一种那曲肝素钙的生产方法.pdf

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1、10申请公布号CN104072639A43申请公布日20141001CN104072639A21申请号201410340558422申请日20140716C08B37/1020060171申请人南京健友生化制药股份有限公司地址210061江苏省南京市浦口高新区学府路28号72发明人唐咏群黄锡伟段艳冰娄媛媛刘玉辉74专利代理机构北京同辉知识产权代理事务所普通合伙11357代理人刘洪勋54发明名称一种那曲肝素钙的生产方法57摘要本发明公开了一种那曲肝素钙的生产方法，使用肝素钠为原料，在特定的工艺参数下通过降解、还原、乙醇沉淀离子交换树脂转钙氧化过滤沉淀脱水得到那曲肝素钙。氧化除菌过滤沉淀脱水实现了。

2、“一锅煮”的工艺，在操作上实现了简化，此方法相比已公开的方法从肝素钠制备那曲肝素钙工艺步骤更短，操作上更简便，转钙更彻底，收率更高。51INTCL权利要求书1页说明书6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页10申请公布号CN104072639ACN104072639A1/1页21一种那曲肝素钙的生产方法，其特征在于包括如下步骤1肝素钠溶解在纯化水中调节溶液PH至2701，加入亚硝酸钠252条件下搅拌34H，得到降解液，再调节降解液PH至95100加入硼氢化钠搅拌15H，调节溶液PH至3501搅拌20MIN，然后调节溶液PH至7375，紫外灯照射溶液2025M。

3、IN，乙醇沉淀，测试沉淀物分子量及分布；2将上述沉淀物加入纯化水溶解再加入阴离子交换树脂吸附，配制与树脂同体积的氯化钙溶液加入树脂中洗涤，同条件洗涤2次，30MIN沥干洗涤液,合并洗拓液在1520下搅拌510MIN，加入乙醇再搅拌510MIN，沉淀静置8H，检测沉淀物钙离子含量；3将上述沉淀物用纯化水溶解，加入氯化钙固体，氢氧化钙溶液调节PH至108110，302下加入过氧化氢氧化，维持PH在105110氧化4H，用盐酸调节PH至6065；4将045UM及02UM除菌过滤膜串联，将反应液通过该串联的过滤膜过滤，滤液用20倍的乙醇沉淀，静置8H，真空抽去上清液，加入乙醇脱水搅拌使之松散成细颗粒状。

4、静置1H，真空抽去上清液，相同的操作重复四次，离心脱水真空干燥得到那曲肝素钙。2根据权利要求1所述的那曲肝素钙的生产方法，其特征在于步骤1中肝素钠和纯化水投料比W/V为108510，肝素钠和亚硝酸钠的投料比W/W为1002030，亚硝酸钠和硼氢化钠的投料比W/W为100305，亚硝酸钠反应时体系温度维持在252，4MOL/L盐酸调节PH2701，5MOL/L氢氧化钠调节溶液PH至90105，254NM紫外灯置于降解后的溶液中进行灭菌，乙醇沉淀时，加入溶液体积和乙醇体积V/V为100812。3根据权利要求1所述的那曲肝素钙的生产方法，其特征在于步骤2中肝素钠和纯化水投料比W/V为108510，肝。

5、素钠和阴离子交换树脂投料比W/V为104555，氯化钙的浓度为01MOL/L，同条件洗涤2次，每搅拌1H后排出，30MIN沥干洗涤液,合并洗拓液1520搅拌510MIN，加入乙醇再搅拌510MIN，沉淀静置8H以上弃去上清液，洗拓液和沉淀乙醇的投料比V/V为101025。4根据权利要求1所述的那曲肝素钙的生产方法，其特征在于步骤3中肝素钠和纯化水投料比W/V为103555，溶液体积和氯化钙的投料比W/V为1000820，调节溶液PH的氢氧化钙为饱和溶液，溶液总体积和过氧化氢投料比V/V为1000815，所用的过氧化氢浓度为30。5根据权利要求1所述的那曲肝素钙的生产方法，其特征在于步骤4中用纯。

6、化水冲洗045UM滤膜和02UM滤膜至中性，将045UM及02UM的除菌过滤膜串联，将上述反应液通过该串联的过滤膜过滤，用滤液体积20倍体积的乙醇来沉淀滤液，用来脱水的乙醇和沉淀的乙醇投料比V/V为030510。权利要求书CN104072639A1/6页3一种那曲肝素钙的生产方法技术领域0001本发明涉及生物医药领域，特别是一种那曲肝素钙的生产方法。背景技术0002肝素钠HEPARINSODIUM是粘多糖硫酸酯类抗凝血药。肝素钠是由猪或牛的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属粘多糖类物质。在体内外均具有抗凝血作用，是目前主流的抗凝血药品。但是普通肝素的生物利用度低，副作用大，后来人们发现肝素。

7、钠裂解获取的硫酸氨基葡聚糖片段的钠盐，平均分子量为40006000道尔顿，称为低分子肝素钠。低分子肝素钠注射液和肝素钠注射液一样属于抗凝血酶AT依赖性凝血酶抑制剂。但与肝素钠注射液相比，具有半衰期较长、抗血栓效果好、出血倾向较弱、给药方便，但价格比较贵。普通的肝素产品都是钠盐型,与钙盐型相比,后者更具有皮下注射时局部血肿现象减少和疼痛状况明显改善等优点,故目前肝素产品更倾向于制成钙盐型。那曲肝素钙具有预防和治疗静脉血栓栓塞性疾病，特别是预防普通外科手术或骨科手术的血栓栓塞性疾病，同时在血液透析中预防体外循环中的血凝块形成。0003目前已有4篇专利公开了一种那曲肝素钙的制备工艺，目前均处在实质审。

8、查阶段。专利CN103204958A公开了一种低乙醇残留的那曲肝素钙的生产工艺，此专利着重讲述了在制备那曲肝素钙后，怎样用乙醇进行沉淀和脱水，得到乙醇含量05的那曲肝素钙。但是从专利对于怎样从肝素钠制备出那曲肝素钙的过程没有进行详细描述。专利CN103275246A以肝素钠粗品为原料，经木瓜蛋白酶、核糖核酸酶II酶解，提纯得到肝素钠精品，将其加入到冰醋酸缓冲溶液中，在一定温度和酸性条件下与亚硝酸盐反应，再经还原、紫外照射、氧化、钙置换得到那曲肝素钙粗品，将其经纳滤、超滤精制后，进行冻干处理，得到那曲肝素钙精品。专利CN103382232A通过将肝素钠原料在醋酸的酸性条件下用亚硝酸钠还原、硼氢化。

9、钠还原、乙醇重结晶得到低分子肝素钠、氯化钙转钙，乙醇重结晶、交换柱层析、洗拓液乙醇沉淀、过滤冻干得到那曲肝素钙。专利CN103408676A通过将肝素钠原料溶解在纯化水中，在一定温度和PH值条件下，加入亚硝酸钠进行降解，硼氢化钠还原，乙醇沉淀得到低分子肝素钠，此低分子肝素钠再经过双氧水氧化过滤器过滤阴离子交换柱洗拓洗拓液再用乙醇沉淀，沉淀物再用双氧水氧化氧化反应液再用乙醇沉淀得到那曲肝素钙粗品，此那曲肝素钙粗品依次用1000D超滤膜超滤和除菌过滤后得到那曲肝素钙精品。专利CN103204958A主要侧重是制备那曲肝素钙后如何通过乙醇洗脱得到低乙醇参量的那曲肝素钙，并没有详细阐明如何从肝素钠制备。

10、那曲肝素钙的工艺，和本文所要阐述的工艺过程不相同。专利CN103275246A、专利CN103382232A和专利103408676A均通过传统的降解还原方法得到低分子肝素钠，其中专利CN103275246A在得到那曲肝素钙后需要经过纳滤、超滤精制、冻干处理得到那曲肝素钙精品，专利CN103382232A将转钙和交换柱层析分开进行，增加了操作上的繁琐，同时那曲肝素钙也是经过冻干得到精品，增加了仪器设备的需求，专利103408676A经过两次过氧化氢氧化两次过滤阴离子交换柱转钙1000D超滤膜超滤、冻干得到那曲肝素钙精品，同样工艺复杂，操作上繁复，需要冻干机设备。说明书CN104072639A2。

11、/6页4发明内容0004本发明的目的是在现有技术的基础上，使用肝素钠为原料，通过降解、还原、乙醇沉淀、离子交换树脂转钙、氧化、过滤沉淀脱水得到那曲肝素钙。此方法相比已公开的方法从肝素钠制备那曲肝素钙工艺步骤更短，操作上更简便，转钙更彻底，收率更高，克服了目前生产那曲肝素钙存在的工艺路线较长，操作繁琐，依赖冻干机的问题。0005本发明的目的可以通过以下措施达到一种制备那曲肝素钙的工艺，其包括如下步骤00061低分子肝素钠的制备0007取肝素钠加入纯化水溶解，调节溶液PH为2701，加入亚硝酸钠，保持温度在252搅拌34H，得到降解液，再调节降解液PH至95100，加入硼氢化钠搅拌15H，盐酸调节。

12、溶液PH至3501搅拌20MIN。氢氧化钠调节溶液PH为7375，254NM紫外灯光照射降解液2025MIN，加入乙醇沉淀静置8H以上弃去上清液，测试样品分子量及分布。00082阴离子树脂转钙0009将上述湿固体加入纯化水溶解，再加入阴离子交换树脂吸附，吸附时间6H，配制与树脂同体积的氯化钙溶液加入树脂中洗涤，同条件洗涤2次，每搅拌1H后排出，30MIN沥干洗涤液，合并洗拓液在1520下搅拌510MIN，加入乙醇再搅拌510MIN，沉淀静置8H以上弃去上清液，检测沉淀物钙离子含量。00103氧化反应0011将上述沉淀物用纯化水溶解，加入氯化钙固体，氢氧化钙溶液调节PH至108110，302下加。

13、入过氧化氢氧化，维持PH在105110氧化4H，用盐酸调节PH为6065。00124过滤、沉淀和脱水0013将045UM及02UM除菌过滤膜串联，将上述反应液通过该串联的过滤膜过滤，滤液用20倍的乙醇沉淀，静置8H以上，真空抽去上清液，加入乙醇脱水，搅拌使之松散成细颗粒状，静置1H，真空抽去上清液，相同的操作重复四次，沉淀物离心脱水，真空干燥箱6065干燥5056H得到那曲肝素钙。0014在步骤1中肝素钠和纯化水投料比W/V为108510，优选为109295。肝素钠和亚硝酸钠的投料比W/W为1002030，优选为1002530。亚硝酸钠和硼氢化钠的投料比W/W为100305，优选为100350。

14、42。亚硝酸钠反应时体系温度维持在252，4MOL/L盐酸调节PH为2701，5MOL/L氢氧化钠调节溶液PH至90105。254NM紫外灯置于降解后的溶液中进行灭菌，加入溶液体积和乙醇体积V/V为100812，优选0911来沉淀，测试样品分子量及分布。0015在步骤2中低分子肝素钠粗品沉淀物和纯化水投料比W/V为108510，优选为109295。肝素钠和阴离子交换树脂投料比W/V为104555，优选为104550。氯化钙的浓度为01MOL/L吸附，同条件洗涤2次，每搅拌1H后排出，30MIN沥干洗涤液，合并洗拓液1520搅拌510MIN，加入乙醇再搅拌510MIN，沉淀静置8H以上弃去上清液。

15、。洗拓液和沉淀乙醇的投料比V/V为101025，优选为101520，检测沉淀物钙离子含量。说明书CN104072639A3/6页50016在步骤3中肝素钠和纯化水投料比W/V为103555，优选为104050。溶液体积和氯化钙的投料比W/V为1000820，优选为1001520。调节溶液PH的氢氧化钙为饱和溶液。30的过氧化氢进行氧化，溶液总体积和过氧化氢投料比V/V为1000815，优选为1001215。0017在步骤4中用纯化水冲洗045UM滤膜和02UM滤膜至中性，将045UM及02UM的除菌过滤膜串联，将上述反应液通过该串联的过滤膜过滤，用20倍滤液体积的乙醇来沉淀滤液，用来脱水的乙醇。

16、和沉淀的乙醇投料比V/V为030510，优选为0404510。0018本发明是针对现有的那曲肝素钙生产工艺进行优化和改进。使用肝素钠为原料，先通过降解、还原、乙醇沉淀得到低分子肝素钠粗品，低分子肝素钠粗品通过阴离子交换树脂吸附，然后用氯化钙溶液洗拓，经过两次洗拓，钙离子含量可以达到10左右符合要求。乙醇沉淀洗拓液，沉淀物加入纯化水溶解，过氧化氢氧化、滤液除菌过滤、沉淀、干燥得到那曲肝素钙。氧化、除菌过滤、沉淀脱水实现了“一锅煮”的工艺，在操作上实现了简化，节省了时间和人力成本，该工艺在现有的技术基础上开发出了一条新的制备那曲肝素钙的方法，且在本公司实现了那曲肝素钙的工业化生产。具体实施方式00。

17、19为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。0020实施例10021加入45L纯化水和肝素钠5KG至降解罐内，搅拌使其完全溶解，用4MOL/L盐酸调节罐内溶液PH为27，称取0135KG亚硝酸钠加入烧杯中，向烧杯中加入1350ML纯化水，搅拌溶解后，加入降解罐内，维持罐内溶液PH在2701，252下搅拌反应36H。用5MOL/L氢氧化钠溶液调节体系PH值为96，加入0054KG硼氢化钠至降解罐内，搅拌反应18H，再用4MOL/L盐酸调节溶液PH为35，搅拌20MIN，再用5MOL/L氢氧化钠溶液调节体系PH至73，用254NM的紫外灯照射。

18、降解液20MIN，溶液体积为48L，所以将48L乙醇倒入降解罐内，1520搅拌510MIN，停止搅拌静置10H,弃去上清液，测试样品分子量及分布分子量4295应36004500，2000部分为149应250，20008000部分为765应650850，20004000部分为423应350550。0022加入45L纯化水和25L阴离子交换树脂至上述有沉淀物的罐内，搅拌6H，使树脂吸附充分，将02775KG氯化钙溶解在25L纯化水中得到01氯化钙溶液加入树脂中搅拌1H后排出，再将02775KG氯化钙溶解在25L纯化水中得到01氯化钙溶液加入树脂中搅拌1H后排出，合并两次的排出液并30MIN沥干洗涤。

19、液，洗涤液共30L，1520搅拌510MIN，加入45L乙醇再搅拌510MIN，沉淀静置8H以上弃去上清液，检测沉淀物钙离子含量为107应95115。0023将上述沉淀物用20L纯化水溶解，加入0375KG氯化钙固体，搅拌使氯化钙完全溶解，氢氧化钙饱和溶液调节PH至108110，溶液总体积为25L，302下加入025L30过氧化氢氧化，维持体系PH在105110，氧化反应4H，再用4MOL/L盐酸调节PH为63。0024用纯化水冲洗045UM滤膜和02UM滤膜至中性，将045UM及02UM的除菌过说明书CN104072639A4/6页6滤膜串联，将上述反应液通过该串联的过滤膜过滤，滤液总体积2。

20、5L，加入50L乙醇搅拌1015MIN沉淀静置10H，真空抽去上清液，加入20L乙醇脱水，搅拌使之松散成细颗粒状静置1H，真空抽去上清液，相同的操作重复四次，沉淀物离心脱水，真空干燥箱6065干燥5056H得到那曲肝素钙3918KG。0025实施例20026加入425L纯化水和肝素钠5KG至降解罐内，搅拌使其完全溶解，用4MOL/L盐酸调节罐内溶液PH为26，称取010KG亚硝酸钠加入烧杯中，向烧杯中加入1000ML纯化水，搅拌溶解后，加入降解罐内，维持罐内溶液PH在2701，252下搅拌反应34H。用5MOL/L氢氧化钠溶液调节体系PH为95，加入003KG硼氢化钠至降解罐内，搅拌反应17H。

21、，再用4MOL/L盐酸调节溶液PH为34，搅拌20MIN，再用5MOL/L氢氧化钠溶液调节体系PH至74，用254NM的紫外灯照射降解液20MIN，溶液体积为448L，所以将448L乙醇倒入降解罐内，1520搅拌510MIN，停止搅拌静置10H，弃去上清液，测试样品分子量及分布分子量4312应36004500，2000部分为144应250，20008000部分为764应650850，20004000部分为425应350550。0027加入425L纯化水和225L阴离子交换树脂至上述有沉淀物的罐内，搅拌6H，使树脂吸附充分，将02498KG氯化钙溶解在225L纯化水中得到01氯化钙溶液加入树脂中。

22、搅拌1H后排出，再将02498KG氯化钙溶解在225L纯化水中得到01氯化钙溶液加入树脂中搅拌1H后排出，合并两次的排出液并30MIN沥干洗涤液，洗涤液共27L，1520搅拌510MIN，加入27L乙醇再搅拌510MIN，沉淀静置8H以上弃去上清液，检测沉淀物钙离子含量为105应95115。0028将上述沉淀物用175L纯化水溶解，加入0216KG氯化钙固体，搅拌使氯化钙完全溶解，氢氧化钙饱和溶液调节PH至108110，溶液总体积为2185L，302下加入0175L30过氧化氢氧化，维持PH在105110，氧化反应4H，再用4MOL/L盐酸调节PH为60。0029用纯化水冲洗045UM滤膜和0。

23、2UM滤膜至中性，将045UM及02UM的除菌过滤膜串联，将上述反应液通过该串联的过滤膜过滤，滤液总体积2185L，加入437L乙醇搅拌1015MIN沉淀静置12H，真空抽去上清液，加入1311L乙醇脱水，搅拌使之松散成细颗粒状静置1H，真空抽去上清液，相同的操作重复四次，沉淀物离心脱水，真空干燥箱6065干燥5056H得到那曲肝素钙3901KG。0030实施例30031加入50L纯化水和肝素钠5KG至降解罐内，搅拌使其完全溶解，用4MOL/L盐酸调节罐内溶液PH为28，称取015KG亚硝酸钠加入烧杯中，向烧杯中加入1500ML纯化水，搅拌溶解后，加入降解罐内，维持罐内溶液PH在2701，25。

24、2下搅拌反应34H。用5MOL/L氢氧化钠溶液调节体系PH值为105，加入0075KG硼氢化钠至降解罐内，搅拌反应16H，再用4MOL/L盐酸调节溶液PH为36，搅拌20MIN，再用5MOL/L氢氧化钠溶液调节体系PH为75，用254NM的紫外灯照射降解液20MIN，溶液体积为536L，所以将536L乙醇倒入降解罐内，1520下搅拌510MIN，停止搅拌静置10H,弃去上清液，测试样品分子量及分布分子量4378应36004500，2000部分为142应250，20008000部分为764应650850，20004000部分为424应350550。说明书CN104072639A5/6页70032。

25、加入55L纯化水和275L阴离子交换树脂至上述有沉淀物的罐内，搅拌6H，使树脂吸附充分，将03053KG氯化钙溶解在275L纯化水中得到01氯化钙溶液加入树脂中搅拌1H后排出，再将03053KG氯化钙溶解在275L纯化水中得到01氯化钙溶液加入树脂中搅拌1H后排出，合并两次的排出液并30MIN沥干洗涤液,洗涤液共33L，1520搅拌510MIN，加入495L乙醇再搅拌510MIN，沉淀静置8H以上弃去上清液，检测沉淀物钙离子含量为108应95115。0033将上述沉淀物用275L纯化水溶解，加入066KG氯化钙固体，搅拌使氯化钙完全溶解，氢氧化钙饱和溶液调节PH为108110，302，溶液总体。

26、积为3438L，302下加入052L30过氧化氢氧化，维持PH在105110，氧化反应4H，再用4MOL/L盐酸调节PH在65。0034用纯化水冲洗045UM滤膜和02UM滤膜至中性，将045UM及02UM的除菌过滤膜串联，将上述反应液通过该串联的过滤膜过滤，滤液总体积3438L，加入6876L乙醇搅拌1015MIN沉淀静置10H，真空抽去上清液，加入3438L乙醇脱水，搅拌使之松散成细颗粒状静置1H，真空抽去上清液，相同的操作重复四次，沉淀物离心脱水，真空干燥箱6065干燥5056H得到那曲肝素钙3873KG。0035对比例10036按专利CN103408676A中实施例1中的技术方案制备那。

27、曲肝素钙，即将3KG肝素钠加入15L24L纯净水搅拌溶解后，用盐酸调节溶液的PH23，再加入60G亚硝酸钠后，在1030下搅拌反应25H后在210下静置2024H；在制得的降解液中用氢氧化钠溶液调节溶液的PH911后，加入18G硼氢化钠还原1016H，反应完毕后用氢氧化钠调节溶液的PH6570后得到还原液；在还原液中加入95体积浓度的乙醇进行沉淀后收集沉淀物；在收集的沉淀物中加入纯净水搅拌溶解后，加入0210质量浓度的双氧水在2535下氧化1024H后加入95体积浓度的乙醇沉淀，收集沉底物；在收集的沉淀物中加入纯净水搅拌溶解后用045UM的过滤器过滤，再将滤液用离子交换柱进行吸附后用洗脱液洗脱。

28、，再将收集的洗脱液加入95体积浓度的乙醇沉淀后，收集沉淀物；在收集的沉淀物中加入纯净水搅拌溶解后，加入0210质量浓度的双氧水在2535下氧化，氧化1024H后加入95体积浓度的乙醇进行沉淀，收集沉淀物得到达肝素钠粗品；将收集的那曲肝素钙粗品依次用1000D的超滤膜超滤和除菌处理后得到那曲肝素钙精品；将那曲肝素钙精品在45下冻干后得到那曲肝素钙精品2250克。0037试验例10038按欧洲药典EP70对实施例13提供的那曲肝素钙成品进行质量标准检测，将各指标检测结果记录在表1，同时为了与现有技术进行更好比对，也一并测试了对比例1中指的那曲肝素钙的相关指标。0039说明书CN104072639A。

29、6/6页800400041由上述对比可以看出，采用现有技术中的生产方法制得的那曲肝素钙，其沉淀物钙离子含量和抗XA效价等指标仅能满足欧洲药典的最低标准，即质量难以得到进一步提高。而本发明相对于现有技术转钙量更加完全，产品的抗栓性也有明显的提升。0042以上对本发明所提供的一种那曲肝素钙的生产方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰。这些改进和修饰也应当落入本发明权利要求的保护范围内。说明书CN104072639A。