次，颠倒混匀，5000R/MIN离心3S，收集沉淀。用08ML无水乙醇悬浮，装入离心纯化柱，12000R/MIN离心1MIN，倒掉废液收集管中的乙醇，再离心1MIN，尽量除尽乙醇。将离心纯化柱套入一个洁净的15ML离心管中，加入1。

20、00LTE缓冲液于纯化树脂上，室温放置3MIN，12000R/MIN离心2MIN，离心管中收集的液体即为洗脱下来的猪血全基因组DNA。00433猪源附红细胞体G1基因全长序列的扩增00441猪源附红细胞体G1基因全长序列扩增反应体系如下25L10倍浓度的EXTAQBUFFER，2LDNTP，02LEXTAQ，上、下游引物各015L，2LDNA模板，用灭菌双蒸水补齐至25L。设灭菌双蒸水为阴性对照。00452PCR扩增反应条件955MIN；9460S，5545S，7260S，共35个循环后，72延伸8MIN。00463扩增产物分析取5LPCR产物，加入至含有05G/ML溴化乙锭染料的2的琼脂糖凝。

21、胶中，于125V电压下电泳20MIN，在凝胶成像系统上观察扩增产物的图谱。并与阴性对照对比，被检样品孔约在1000BP左右出现电泳条带，即进行切胶纯化。结果，成功地扩增出了猪源附红细胞体G1全长基因图1，扩增片段长度为1011BP。图1中，MDL2000DNAMARKER；1目的片段；N阴性对照。00474将目的条带切胶纯化，将回收产物克隆至PMD18T载体并转化DH5感受态细胞，经酶切鉴定后进行序列测定。结果，成功地构建了含有猪源附红细胞体G1基因的重组质粒，酶切结果显示外源片段大小正确图2，图2中，M1DL1KBDNAMARKER；M2DL2000DNAMARKER；1猪源附红细胞体G1基。

22、因阳性质粒酶切片段。猪附红细胞体G1基因全长序列如下0048ATGACAATCCACAAAGTAGCAATCAATGGATTCGGAAGAATCGGAAGATTACTATTTAGA0049AATCTTCTTTCTTCTCAAGGAGTTCAAGTTGTAGCTGTTAATGACGTAGTTGACATTAAA0050GTTCTTACTCACCTTTTGGTTTATGACAGTGCTCAAGGAAAACTAAAAGATTGAGAAGT0051AAGTTGTGATTCAGAATACATAAGACTAAAGAATGTAAATACTGGAGAAGTTAGAGAAG0052TTAGAGTTTTCAACTT。

23、CAATACTGAAAAGATTTATCACTGAGGTGAATTAGAAATTGATT0053GTGTTGTTGAATGTTCAGGAAGATTCTTAACTAAGGAAGCAGTTAAGTGTCACCTTGATG0054CAGGAGCTCAAAAAGTTCTTATTTCAGCTCCTGCAAAGGATGACACTAAGACAGTTGTT0055TACAACGTAAACCATACTCAAATTACCAGCTCAGACAATGTTATTTCAGGAGCTTCATGT0056ACAACTAATGCACTAGCTCCTATCGTAAAAATTATTCACAGAAAATTTGGAATTAATTCTG。

24、0057GATTCATGACAACAGTTCATGCTTTCACTTCTGACCAAAGACTTCAAGACTCTCCTCACG说明书CN104152537A5/9页70058CTGACCTAAGAAGAGCTAGAGCAGCTGCTGGATCAATTATTCCTACAACTACCGGAGCA0059ATTCCAGAATTAAATGGAAAAC0060GTACCTGTATTGACTGGTTCTCTAGTTGACCTATGCCTAAAAATAAATA0061ATGAAGCAATTAAGGATGGAGAAAATGAAACCCTTGCTTATG0062TAGAAGATCCAATCGTATCTGCTG。

25、ACATTATTGGAGATACACATGGTTCTATTTTTGACTC0063ATCTCTAACTAAAGTATTGCCAACTGGAGAAGTTAAGTTGTATGCATGATATGACAACGA0064GTCTTCTTATGTAAATCAACTTGCAAGAACTCTGAAATACTACATTTCTCTTTAASEQIDNO10065实施例2阳性重组质粒标准模板的制备00661阳性质粒的鉴定0067将目的条带切胶，用胶回收试剂盒回收纯化，将目的片段克隆至PMD18T载体并转化大肠杆菌DH5感受态细胞，于含氨苄青霉素固体培养基中37培养过夜，挑选单菌落进行培养，提取质粒，经酶切分析及测序。

26、鉴定。将获得的序列与GENBANK上公布的序列进行比对分析，以确定阳性重组质粒。00682阳性质粒的浓度测定0069将重组质粒DNA用灭菌双蒸水溶解后，在核酸蛋白测定仪中于260NM与280NM波长下测定质粒浓度，并根据公式计算每微升液体中质粒DNA的拷贝数。00700071注每个碱基的平均分子量为660。0072实施例3猪源附红细胞体实时荧光定量PCR检测方法的建立00731引物和探针的设计0074根据猪源附红细胞体G1基因全长序列设计一对特异性引物和TAQMAN探针，探针5端标记的荧光报告基团为FAM，3端标记的淬灭基团为MGB，扩增片段长度为136BP，是SEQIDNO1序列第65879。

27、3位碱基之间核苷酸序列。引物和探针所扩增的序列见实施例1的猪附红细胞体G1全长序列方框中所示。所设计的引物和探针序列如下0075MF25GCTGCTGCAATTGGAAGAGTA3SEQIDNO2；0076MR25TGATTTCTTCTGCAGAAACAGACT3SEQIDNO3；0077PROBE5FAMTTGATGGAATTGCACACAGA3MGBSEQIDNO4。00782实时荧光定量PCR检测方法的确定00791建立荧光定量PCR反应体系10PCRBUFFER2L，MGCL250MM12L，DNTP10MM05L，上、下游引物10MM各05L，探针10MM02L，TAQ酶5U/L02。

28、L，DNA模板1L，用灭菌双蒸水补齐20L。每个样品检测设置3个重复。00802荧光定量PCR反应条件PREPCRREAD，501MIN；95变性10MIN；95变性15S，60退火延伸1MIN，共40个循环；60延伸1MIN。00813荧光定量PCR标准曲线的绘制0082采用已获得的阳性重组质粒DNA做荧光定量标准品，测定浓度并换算成拷贝数/说明书CN104152537A6/9页8L后，10倍梯度稀释，以7个稀释度的质粒标准品建立标准曲线。00834荧光定量PCR检测根据标准曲线分析被检血样中的猪源附红细胞体浓度。00845结果显示，本发明建立的猪源附红细胞体实时荧光定量PCR方法检测质粒D。

29、NA拷贝数在102109范围内图3，从左到右依次为样品拷贝数109拷贝/L10拷贝/L，质粒拷贝数的对数与CT值呈良好的线性关系，扩增效率百分数达108429，相关系数R20993图4。0085实施例4猪源附红细胞体实时荧光定量PCR方法的特异性分析0086以不同病原微生物，包括刚地弓形虫TOXOPLASMAGONDIIRH株、田鼠巴贝斯虫BABESIAMICROTI、副猪嗜血杆菌HAEMOPHILUSPARASUIS、鸡毒支原体MYCOPLASMAGALLISEPTICUM、微小隐孢子虫CRYPTOSPORIDIUMPARVUM的DNA作为模板，同时设阴性对照和阳性对照，进行荧光定量PCR检。

30、测，其中阴性对照为灭菌双蒸水，阳性对照为实施例2构建的含猪附红细胞体G1基因的重组质粒DNA。结果显示只有阳性对照出现扩增曲线，其他均未出现扩增曲线图5，表明该方法特异性强。0087实施例5猪源附红细胞体实时荧光定量PCR方法的重复性分析0088对同一反应体系进行批间重复，每个样品重复3次，根据获得的CT值进行变异系数统计。结果，两组样品的变异系数分别为108和117，均低于5。表明误差小，扩增效率稳定表1。0089表100900091实施例6猪源附红细胞体实时荧光定量PCR检测试剂盒的组成及应用00921、试剂盒的组成0093将SEQIDNO4所示的探针、SEQIDNO2和SEQIDNO3所。

31、示的引物对、含有猪附红细胞体G1基因的阳性重组质粒标准品、荧光定量PCR反应缓冲液及聚合酶，装配成试剂盒，组装后置于合适条件保存。00942、本发明试剂盒的应用00951无菌采集病猪血液样品319份，加入抗凝剂柠檬酸葡萄糖ACIDCITRATEDEXTROSE，ACD，血液与抗凝剂的比例为11O，混匀，4保存。00962取500L抗凝血，用全血基因组DNA提取试剂盒提取猪血液样品基因组DNA，于20保存。00973用本发明试剂盒进行荧光定量PCR检测，将扩增曲线与根据猪附红细胞体G1基因阳性质粒10倍梯度稀释所作的标准曲线进行比较、判定。结果共检出猪源附红细胞体感染阳性样品45份，感染率为14。

32、11图6，经16SRRNA基因及RNASEPRNA序列分析证明其中34份为猪附红细胞体MSUIS，11份为小附红细胞体MPARVUM。说明书CN104152537A7/9页90098以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。0099序列表0100中国农业科学院上海兽医研究所0101猪源附红细胞体检测试剂盒及方法和应用010260103PATENTINVERSI。

33、ON3301041010510110106DNA0107MYCOPLASMASUIS010810109ATGACAATCCACAAAGTAGCAATCAATGGATTCGGAAGAATCGGAAGATTACTATTTAGA600110AATCTTCTTTCTTCTCAAGGAGTTCAAGTTGTAGCTGTTAATGACGTAGTTGACATTAAA1200111GTTCTTACTCACCTTTTGGTTTATGACAGTGCTCAAGGAAAACTAAAAGATTGAGAAGTA1800112AGTTGTGATTCAGAATACATAAGACTAAAGAATGTAAATACTGGAGAAG。

34、TTAGAGAAGTT2400113AGAGTTTTCAACTTCAATACTGAAAAGATTTATCACTGAGGTGAATTAGAAATTGATTGT3000114GTTGTTGAATGTTCAGGAAGATTCTTAACTAAGGAAGCAGTTAAGTGTCACCTTGATGCA3600115GGAGCTCAAAAAGTTCTTATTTCAGCTCCTGCAAAGGATGACACTAAGACAGTTGTTTAC4200116AACGTAAACCATACTCAAATTACCAGCTCAGACAATGTTATTTCAGGAGCTTCATGTACA4800117ACTAATGCACTAGC。

35、TCCTATCGTAAAAATTATTCACAGAAAATTTGGAATTAATTCTGGA5400118TTCATGACAACAGTTCATGCTTTCACTTCTGACCAAAGACTTCAAGACTCTCCTCACGCT6000119GACCTAAGAAGAGCTAGAGCAGCTGCTGGATCAATTATTCCTACAACTACCGGAGCAGCT6600120GCTGCAATTGGAAGAGTAATTCCAGAATTAAATGGAAAACTTGATGGAATTGCACACAGA7200121GTACCTGTATTGACTGGTTCTCTAGTTGACCTATGCCTAAAAATAA。

36、ATAAGTCTGTTTCT7800122GCAGAAGAAATCAATGAAGCAATTAAGGATGGAGAAAATGAAACCCTTGCTTATGTAGAA8400123GATCCAATCGTATCTGCTGACATTATTGGAGATACACATGGTTCTATTTTTGACTCATCT9000124CTAACTAAAGTATTGCCAACTGGAGAAGTTAAGTTGTATGCATGATATGACAACGAGTCT9600125TCTTATGTAAATCAACTTGCAAGAACTCTGAAATACTACATTTCTCTTTAA1011012620127210128DNA0129人。

37、工序列01300131MISC_FEATURE01321210133引物说明书CN104152537A8/9页10013420135GCTGCTGCAATTGGAAGAGTA21013630137240138DNA0139人工序列01400141MISC_FEATURE01421240143引物014430145TGATTTCTTCTGCAGAAACAGACT24014640147200148DNA0149人工序列01500151MISC_FEATURE01521200153探针015440155TTGATGGAATTGCACACAGA20015650157290158DNA0159人工序列01600161MISC_FEATURE01621290163引物016450165GCGGGATCCATGACAATCCACAAAGTAGC29016660167270168DNA0169人工序列01700171MISC_FEATURE0172127说明书CN104152537A109/9页110173引物017460175CGCCTGCAGTTAAAGAGAAATGTAGTA27说明书CN104152537A111/3页12图1图2图3说明书附图CN104152537A122/3页13图4图5说明书附图CN104152537A133/3页14图6说明书附图CN104152537A14。